luận văn: TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chia sẻ: Nguyễn Thị Bích Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

149
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: luận văn: TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2 1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2 1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3 1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5 1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10 1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16 1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16 1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23 2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao ............................................................................................... 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA............................................................................................................ 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu............................................................................. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52 3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59 KẾT LUẬN .................................................................................................. 59 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61 TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61 TIẾNG ANH ................................................................................................ 64 PHỤ LỤC .................................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea.. 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase ......................................................................................................... 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae........ 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). ............................................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT g Microgram l Microliter APS Ammonium persulphate Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulase cs Cộng sự EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker (thang protein chuẩn) MTK Môi trƣờng khoáng MW Molecular Weight OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane U Unit v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình. 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1. Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo. Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2
Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995). Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003), A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao. 1.2.2. Phân loại enzyme 1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et al., 2008). Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3
hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002). 1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3. Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002). Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4
peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61 không có intron. Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al., 1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002). 1.3. CẤU TRÚC Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008). 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng 44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5
chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ chủng A. niger (49%). Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa. Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và các vùng nối. 1.3.2. Cấu trúc không gian Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và 205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6
trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên (Hình 1.1). Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B). Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C). Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7
Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002) Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4- glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9