LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO HPLC

Chia sẻ: NGUYỄN VĂN QUÝ | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:50

Thêm vào BST

Báo xấu

2.120
lượt xem 734
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chrom atography) Phương pháp này ra đời từ năm 19671968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo m...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO HPLC

Phần ơ ở ý huyết I:C s l t H PLC à ữ ếtt tcủa chữ đầu ằng i ng l ch vi ắ 04 cái b tế Anh ủa ương c ph pháp ắc l ng ệu ăng s ký ỏ hi n cao i (H gh Peror ance qui C hr at aphy),r c a ọil f m Li d om ogr tướ ki g à phương pháp ắc l ng s ký ỏ cao ( i Pr áp H gh essur Li d e qui C hr at aphy) om ogr Phương pháp này a it ăm r đờ ừ n 1967 1968 r cơ tên sở phátti n cảitến ừ ương rể và i t ph pháp ắc cộtcổ s ký đi n i n ể .H ệ nay ương ph pháp PLC H ngày càng rể phátti n và ện ihoá hi đạ cao ờ ự rể nhanh nh s phátti n chóng ủa c ngành ế ạo áy ch t m tch H ệ nay áp ụng ất phân í . i n nó d r ớ tong ều l n r nhi nghành ểm ki nghi m c ệtl ứng ệ đặ bi à dụng cho nghành ểm ki nghi m Thuốc nó ện à ệ .Và hi l công ụ c ực r c đắ l tong phân í các huốc a hành ần tch t đ t ph
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t K ệ :S ký ỏ hi n 1 háini m ắc l ng ệu ăng l m ộtphương cao à pháp chi t a ách r đ pha ng à tong ó độ l châï ỏng pha ĩ chứa r tl và tnh tong cộtl ất ắn ã c à ch r đ đượ phân a ướidạng i u chi d tể phân ặc ột ho m chấtl ng ủ ên ộtchấtm ang ắn hay ộtchấtm ang ã ỏ ph l m r , m đ được ến ibằng i kếthoá ọc ớicác bi đổ lên h v nhóm ức ữu ơ ch h c . uá rnh ắc l ng ựa r cơ ế ấp ụ, Q tì s ký ỏ d tên ch h ph phân ố tao i b ,r đổ I hay on phân oạit l heo ch ỡ ây kí c (R phân ử t ). 2N guyên ắc ủa t c quá r nh ắc t ong ột: t ì s ký r c Pha ĩ l m ộtyếu ố tnh à t quan r ng ếtđịnh ản ấtcủa tọ quy b ch quá tì sắc l aisắc . rnh ký và ọ ký N ếu pha ĩ l chấthấp ụ hìt có ắc hấp ụ tnh à ph t a S ký ph pha t ận ặc hu ho pha o đả . ếu N pha ĩ l chấttao iI hìt có ắc tao ii tnh à r đổ on t a S ký r đổ on . N ếu pha ĩ l chấtLỏng hìt có ắc phân ố tnh à t a S ký b hay ắc s ký ết. chi
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t N ếu pha ĩ l G elt a S ắc G elhay ây tnh à hìt có ký R phân ử . t C ùng ớipha ĩ để ửa ảichấtphân í r khỏicột v tnh r r tch a ,chúng a ần m ộtpha üng t c có độ . N hư ậy ếu v n chúng a ạp ẫu t n m phân í gồm ỗn ợp ất tch h h ch phân í A, C .Vào ộtphân í , ếtquả tch B, . c tch k các ấtA, C . ẽ ch B, .S được ách a ỏinhau t r kh sau iqua ột. uyếtđịnh ệu ả khiđ c Q hi qu của ự ách ắc ở ây à ổng ợp s t s ký đ l t h các ương ác t t . C háútphán êch t A +B+C F1 F2 F3 Pha âäüng Pha énh t
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t Tổng ủa t ng ác c 03 ươ t này ẽ ếtđịnh ấtnào s quy ch được ửa ảir khỏicộttước i khil c ưu ữ r r r a r tên ự l gi tên cộtl nhỏ ất và ược ại. à nh (F1). ng l Đốivớim ỗichất, ự ưu ữ c nh ởi03 s l gi đượ quiđị b ự F2, . ong ó và gi r quyết l c F1, F3 Tr đ F1 F2 ữ vaitò định còn l yếu ố nh ưởng . F3 à t ả h không ớn l . Ở ây l l c ữ ấtphân í tên ột. l đ F1 à ự gi ch tch r c F2 à ự kéo ủa l c c pha ng ivớichấtphân í r khỏicột độ đố tch a . N hư ậy ớicác ấtkhác v v ch nhau hìF1 F2 à t và l khác nhau K ếtquả à , l các ấtkhác ch nhau ẽ s dichuyển tong ộtvớit c r c ố độ khác và ách a ỏinhau khi nhau t r kh r khỏicột. ư nh ướiđây a (nh hì d )
Phần ơ ở ý huyết: I:C s l t Phần i hoạ m nh quá rnh ách chấtA B tì t các và tong ộtt r c ách ắc s ký Pha động Thờigi an A B
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t Phân oạisắc : 3 l ký Theo ơ ế ách ắc ngườit phân oaüinhư c ch t s ký a l sau : 3. S ắc hấp ụ 1 ký ph : Q uá rnh ắc dựa r sự ấp ụ ạnh yếu tì s ký tên h ph m , khác nhau ủa c pha ĩ đốivớicác ấtt và ự ửa ải(phản ấp ụ ủa tnh ch an s r gi h ph )c độ để kéo ấtt r khỏicột. ự ách ộthỗn ợp ụ pha ng ch an a S t m h ph t ộc hu vào tnh ấtđộng ọc ủa ấthấp ụ ong r ng í ch h c ch ph .Tr tườ l ạinày 02 oạihấp ụ o có l ph : + ắc hấp ụ S ký ph pha huận P PLC ): t (N H Pha ĩ phân ực tnh c , độ không pha ng phân ực c . + ắc hấp ụ S ký đả ( H ph pha o R P PLC ): Pha ĩ không tnh phân cực pha ng , độ phân ực c . Loạisắc này c dụng ấtt ký đượ áp r hành để t công ách các ỗn h hợp các ấtcó í chấtgần ương ự ch tnh t t nhau t ộc oạikhông và hu l phân ực, c phân ực ếu c y hay r tung nh ư bì nh các t i t ốc ạ Viam n,hu h ệ ả đ .. nhi tgi m au .. ệ nay H i n chúng a ang ử ụng ỉ l ạisắc này à t đ s d ch có o ký m t . hôi
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t C hủ ếu ện y hi nay chúng a ử ụng ọaisắc hấp t s d l ký phụ đả (R ) pha o P Trong ược i n SP d để U khichúng a r cứu ộtcó t ta c gi tị t ng ng ư á r ươ ứ nh sau : L1 :R P Kí t ước ạtt ng ng ừ 10 18 ch h h ươ ứ t 5 µm L7 :R P Kí t ước ạtt ng ng ừ 10 8 ch h h ươ ứ t 5 µm L3 :Si60 ch hước ạtt ng ng ừ 10 Kí t h ươ ứ t 5 µm 2
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4 C ác il ng c r ng của ắc đồ đạ ượ đặ t ư s ký K ếtquả ủa c quá rnh ách ti t các ấtđược et or ch D ect pháthi n hành ắc đồ như nh r ệ ghit s ký hì tên
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t To ờigi l u ết :Th an ư ch tr2 t’r1 :Thờigi l u hực ất an ư t ch A tr1 t’r2 :Thờigi l u hực ất an ư t ch B tr1 :Thờigi l u ấtA an ư ch t’r1 tr2 :Thờigi l u ấtB an ư ch to t’r2
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t Từ t các hông ố ủa peak r đây nhi u il ng c s c các tên , ề đạ ượ đặ tưng ề ý huyếtđược a a r v lt đư r để dánh á ộtquá rnh ắc gi m tì s ký D ướiđây à ộtsố il ng hường . l m đạ ượ t tong hực ế dùng r t t và đổ đạ ượ này l i cho cách hay icác il ng t có ơ ü quá rnh tì phân tch ắc í s ký. 4. Thờigi l u hực ’ et i tm e 1 an ư t tr :R enton i Thờigi l u ủa ộtchấtl t ờigi tnh ừ ơm ẫu an ư c m à h an í t khib m vào ộtcho n ấtđó a ỏicộtđạtgi t ị ực i c đế khich r kh á r c đạ . Thờigi l u ủa ỗichấtl hằng nh các ấtkhác an ư c m à đị và ch nhau t hờigi l u ẽ hìt an ư s khác nhau r cùng ộtđi u ện ắc t ên m ề ki s ký đã ọn Vìvậy hờigi l u à il ng ch . t an ư l đạ ượ để pháthi n nh ệ đị í các ất tnh ch . Thờigi l u ụ huộc an ư ph t vào các ếu ố y t : + ản ấtsắc của B ch ký pha ĩtnh. + ản ất,hành ần,ốc ủa B ch t ph t độ c độ pha ng + ấu ạo bản ấtphân ử ủa ấtt C t và ch t c ch an + ong ộtsố r ng ợp hờigi l u Tr m t ườ h t an ư còn ụ huộc ph t vào pH ủa c độ pha ng .
Phần ơ ở ý I:C s l t ết huy Tr ong ộtphép m phân í nếu rnhỏ tch t quá hìsự ách t t kém còn ếu , n r quá ớn hìpeak ị t l t b doãng độ ặp ạicủa và l l Peak ấtkém t ời r ,h gi phân í r tdàiđồng hờikéo heo ều ấn an tch ấ t t nhi v đề khác ư nh hao ốn t dung ôihoá ất nh m , ch ,độ chí xác ủa c phép phân í kém . tch Để hay it ờigi l u t đổ h an ư chúng a ựa t d vào các ếu ố r đã rnh y t tên tì bày . 4. H ệ ố 2 s dung ượng ’:C apaciy l K t Fact or H ệ ố s dung ượng ủa ộtchấtcho ếtkhả ăng l c m bi n phân ố ủa b c chấtđó r tong haipha ộng ớisức ứa ộtt c à ỷ ố ữa c v ch c ứ l t s gi l ng ấtt tong ượ ch an r pha ĩ và ượng ấtt tong tnh l ch an r độ ở pha ng tong hờiđi m r t ể cân ằng b . K’= (t 0) 0 R t /t N ếu ỏ hìt ũng ỏ sự ách K’ nh t R c nh và t kém ếu .N K’ l n hìPeak ị ớ t b doãng ong hực ế t l t iưu .Tr t t K’ ừ 15 à ố .
Phần ơ ở ý I:C s l huy t ết l α: 4. Độ ọn ọc 3 ch ch l α Độ ọn ọc cho ếthi u ả ách ủa ệ hống ắc bi ệ qu t c h t s ký khi02 ấtA B K’ K’ khác nhau hìm ới , ch , có A và B t có ả ăng ách , ức ách ểu hị ọn ọc kh n t .m độ t bi t ở Độ ch l α . α = K’ A B /K’ V ớiđi u ện B > A ề ki K’ K’ v α ới càng khác t ả ăng ách 1 hìkh n t càng õ àng r r α= 02 1. α= 16 1. α= 20 1.
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4. S ố a ý huyết : 2 đĩ l t N S ố a ý huyếtl đạil ng ểu hị ệu ăng ủa ộttong ột đĩ l t à ượ bi t hi n c c r m đi u ện ắc nhấtđịnh M ỗiđĩa ý huyếttong ộtsăc ề ki s ký . lt r c ký gi ng ư l m ộtl p ố nh à ớ pha ĩ có ều tnh chi cao à Tấtnhi l p l H , ên ớ này tnh ấtđộng t c à ộtkhu ực ủa ệ có í ch ứ l m v c h phân ách à t m tong ó ộtcân ằng ệtđộng học c hi tl p ữa ồì r đ m b nhi đượ t ế ậ gi n ng độ rtung nh ủa ấtt tong bì c ch an r pha ĩ và độ . tnh pha ng B ề dày ụ huộc H ph t vào ều ếu ố nhi y t : + Đường nh độ ấp ụ ủa ạtpha ĩ kí và h ph c h tnh + ốc độ ớt(độ T độ và nh phân ực của c ) độ pha ng + ệ ố H s khuyếch án ủa t c các ất r ch tong ột. c Vìvậy ớim ộtđi u ên ắc xác nh hìchi u v ề ki s ký đị t ề cao H cũng ằng nh ivớim ộtchấtphân í số a ý huyếtcủa h đị đố tch và đĩ l t cộtcũng c đượ xác nh. đị
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4. S ố a ý huyết : 2 đĩ l t N S ố a ý huyếtN c í t đĩ l t đượ tnh heo công hức t sau : 5, (t N = 54 R /W ) 2 0, 5 Tr đ : t ong ó R :Thờigi an ưu ủa ấtphân l c ch tch í . 0,5 ộng ạiđi m 2 ủa W :Độ r t ể 1/ c Peak . ong hực ế ằm r Tr t t Nn tong ảng kho đế 5500 à ừa 2500 n l v đủ .
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4. Độ 3 phân ảiR esol i ) gi :(R uton Độ phân ảil đạil ng ểu hị ách ủa gi à ượ bi t độ t c các ấtr khỏi ch a nhau tên ộtđi u ện ắc ã r m ề ki s ký đ cho.Độ phân ảicủa gi 02 Peak ạnh c nhau ảiđược í t ph tnh heo công hức t sau : R = ’ B ’ A) w a + B) 2(tR tR /( w Tr ong hực ế ếu t t n các Peak đố hìđộ phân ải cân i(G ass)t gi t it ểu Peak ách à 0 Tr ố hi để 02 t l R =1. . ong phép nh ượng =1, đị l R 5 l phù ợp à h + ếu ỏ hìcác N R nh t Peak ưa ách ẳn vi c í t ch t h , ệ tnh oán ện í di tch Peak ẽ chí xác l này ảitm s không nh ,úc ph ì cách ăng heo t Rt 03 cách sau: * Làm hay iK’bằng t đổ cách hay il c ửa ảicủa t đổ ự r gi pha động đổ độ phân ực ếu à P H PLC t (Thay i c n l R ,hay ôí ường đ ic độ on ếu à E H PLC .. i n l I ..) * Làm ăng ố a ý huyếtcủa ộtbằng t s đĩ l t c cách dùng ộtdài c hơn ặc ộtcó ch hước ỏ ơn ho c kí t nh h .
Phần ơ ở ý I:C s l t ết huy 4. Độ 3 phân ảiR esol i ) gi :(R uton t độ ch l α * Làm ăng ọn ọc bằng cách dùng ộtkhác c phù ợp h hơn ớiquá rnh ách ặc hay it v tì t ho t đổ hành ần độ . ph pha ng N ếu ớn + R l quá hìt ờigi phân í sẽ âu,ốn ều t h an tch l t nhi pha động độ ạy ẽ , nh s kém .Để ắc ục t có hể hay ihệ kh ph a t t đổ pha động hay dùng ương rnh r entdung ôi.Tuy ên r ch tì G adi m nhi tong quá rnh ạy ắc dùng ương rnh tì ch s ký ch tì dung ôit ộtsố m hìm pha động t ệ hay isẽ có ỷ l t đổ kéo heo ự hay iđường ền àm nh t s t đổ n l ả hưởng ấtl n n hờigi l u di n í của r ớ đế t an ư và ệ tch các Peak a t phân tch í . Tr ong hực ế t t nên ạn ế ử ụng ương rnh r ent h ch s d ch tì G adi dung ôim à ủ ếu à m ch y l chúng a ảitm c ệ t ph ì đượ h pha ng ửa độ r gi iphù ợp,đáp ng ả h ứ các yêu ầu r c tong quá rnh tì phân í . tch
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4. H ệ ố 4 s không ixứng :(Taii f or đố T lng act ) H ệ ố s không ixứng cho ếtm ức đố T bi độ không ixứng ủa đố c Peak r sắc đồ hu c tên ký t đượ . T c í bằng ỷ ố ộng ủa nửa đượ tnh t s độ r c 02 Peak ạiđi m t ể 10 ề cao 1/ chi u Peak : T = a/b a b Peak ạng ôï ứng nh auss r t ực ế d đ ix hì G tên h t khó tđược ậy đạ vìv phảiquan âm n ệ ố t đế h s không ixứng đố T,
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 4. ệ ố 4H s không ixứng :(Taii f or đố T lng act ) ≤ 2. t * KhiT 5 hìphép nh ượng c ấp ận đị l đượ ch nh * KhiT 2. t đi m ốicủa > 5 hì ể cu Peak ấtkhó r xác định vìvậy , phép nh ượng ần ảit đị l đổ c ph hay icác đi u ện ắc để àm ề ki s ký l cho cân ihơn heo Peack đố t các cách sau : + Làm ảm hể í chếtt c à oaün ốit ột gi t tch ứ l đ n ừ c đêï D et or. n ect + đổ hành ần Thay it độ sao ph pha ng cho ả ăng kh n r a ảit ng ên ử gi ă l + i m ớtl ng ẫu a G ả b ượ m đư vào ột ằng c b cách pha oãng ẫu l m hay ảm hể í têm ẫu gi t tch i m .
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t 5 Phân oạisắc và ng ụng l ký ứ d : + Theo ơ ế a ách ủa ắc , ườit phân a c ch chi t c s ký ng a r các oạisau l đây : S ắc hấp ụ P H PLC R P PLC ) ắc phân ố sắc ký ph (N và H ;s ký b ký ết(LLC ) ắc tao ii (I H PLC ); ắc r phân chi ;s ký r đổ on E s ký ây t sắc gel(I PLC ). hưng hực ế ên ử ký G H N t t hi nay chúng a t hi n ỉ ang ng ụng ắc hấp ụ ệ ch đ ứ d s ký ph vào phân í m ẫu tch . 5. S ắc hấp ụ 1 ký ph : * Q uá rnh ắc dựa r sự ấp ụ ạnh ếu tì s ký tên h ph m y khác nhau ủa c pha ĩ đốivớicác ấtt và ự ửa ải( ản ấp ụ)cuả tnh ch an s r gi ph h ph độ để kéo ấtt r khỏicột. ự ách ộthỗn ợp ụ pha ng ch an a S t m h ph t ộc hu vào í chấtđộng ọc ủa ấthấp ụ Tr tnh h c ch ph . ong oạinày l có 02 ểu ấp ụ: ki h ph
Phần ơ ở ý huyết I:C s l t + ắc hấp ụ S ký ph pha huận N P PLC ) t ( H :Pha ĩ phân ực pha ng tnh c , độ không phân ực c . + ắc hấp ụ S ký đả (R H ph pha o P PLC ) :Pha ĩ không tnh phân ực độ phân ực c pha ng c . Loạisắc này ký được dụng ấtr ng ãi áp r ộ r ,hành t để t công ách các ỗn ợp h h các ấtcó í ch tnh chấtgần ương ự t t nhau t ộc oạikhông và hu l phân cực phân ực ếu , c y t ung nh ư hay r bì nh các t i Viam n, các huốc ạ ệtgi m au ... t h hi ả đ ....