Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------

LÊ THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO

PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI

KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------

LÊ THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO

PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI

KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy ở

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời

gian học tập tại Viện.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng người thầy

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

và thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên

làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện

Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp

đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua.

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ

thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ

theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Lê Thị Lý

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 11

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 13

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn ............................................................................... 13

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sắn ................................................................. 13

1.1.2. Vai trò của cây sắn ...................................................................................... 14

1.1.2.1. Vai trò của cây sắn đối với thế giới ............................................ 14

1.1.2.2. Vai trò của cây sắn đối với Việt Nam ......................................... 19

1.1.3. Giống sắn TMS 60444 ................................................................................. 21

1.2. Yếu tố phiên mã ................................................................................................. 21

1.2.1. Ứng dụng của yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử.......................... 21

1.2.2. Yếu tố phiên mã Dof1 ................................................................................. 23

1.3. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens .............................................. 26

1.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp ............................................................... 26

1.3.2. Đặc điểm cấu trúc của vi khuẩn Agrobacterium ........................................ 27

1.4. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở sắn ............................................................ 33

1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn trên thế giới .................................... 33

1.4.2. Tình hình chuyển gen sắn ở Việt Nam ....................................................... 36

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 39

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 39

2.1.1. Mẫu thực vật ............................................................................................... 39

2.1.2. Vi khuẩn và các vector................................................................................ 39

2.1.3. Môi trường nghiên cứu ............................................................................... 41

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 42

2.2.1. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa ................................................. 42

2.2.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa............................. 44

2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch khuẩn và biến nạp ....................................... 44

2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime đến khả năng loại

khuẩn thừa và tái sinh cây từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp ............................ 45

2.2.2.3. Nghiên cứu nồng độ chất chọn lọc thực vật hygromycin thích hợp

để chọn lọc mô được chuyển gen ..................................................................... 45

2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi

hóa sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen .................................................. 46

2.2.2.5. Phương pháp xác định sự có mặt của gen Dof1 trong cây sau chuyển

gen ..................................................................................................................... 46

2.2.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 trong điều

kiện nhà lưới ......................................................................................................... 48

2.2.3.1. Phương pháp đưa cây ra đất và chăm sóc cây trong nhà lưới .... 48

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính nông sinh học của cây sắn

trồng ngoài đồng ruộng .................................................................................... 48

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 49

3.1. Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 .......................................... 49

3.2. Kết quả chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 ................................ 52

3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen

Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 ................................................................... 53

3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp

nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444 .................................................... 55

3.2.3. Kết quả nghiên cứu hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của

nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen ...................... 57

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.4. Kết quả khảo sát hiệu quả gây chết của chất chọn lọc hygromycin ........... 60

3.2.5. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen sau biến nạp ......................... 62

3.2.6. Kết quả sàng lọc và phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong

cây sau chuyển gen ............................................................................................... 65

3.3. Kết quả đưa cây ra vườn ươm và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây

chuyển gen Dof1 ....................................................................................................... 70

3.3.1. Kết quả đưa cây ra vườn ươm ..................................................................... 70

3.3.2. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế

hệ T0 sau 3 tháng trồng ra vườn ươm ................................................................... 72

3.3.3. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế

hệ T0 sau 6 tháng trồng ra nhà lưới. ...................................................................... 74

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 78

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 80

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Thành phần hóa học của sắn và các sản phẩm sơ chế từ sắn so với các loại

lương thực khác [12] ................................................................................................. 17

Bảng 2: Năng lượng cung cấp trực tiếp cho con người ở vùng nhiệt đới [12]. ........ 18

Bảng 3: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn ........................................... 43

Bảng 4: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 .... 47

Bảng 5: Kết quả tạo FEC từ chồi nách và thùy lá non cây sắn TMS 60444 in vitro ... 49

Bảng 6: Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của nó đến tỉ lệ sống sót

và khả năng tái sinh của FEC giống sắn TMS 60444 (sau 8 tuần) ............................ 58

Bảng 7: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường chứa hygromycin ......... 63

Bảng 8: Kết quả đưa cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 ra nhà lưới sau 1 tháng.......... 71

Bảng 9: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 3

tháng trồng trong nhà lưới ......................................................................................... 72

Bảng 10: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 6

tháng so với đối chứng trong điều kiện nhà lưới ...................................................... 75

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Hình thái cây sắn [58]. ................................................................................. 14

Hình 2: Hoạt động của yếu tố phiên mã (TF) ............................................................ 22

Hình 3: Biểu hiện Dof1 tăng sự biểu hiện của các gen PEPC, PK, CS và ICDH trong

cây Arabidopsis chuyển gen Dof1. ........................................................................... 24

Hình 4: Cấu tạo vi khuẩn A. tumefaciens [4] ............................................................ 27

Hình 5: Cấu trúc và sự biểu hiện của Ti-plasmid kiểu octopine và kiểu nopaline. .. 28

Hình 6: Sơ đồ cấu trúc của Ti-plasmid [90]. ............................................................. 30

Hình 7: Cơ chế biến nạp của Agrobacterium vào tế bào thực vật [95]. .................... 32

Hình 8: Sơ đồ khái quát các hệ thống đang được sử dụng để tạo cây sắn chuyển gen

[68] ............................................................................................................................ 35

Hình 9: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi .................................................... 39

Hình 10: Sơ đồ vector pCAMBIA 1303 [75] ............................................................ 40

Hình 11: Sơ đồ vector pCAMBIA Dof1 [75] ............................................................ 40

Hình 12: Cụm mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 ............................................ 44

Hình 13: Cụm mô sẹo giống sắn TMS 60444 hình thành và phát triển trên các môi

trường từ các nguồn vật liệu khác nhau. ................................................................... 51

Hình 14: Các khối FEC của TMS 60444 hình thành và phát triển trên môi trường

MMS.......................................................................................................................... 52

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 15: Ảnh hưởng của các mật độ dịch khuẩn khác nhau đến khả năng tiếp nhận

gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444 ................................................................. 54

Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen Dof1

của FEC giống sắn TMS 60444 ................................................................................. 56

Hình 17: Hiệu quả gây chết của hygromycin lên FEC của giống sắn TMS 60444 sau

8 tuần ......................................................................................................................... 60

Hình 18: Các cụm FEC trong môi trường MMS bổ sung hygromycin ở các nồng độ

khác nhau sau 8 tuần chọn lọc................................................................................... 62

Hình 19: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường tái sinh (MSN) chứa

hygromycin qua các giai đoạn khác nhau. ................................................................ 64

Hình 20: Kết quả kiểm tra sự ra rễ của cây chuyển gen Dof1 trên môi trường chứa

kháng sinh hygromycin ............................................................................................. 66

Hình 21: Kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra cây chuyển gen Dof1 ................... 67

Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HPT trong các

cây chuyển gen .......................................................................................................... 68

Hình 23: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong các

cây chuyển gen. ......................................................................................................... 69

Hình 24: Kết quả đưa cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng ra đất sau 1 tháng. .. 71

Hình 25: Cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 3 tháng trồng trong

nhà lưới ...................................................................................................................... 73

Hình 26: Các cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 6 tháng trồng

trong nhà lưới. ........................................................................................................... 77

Hình 27: Một số hình ảnh về sự phân chạc của cây đối chứng ................................. 77

9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh Tiếng Việt

Kí hiệu/viết tắt

Acetosyringone AS

6-Benzyl amino purin BAP

CTAB

Bromide cetyltrimethylammonium

Cs Cộng sự

DNA Deoxiribonucleic Acid

ĐC Đối chứng

FEC Friable Embryogenic Callus Mô sẹo phôi hóa

FAO

Tổ chức nông lương Thế giới

Food and Agriculture Organization of the United Nations

NAA Napthanele acetic acid

OD Optical Density Mật độ quang

Picloram

4-Amino-3,5,6-trichloro-2- pyridinecarboxylic

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Phương pháp PP

Transcription factor Yếu tố phiên mã TF

Weight per volume Khối lượng trên thể tích w/v

MỞ ĐẦU

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực có củ chứa tinh bột quan trọng

ở nhiều vùng nhiệt đới có nguồn gốc từ châu Mỹ La-tinh và được du nhập vào Việt

Nam khoảng giữa thế kỷ 18. Trải qua thời gian dài phát triển, cây sắn đã dần khẳng

định được vị thế của mình, trở thành cây lương thực và cây hàng hóa quan trọng,

được coi là cây “xóa đói giảm nghèo”. Trong 30 năm qua, diện tích trồng sắn đã tăng

nhanh hơn bất kỳ cây lương thực quan trọng nào khác [7], [38].

Quá trình chuyển dịch nền kinh tế theo hướng sản xuất hàng hóa làm cho vai

trò cây sắn dần dần thay đổi. Sắn không chỉ là cây lương thực quan trọng góp phần

ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải quyết vấn đề an ninh lương thực

trên thế giới, cây sắn còn là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các ngành công nghiệp

khác: dược phẩm, thức ăn chăn nuôi, nhiên liệu sinh học và công nghiệp thực phẩm…

Đặc biệt sắn là một nguồn nguyên liệu chính trong ngành công nghiệp sản xuất mì

chính do có hàm lượng tinh bột cao. Tuy nhiên, sắn có hàm lượng protein và axit

amin thấp do vậy trong quá trình chế biến sản xuất mì chính phải mất nhiều nguyên

liệu cũng như thời gian lên men, làm giảm sức cạnh tranh của sắn với các nguồn

nguyên liệu khác và tăng giá thành sản phẩm. Vì vậy, để tăng sức cạnh tranh của sắn

với các nguồn nguyên liệu khác trong sản xuất mì chính thì đòi hỏi phải có một giống

sắn mới có năng suất cao, chất lượng tốt, hàm lượng axit amin cao.

Một trong những giải pháp phát triển sắn bền vững là áp dụng giống mới và kỹ

thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi nhuận cao và duy trì độ phì nhiêu

của đất mà không mở rộng diện tích trồng sắn. Không giống như nhiều loại cây trồng

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

chính trên thế giới, mặc dù cây sắn dễ nhân giống vô tính bằng giâm cành nhưng rất

khó khăn trong nhân giống hữu tính. Do tính dị hợp gen cao, ít hoa, khả năng thụ

phấn và tỷ lệ đậu trái thấp, tự không tương thích và phân ly tính trạng cao trong thế

hệ con cháu làm cho việc tạo giống truyền thống của sắn bị cản trở nghiêm trọng [22].

Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các

phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên. Tuy

nhiên đột biến là vô hướng vì vậy không phải lúc nào cũng thu được cá thể mang

những tính trạng mong muốn. Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen là một trong các

phương pháp hiệu quả nhất tạo ra giống sắn mới có năng suất, chất lượng tốt, có hàm

lượng tinh bột và axit amin cao do có khả năng tích hợp các tính trạng mong muốn

từ những nguồn gốc khác nhau không bị giới hạn về kiểu gen. Trên thế giới đã có khá

nhiều công trình chuyển gen vào sắn thành công với các gen tăng cường hàm lượng

các chất và chống chịu sâu bệnh: tăng hàm lượng tinh bột, tăng hàm lượng vitamin A

[39], [74]. Đặc biệt, mô sẹo phôi hóa (FEC – Friable embryo callus) được coi là vật

liệu thích hợp nhất cho chuyển gen hiệu quả ở sắn [50]. Nhưng chưa có công trình

nào nghiên cứu chuyển gen gia tăng hàm lượng axit min ở sắn.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn ở trên, chúng tôi đã lựa chọn giống sắn TMS

60444 là giống sắn đã được các Viện nghiên cứu ở Thụy Sĩ và Hoa Kỳ đánh giá là

giống sắn dễ tạo mô sẹo phôi hóa nhất và đã được chuyển gen thành công [69], [87]

để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống

sắn TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, với mục đích

tạo giống sắn TMS 60444 mang gen Dof1 bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về

khả năng biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa của giống sắn TMS 60444.

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài là cơ sở ứng dụng để chuyển gen Dof1

vào cây sắn (M. esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có hàm lượng axit amin

cao cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất mì chính.

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào thực

vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ

thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ

theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây sắn

Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) (hình 1) thuộc chi Manihot, họ

Euphorbiaceae sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác

nhau trên thế giới [18]. Sắn được phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ nam. Sắn

được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi chúng được

trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca

(tiếng Bồ Đào Nha), trong khi tại Brazin, chúng được chia thành 2 loại, sắn ngọt

(sweet cassava) hay sắn đắng (bitter cassava) theo người trồng [22].

13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1: Hình thái cây sắn [58].

Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở

vùng nhiệt đới của châu Mỹ La-Tinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người

trồng cách đây 5000 năm. Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung

tâm khác ở Trung Mỹ và Mexico. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ

sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela,

và khoảng 2000 năm trước Công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những

lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được

tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200

trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một

số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại

cây nông nghiệp từ rất lâu đời [62].

Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16.

Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede

(Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca

(1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar (1799),

Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam

và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [9].

Tóm lại, còn có những điều không chắc chắn về vấn đề trung tâm phát sinh

cây sắn. Các công trình nghiên cứu gần đây của nhiều tác giả kết luận rằng: Cây sắn

có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát sinh chính đó là ở Braxin có 2 trung

tâm còn lại là ở Mêxicô và Bolivia và được trồng cách đây khoảng 3000-7000 năm

[12].

1.1.2. Vai trò của cây sắn

1.1.2.1. Vai trò của cây sắn đối với thế giới

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất

thế giới bên cạnh gạo và ngô [42], có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn

lương thực đáng kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

nguyên liệu cho công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào

các mục đích kinh tế [12]. Khoảng 600 triệu người tại châu Á, châu Phi và Mỹ La

tinh có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn và hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển

ngành công nghiệp từ sắn. Cây sắn được coi là cây lương thực xóa đói giảm nghèo

quan trọng do là cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng

chịu hạn cao [17].

Hầu hết các bộ phận của sắn (củ, thân, lá) đều được dùng để chế biến ra nhiều

loại sản phẩm phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp như: Dược, dệt, hoá dầu thực

phẩm, chăn nuôi… Ngày nay giá trị của cây sắn ngày càng được nâng cao nhờ những

ứng dụng rộng rãi của nó. Trong ngành dược, tinh bột sắn được sử dụng làm tá dược

trong sản xuất thuốc, nhiều sản phẩm biến tính tinh bột sắn có giá trị như đường

gluccose, fructose…được dùng làm dịch truyền hoặc các phụ gia cho các sản phẩm

khác. Tinh bột sắn còn được dùng làm thức ăn cho người, để làm hồ vải và đặc biệt

trong ngành công nghiệp chế biến thức ăn cho nghề nuôi trồng thuỷ sản tinh bột sắn

là thành phần không thể thiếu được do nó có độ dẻo cao và không bị tan trong nước.

Gần 300 loại sản phẩm khác nhau có thể được chế biến từ tinh bột sắn. Lá sắn có

chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị, khá đầy đủ các axit amin cần thiết. Giá trị chủ

yếu của lá sắn là dùng để chế biến thức ăn gia súc hoặc dùng để nuôi tằm sắn rất tốt,

do chứa nhiều axit amin và một số chất dinh dưỡng [6]. Các công trình nghiên cứu

gần đây về sử dụng lá sắn ủ chua cho chăn nuôi lợn là hướng đi có nhiều triển vọng

tốt đang được nông dân ở tỉnh Thừa Thiên Huế và một số địa phương áp dụng [12].

Thân sắn được dùng để chế biến cồn, làm giấy, ván ép, chất đốt hoặc làm giá thể

trồng nấm …

Thành phần hoá học (Bảng 1) chính của củ sắn là gluxit, ở sắn củ tươi có tỷ lệ

các chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ protein

và lipit thấp. Chính vì vậy, cần thiết phải tạo ra một giống sắn mới có hàm lượng

protein cao hơn các giống sắn hiện có.

15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bả ng 1: Thành phần hóa học của sắn và các sản phẩm sơ chế từ sắn so với các loại lương thực khác [12]

Thành phần hóa học (%) Muối khoáng (mg%) Vitamin (mg%) Calo* Loại lương thực Gluxit Protein lipid Ca P Fe Caroten B1 B1 PP

Gạo tẻ 76,2 7,6 353 1,0 30,0 104,0 0,12 0,04 1,9 1,3 -

Ngô hạt khô 69,4 8,6 364 4,7 30,0 190,0 0,4 0,28 0,11 2,0 2,3

Ngô mảnh 71,8 8,5 359 3,2 - - - - - - -

Khoai lang tươi 28,5 0,8 122 0,2 34,0 49,4 1,0 0,3 0,05 0,05 0,6

Khoai lang khô 80,0 2,2 342 0,5 - - - - 0,09 - -

2,0 1,2 Khoai tây tươi 21,0 Vết 94 10,0 50,0 Vết 0,10 0,05 0,9

Khoai tây khô 75,1 6,6 338 0,3 37,0 180,0 4,3 - - - -

Mỳ loại I 72,9 1V0 354 1,1 29,0 132,0 2,0 0,18 0,13 1,0 -

1,1 0,2 1,2 - Sắn củ tươi 36,4 156 25,0 30,0 0,03 0,03 0,6

* Calo/100 gr

3,0 0,7 - - Sắn củ khô 80,3 348 - - - - -

17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sắn là cây trồng đứng vị trí thứ tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho

con người (bảng 2).

Bả ng 2: Năng lượng cung cấp trực tiếp cho con người ở vùng nhiệt đới [12].

Các nước nhiệt đới Nguồn năng lượng Thế giới (tỷ kcal/ngày) (tỷ kcal/ngày)

Lúa gạo 924 2043

Đường 311 926

Ngô 307 600

Sắn 172 178

Cao lương 147 208

Kê 128 204

Lúa mỳ <100 1877

Khoai tây 54 434

Chuối 32 44

Hội nghị Sắn Toàn cầu tổ chức tại Bỉ năm 2008 đã đưa ra thông điệp: “Cây sắn

là quà tặng của thế giới, cơ hội cho nông dân nghèo và thách thức đối với các nhà

khoa học” [29]. Do có hàm lượng tinh bột cao, cây sắn không chỉ là cây lương thực

mà còn là cây trồng nhiên liệu sinh học tiềm năng [26] tại một số quốc gia châu Á.

Năm 2006, sản lượng ethanol toàn thế giới đạt khoảng 50 tỷ lít [87]. Từ 2008, sản

lượng sản xuất ethanol của Trung Quốc đã đạt 1 triệu tấn và đang tiếp tục tăng lên.

Trung Quốc trở thành nước nhập khẩu nguyên liệu sắn để sản xuất ethanol từ các

quốc gia lân cận như Thái lan, Việt Nam, Campuchia và Indonesia. Tại Thái Lan và

Việt Nam, nhiều nhà máy sản xuất ethanol sử dụng sắn đã được xây dựng trong giai

đoạn từ 2008-2012. Indonesia, Philippine đã lên kế hoạch sử dụng sắn sản xuất

ethanol để pha vào xăng theo tỷ lệ bắt buộc 5% bắt đầu từ năm 2010. Các nước như

18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Lào, Papua New Guinea, đảo quốc Fiji, Nigeria, Colombia và Uganda cũng đang

nghiên cứu thử nghiệm cho sản xuất ethanol [93].

1.1.2.2. Vai trò của cây sắn đối với Việt Nam

Tại Việt Nam, cây sắn đang được trồng rất rộng rãi và là cây lương thực, thức

ăn gia súc quan trọng được xếp vào hàng thứ ba sau lúa, ngô và đang trong quá trình

chuyển đổi nhanh chóng từ cây lương thực truyền thống thành cây công nghiệp [3].

Hướng sử dụng nguyên liệu sắn để chế biến tinh bột, cồn sinh học, tinh bột biến tính,

thức ăn gia súc và màng phủ sinh học đang ngày càng được quan tâm.

Năm 2014, tổng diện tích sắn trên cả nước đạt khoảng 551,1 nghìn ha tăng 7

nghìn ha, sản lượng đạt 10,225 triệu tấn, tăng 468 nghìn tấn so với năm 2013, so với

cây ngô diện tích ngô đạt khoảng 1,18 triệu ha, tăng 7 nghìn ha và sản lượng khoảng

5,19 triệu tấn, tăng 500 tấn và so với cây lúa tổng diện tích gieo trồng lúa mùa cả

nước đạt xấp xỉ 1,96 triệu ha, năng suất bình quân đạt 49 tạ/ha, sản lượng đạt 9,61

triệu tấn [11]. Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do

sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ.

Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến

thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [12].

Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn

đến năm 2020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô và coi

trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển.

Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi và có lợi thế

cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và

những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định

khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo

và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây

dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh

thái [12].

Để thúc đẩy ngành sản xuất nhiên liệu sinh học phát triển, gần đây Việt Nam đã

phát triển chính sách E10 (xăng sinh học gồm 10% ethanol và 90% xăng thông thường)

19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

mà sẽ yêu cầu sản xuất từ 100 đến 150 triệu lít ethanol mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ

đã phê duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm

2025", với mục đích sản xuất nhiên liệu sinh học để thay thế một phần nhiên liệu truyền

thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường [91].

Sản xuất sắn của nước ta đang đứng trước những cơ hội và thách thức mới. Cây

sắn được xác định là cây cung cấp nguyên liệu chính cho sản xuất xăng sinh học tại

Việt Nam [92]. Cả nước hiện có 13 nhà máy nhiên liệu sinh học công suất 1067,7

triệu lít cồn sinh học mỗi năm, 66 nhà máy chế biến tinh bột sắn qui mô công nghiệp,

hơn 2000 cơ sở chế biến thủ công. Đầu tư nhà máy chế biến bioethanol là một hướng

lớn triển vọng. Hiện mỗi năm Việt Nam sản xuất khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn

tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước. Sắn lát và

tinh bột sắn Việt Nam hiện là một trong mười mặt hàng xuất khẩu chính. Thị trường

chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc [12], [36].

Năm 2015, trái ngược với tình trạng xuất khẩu sụt giảm mạnh của nhiều mặt

hàng nông sản khác như: cà phê, cao su và gạo, mặt hàng sắn và các sản phẩm từ sắn

lại tăng mạnh cả về số lượng và giá trị xuất khẩu. Cụ thể, khối lượng xuất khẩu sắn

và các sản phẩm từ sắn trong tháng 9 năm 2015 ước đạt 235 nghìn tấn, với giá trị đạt

84 triệu USD đưa tổng khối lượng xuất khẩu mặt hàng này 9 tháng đầu năm 2015 đạt

3,27 triệu tấn với giá trị 1,03 tỷ USD, tăng 28,4% về khối lượng và tăng 24,3% về giá

trị so với cùng kỳ năm 2014 [91]. Dự báo trong năm 2015 xuất khẩu sắn của Việt

Nam đạt 2 tỷ USD và là cây mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất ở Việt Nam do cần ít

vốn đầu tư [94].

Việt Nam hiện là nước đứng thứ 3 về xuất khẩu tinh bột sắn, chúng được trồng

ở khắp cả ba miền đất nước. Với đặc tính dễ trồng, sản lượng cao, đầu tư ít nên tinh

bột sắn tương đối rẻ so với các loại tinh bột khác. Ngoài ra, trong bột sắn chứa tới

83÷88% hàm lượng tinh bột. Vì vậy tinh bột sắn thích hợp làm nguyên liệu để sản

xuất ra các sản phẩm phục vụ cho công nghiệp thực phẩm đặc biệt là mì chính.

Không giống như những loại cây trồng khác, cải thiện di truyền sắn thông qua

lai hữu tính thường là một quá trình lâu dài và kém hấp dẫn do thiếu các gen kháng

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong các giống sắn hiện có, dị bội, khả năng sinh sản thấp và ra hoa không đồng bộ.

Có nhiều giống sắn rất hiếm khi ra hoa và khả năng tạo hạt thấp. Trên đồng ruộng

sắn thường được nhân giống bằng cách giâm hom. Phương pháp nhân giống này là

lý tưởng cho sự tiếp cận phân tử để cải thiện cây trồng hạn chế sự phân ly gen thông

qua thụ phấn chéo. Vì vậy cây sắn châu Á mặc dù đã được chuyển đổi từ cây lương

thực tự cung tự cấp thành cây công nghiệp quan trọng, nhưng nguồn di truyền hẹp

các giống sắn ở vùng này đã hạn chế việc tăng năng suất và tinh bột [21], [38], [39].

1.1.3. Giống sắn TMS 60444

Giống sắn TMS 60444 thuộc chi Manihot, loài esculenta, là giống sắn hoang dại

có nguồn gốc từ Nigeria, đã được các nhà khoa học tại Viện quốc tế Nông nghiệp Nhiệt

đới (IITA) thuộc Ibadan – Nigeria thu thập về để nghiên cứu vào ngày 01-06-1988.

Giống sắn TMS 60444 còn có tên gọi khác là NGA11. Chiều cao đạt được của giống

khi thu hoạch khoảng 215 cm. Lá trung tâm có dạng hình mác-elip. Cuống lá màu xanh

xen kẽ với một ít màu đỏ. Lá trưởng thành có màu xanh đậm và xẻ thành 5 thùy lá. Rễ

củ có màu trắng [92]. Đây là giống sắn đã được các viện nghiên cứu ở Thụy Sĩ và

Hoa kỳ đánh giá là giống sắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa chất lượng nhất và đã

được chuyển gen thành công [69], [85].

1.2. Yếu tố phiên mã

1.2.1. Ứng dụng của yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử

Các gen mã hóa các enzyme thường được sử dụng trong chọn giống phân tử với

mục tiêu cung cấp cho cây trồng những đặc tính mới. Khi một đặc tính mới được hình

thành nó yêu cầu phải có sự thay đổi nào đó trong gen mã hóa, các đặc tính này được

xác định thông qua các phản ứng sinh hóa. Thêm vào đó, nếu mục đích hoạt hóa một

con đường cụ thể được quy định ở một mức giới hạn tỷ lệ, thì sự biểu hiện quá mức

giới hạn của enzyme xúc tác có thể dẫn đến sự gia tăng hoạt động của enzyme, từ đó

dẫn đến sự hoạt hóa con đường. Sự biểu hiện quá mức của một dạng enzyme đã bị

giảm hoạt tính có thể có hiệu quả hơn bởi vì con đường chuyển hóa có thể được hoạt

hóa một cách cơ định không phụ thuộc vào các nhân tố điều hòa âm [84].

21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tuy nhiên, sự thay đổi đáp ứng của tế bào hoặc sự kích thích các phản ứng

enzyme là cần thiết để hình thành một đặc điểm mới, điều này rất hữu ích để thay đổi

biểu hiện của gen mã hóa protein điều hòa đặc biệt là yếu tố phiên mã. Bởi vì một

yếu tố phiên mã đơn lẻ thường kích hoạt phức hợp những đáp ứng của tế bào với

những kích thích bên trong hoặc bên ngoài cụ thể bằng cách đồng thời cảm ứng biểu

hiện của nhiều gen chức năng không liên quan đến nhau (hình 8A), sự biểu hiện quá

mức của một yếu tố phiên mã có thể tạo ra đáp ứng mạnh hơn với một kích thích cụ

thể. Bên cạnh đó, bởi vì một yếu tố phiên mã đơn lẻ thường điều khiển sự biểu hiện

phối hợp của các enzyme tham gia vào một con đường chuyển hóa (hình 8B), tăng

cường biểu hiện của yếu tố phiên mã chính sẽ có khả năng kích hoạt các con đường

mà chỉ cần tăng cường sự biểu hiện quá mức của một enzyme [84].

từ các promoter của nhiều gen mà mỗi gen trong đó có liên quan đến phản ứng khác nhau. (B) TF có

thể điều khiển phối hợp biểu hiện của nhiều gen tham gia vào một con đường trao đổi chất [84].

Hình 2: Hoạt động của yếu tố phiên mã (TF); (A) TF có thể hoạt hóa quá trình phiên mã

Các nghiên cứu về yếu tố phiên mã CBF/DREB liên kết đặc biệt với trình tự

A/GCCGAC trong các promoter cảm ứng hạn, muối cao, và lạnh, cho thấy tiềm năng

của các yếu tố phiên mã trong chọn giống phân tử. Biểu hiện yếu tố phiên mã CBF1

(DREB1B) trong cây Arabidopsis đã giúp tăng cường khả năng chịu lạnh của cây

chuyển gen [39] và sự siêu biểu hiện của yếu tố phiên mã DREB1A (CBF3) cũng dẫn

đến việc cải thiện khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi: hạn hán, muối

cao và lạnh [43].

22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.2. Yếu tố phiên mã Dof1

Nitơ là nhân tố giới hạn chính cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật không

chỉ trong hệ sinh thái tự nhiên mà còn trong hầu hết các hệ sinh thái nông nghiệp. Sử

dụng yếu tố phiên mã có thể là một cách tiếp cận mạnh mẽ để cải thiện sự trao đổi chất

cho một thế hệ các loại cây trồng có đặc điểm vượt trội bởi vì một yếu tố phiên mã duy

nhất thường xuyên điều chỉnh biểu hiện phối hợp của một tập hợp các gen quan trọng

cho con đường tương ứng. Biểu hiện của Dof1 cảm ứng điều hòa tăng cho các gen mã

hóa các enzyme để sản xuất khung carbon giúp gia tăng đáng kể hàm lượng axit amin

và giảm mức độ glucose trong cây Arabidopsis chuyển gen [83].

Đồng hóa nitơ là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Do

chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của hiệu quả sử dụng nitơ đến năng suất cây trồng, một số

lượng lớn các loại phân đạm được đổ vào đồng ruộng để tối đa hóa năng suất cây

trồng. Tuy nhiên, phân bón nitơ gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường, đặc biệt

là các hệ sinh thái thủy sinh [55]. Vì vậy, việc tạo cây trồng có khả năng tăng đồng

hóa nitơ là rất quan trọng để gia tăng cả sinh khối thực vật và bảo vệ môi trường [30].

Ở thực vật, nitơ vô cơ trong đất ở dạng nitrat và amoniac là bước đầu chuyển đổi

thành glutamine và glutamate bởi hai enzyme glutamine synthetase (GS) và

glutamate synthase (glutamine-oxoglutarate aminotransferase). Sau đó các axit amin

được sử dụng như nguyên liệu ban đầu cho quá trình tổng hợp các hợp chất nitơ hữu

cơ, bao gồm các axit amin khác, nucleotide, và chlorophyll (hình 3) [47].

Một con đường đồng hóa nitơ được giả định đó là việc tăng cường các hoạt

động enzyme cho đồng hóa nitơ hoặc khử nitrate. Tuy nhiên, biểu hiện quá mức sự

đồng hóa nitơ hoặc các enzyme khử nitrat không thúc đẩy được quá trình tổng hợp

axit amin trong cây chuyển gen [30], [73]. Ngoài ra, các báo cáo gần đây cho thấy,

sản xuất GS quá mức dẫn đến hiệu suất sử dụng nitơ tốt hơn thông qua thúc đẩy việc

tái sử dụng ammonia tạo ra trong quang hợp nhưng không làm tăng mạng lưới đồng

hóa nitơ [32], [57].

Đồng hóa nitơ không chỉ cần sự có mặt của nitơ vô cơ trong đất mà còn cần

khung carbon 2-oxoglutarate (2-OG) được tạo từ các chất trung gian chuyển hóa của

23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

quá trình quang hợp (hình 3). Mức độ các chất chuyển hóa carbon và nitơ cùng có

ảnh hưởng lẫn nhau, cho thấy liên kết mật thiết giữa quá trình trao đổi chất carbon và

nitơ [25]. Do đó, có thể dự đoán rằng sự gia tăng khung carbon có thể kích thích sự

đồng hóa nitơ trong các cây. Biến đổi gen sản xuất khung carbon được cho là khó

khăn bởi vì nhiều enzyme tham gia vào sản xuất khung carbon. Chuyển nhiều gen mã

hóa các enzyme có vẻ không thực tế nhưng chuyển một gen mã hóa một chất hoạt

hóa phiên mã chính thì dường như có thể.

Hình 3: Biểu hiện Dof1 tăng sự biểu hiện của các gen PEPC, PK, CS và ICDH

dụng: PEP: phosphoenolpyruvate; OAA: oxaloacetate; 2-OG: 2-oxoglutarate. Một số enzyme quan

trọng: PEPC: carboxylase phosphoenolpyruvate; PK: pyruvate kinase; CS: synthase citrate; ICDH:

dehydrogenase isocitrate; GS: glutamine synthetase; GOGAT: synthase glutamate; NIA: reductase

nitrate [84].

trong cây Arabidopsis chuyển gen Dof1. Chữ viết tắt cho các chất chuyển hóa được sử

Các loài thực vật và động vật đáp ứng với hàng loạt các kích thích bên trong và

bên ngoài bằng cách điều khiển sự phiên mã của các gen khác nhau. Vô số các nhân

tố cis và các yếu tố hoạt động trans đã được xác định và mô tả để hỗ trợ cho sự hiểu

biết của chúng ta về cơ chế điều hòa biểu hiện gen và các con đường dẫn truyền tín

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

hiệu của thực vật; những nghiên cứu này đã cho thấy rằng nhiều protein liên kết DNA

thực vật có thể được nhóm lại thành các lớp riêng biệt dựa trên các miền liên kết DNA

được bảo tồn của chúng [44], [54]. Mỗi thành viên của những họ này tương tác với

những mô típ trình tự DNA có liên quan chặt chẽ thường được tìm thấy trong một

phức hợp các promoter gen được điều khiển bởi các tín hiệu điều hòa khác nhau.

Trong một số báo cáo trước đây, việc sản xuất quá mức glutamine synthetase trong

cây chuyển gen đã cải thiện hiệu quả sử dụng nitơ bằng cách thúc đẩy tái sử dụng

ammoniac thải ra trong suốt quá trình hô hấp sáng. Điều này có thể xảy ra vì lượng

amoniac thải ra trong suốt quá trình hô hấp sáng lớn hơn nhiều so với lượng nitơ ban

đầu được cây hấp thụ. Tuy nhiên sự biểu hiện quá mức của enzyme cũng xuất hiện

không làm ảnh hưởng tới mạng lưới đồng hóa nitơ [82].

Dof là một họ các protein liên kết DNA đã được tìm thấy trong các loài thực vật

khác nhau. Việc phát hiện ra các protein Dof tương tác với các promoter khác nhau của

các gen cụ thể ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm (ngô, lúa mạch, Arabidopsis, thuốc

lá và bí ngô) đã cho thấy rằng các protein Dof có thể tham gia vào sự biểu hiện của một

gen quang hợp, gen lưu trữ protein hạt, gen gây ung thư thực vật, và các gen đáp ứng

với một hormone thực vật và / hoặc tín hiệu bất lợi [53], [78]. Tuy nhiên các protein

Dof vẫn chưa được tìm thấy ở động vật và nấm men. Do đó, protein Dof được coi là

yếu tố phiên mã thực vật hoạt động liên quan đến các quá trình sinh học đặc trưng ở

thực vật [79]. Họ này bao gồm các protein chứa miền Dof là một chuỗi axit amin được

bảo tồn cao tham gia vào liên kết DNA [76], [77]. Các thí nghiệm tạo phức và phân

tích đột biến cho thấy rằng miền Dof là một đoạn 52 axit amin với một zinc finger đơn

(C2-C2). Zinc finger của các protein Dof khác biệt với những zinc finger đã biết về trình

tự axit amin và sự sắp xếp của các dư lượng cystein với sự phối hợp của zinc cần thiết

cho liên kết DNA [76].

Dof1 ngô (MNB1a) là thành viên đầu tiên của họ protein Dof đặc trưng ở thực

vật [77], [80]. Bởi vì Dof1 dường như là một điều tiết chủ chốt trong biểu hiện gen

phối hợp tham gia vào việc sản xuất khung carbon, các con đường cho sản xuất có thể

được kích hoạt bằng Dof1. Nó đã chỉ ra liên kết với mô típ mã trình tự AAAAGG được

tìm thấy trong nhiều promoter thực vật [75]. Mặc dù phức hợp các protein Dof kết hợp

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

với các promoter gen khác nhau gần đây đã được xác định trong một loạt các loại cây

nhưng các chức năng sinh lý và sự điều hòa của chúng vẫn khó được xác định. Ở ngô,

Dof1 (MNB1a) được biểu hiện chủ yếu trong lá, thân và rễ, trong khi đó Dof2 liên

quan chặt chẽ tới sự biểu hiện chính trong thân và rễ.

Bằng cách sử dụng một khảo nghiệm ngắn trên tế bào trần lá ngô, Yanagisawa

and Sheen (1998) đã chỉ ra rằng Dof1 là một chất hoạt hóa sự phiên mã và nhiều biểu

hiện gen liên quan đến sự chuyển hóa acid hữu cơ, bao gồm sự biểu hiện gen

phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC), trong khi đó Dof2 có thể hoạt động như

một chất ức chế phiên mã. Như vậy, sự biểu hiện đặc biệt của Dof1 và Dof2 có thể

cho phép sự biểu hiện gen cụ thể của lá [78], [79]. Các phân tích trên cơ thể sống của

họ chỉ ra rằng mặc dù hoạt động liên kết DNA của Dof1 được quy định bởi sự phát

triển phụ thuộc ánh sáng nhưng hoạt động hoạt hóa vận chuyển và định vị nhân thì

không phụ thuộc. Hơn nữa, sự phiên mã trong cơ thể và các thử nghiệm điện di trong

ống nghiệm chỉ ra rằng Dof1 có thể tương tác cụ thể với promoter gen C4

phosphoenolpyruvate carboxylase của ngô và tăng cường hoạt động của promoter

này để có cách thức quy định sự biểu hiện phụ thuộc vào ánh sáng phù hợp với hoạt

động của Dof1. Nghiên cứu này cũng cho thấy Dof1 có khả năng điều chỉnh thông

qua miền liên kết DNA của nó để hoạt hóa sự phiên mã theo các cách khác nhau trong

các tế bào lá xanh và lá vàng. Những kết quả này cho thấy rằng các protein Dof có

thể tham gia vào các cơ chế phân tử mới tiềm ẩn trong các mô cụ thể và sự biểu hiện

gen điều tiết ánh sáng ở thực vật.

1.3. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens

Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens được xem là phương pháp

có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự

nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.

1.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp

Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u vết thương của vi khuẩn A. tumefaciens

[15].

26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

A. tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở

các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc

họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Khi cây bị thương,

các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A.

tumefaciens vi khuẩn đã xâm nhập vào chỗ bị thương và gây u. Các tế bào vi khuẩn

không xâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp vào chúng một loại plasmid

đặc hiệu có khả năng tạo ra khối u [2]. Tiến hành phân tích thành phần các chất trong

khối u thì thấy có nhiều hợp chất lạ. Phân tích hoá sinh các hợp chất lạ thì phát hiện

ra đó chính là các phức hợp axit amin arginin - xetoaxit, những hợp chất đó không có

ở thực vật, vi khuẩn đã sử dụng những hợp chất đó trong quá trình đồng hoá. Như

vậy vi khuẩn đã chuyển vào trong tế bào thực vật tác nhân gây u và những tác nhân

đó tổng hợp lên những hợp chất mới [5].

1.3.2. Đặc điểm cấu trúc của vi khuẩn Agrobacterium

Hình 4: Cấu tạo vi khuẩn A. tumefaciens [4]

27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 5: Cấu trúc và sự biểu hiện của Ti-plasmid kiểu octopine và kiểu nopaline.

A. Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích

thước của các vùng chức năng chính. Các vị trí tô đậm chỉ các vùng tương đồng lớn của 2 plasmid:

CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp; ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản.

B. Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và octopine cho thấy các vùng chức năng chính, các vùng tương

đồng và các sản phẩm phiên mã [13].

A. tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích thước khoảng

200 kb gọi là Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (hình 4). Mô khối u

tổng hợp amino axit và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine. Trong opine

người ta phân biệt hai loại octopine và nopaline (hình 5). Một số chủng vi khuẩn A.

tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopine và một số khác là của nopaline. Những

plasmid octopine chỉ có thể tạo octopine và phân giải chúng, nhưng không tạo và

phân giải được nopaline [14].

Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine,

mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành

28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginin và dễ dàng

phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến

được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline [16].

Có sự khác nhau giữa các loại plasmid ở Agrobacterium, đó là Ti-plasmid của

loại nopaline chỉ chứa một bản sao (copy) của T-DNA, trong khi plasmid octopine

chứa đến ba bản sao. Ở trên đoạn T-DNA định vị những gen tổng hợp opine và tạo

khối u. Khối u được tạo nên là do hai loại phytohormone (auxin và cytokinin) được

tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo

nên mô không phân hóa (callus) [14].

Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các

khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm [4]. Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp

diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi

cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình

thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro [16].

Điều này cho phép kết luận: vi khuẩn đã chuyển vào cây tác nhân gây khối u

dưới dạng vật chất di truyền. Các thực nghiệm cho thấy khi xử lý vết thương bằng vi

khuẩn A. tumefaciens không mang plasmid thì không gây bệnh u và u chỉ xuất hiện

khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn mang plasmid. Như vậy plasmid của A.

tumefaciens chính là tác nhân gây bệnh. Người ta đã khẳng định các plasmid nói trên

cần thiết cho việc tạo khối u, vì vậy chúng được gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing

plasmid) [14].

Ti-plasmid

Ti-plasmid là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn, plasmid liên

quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng

sinh,…Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể

nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập [15].

29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 6: Sơ đồ cấu trúc của Ti-plasmid [90].

Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong

Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30°C [16]. Trên Ti-plasmid có đoạn T- DNA có được

giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) (hình 6). Trình tự nucleotid

của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. Đoạn này được gọi là T-DNA vì đây là đoạn sẽ

được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh khối u. T-DNA của

vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật).

T-DNA ổn định trong gen nhân.Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn

toàn ngẫu nhiên [4].

Vùng vir: là vùng chứa các Gen vir (virulence gene) mã hóa cho các protein

thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật.

Vùng CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp

Vùng ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản.

T-DNA

Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những

tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA (transfer-DNA). T-DNA

là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật. Trên đó định vị những gen

tạo khối u và tổng hợp opine. T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải

30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

(LB: left border và RB: right border). Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25

bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA được đưa vào DNA trong

nhân tế bào thực vật. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những

vùng có khả năng sao chép [14].

Đó là một đoạn DNA trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin,

cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes). Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid

còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng

lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism).

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật ở dạng

một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một

đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá

những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối

u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng

hợp auxin và cytokinine.

Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm

hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất

phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD,

virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp

(hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che

chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an

toàn. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ

bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của

cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi

khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid.

Vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy

roots) khi bị nhiễm bệnh. Trên thực tế Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm,

vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá

mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá

31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của vi

khuẩn Agrobacterium vào cây một lá mầm [16].

b. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens

Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi

tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringone), chất có vai trò

quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật. Cơ chế nhận

biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A. tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây

một lá mầm thì phản ứng này chỉ có ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium chỉ được sử

dụng hạn chế cho việc biến nạp gen ở cây một lá mầm. Khi bổ sung syringone người

ta có thể biến nạp gen vào nấm nhờ A. tumefaciens [4].

Hình 7: Cơ chế biến nạp của Agrobacterium vào tế bào thực vật [95].

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào,

chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối

loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (hình 7). Khả năng chuyển gen

này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào

thực vật theo ý muốn [14].

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn

như: AS,... Dưới tác dụng của các hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào

thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. Quá trình này được sự trợ

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

giúp đặc biệt của các gen vir và bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left

Border). Cũng chính các hợp chất này là AS,... với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen

vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.

Sự tiếp xúc của A. tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị

tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình này một

chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS. Gen virA và

gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ

được phiên mã ở mức độ thấp. Khi A. tumefaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực

vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với

màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế

bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC. Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt

hóa làm cho các gen virB, virC, virD và virE không hoạt động và làm tăng cường

sự phiên mã của gen virC.

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình

tự biên 25 bp nằm ở mép của T-DNA và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch thẳng

tương ứng với T-DNA. Các sản phẩm của operon virD có hoạt tính endonuclease

[16]. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang

tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào DNA nhân.

1.4. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở sắn

1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn trên thế giới

Chuyển gen vào sắn bắt đầu được thử nghiệm từ những năm 1987. Chuyển gen

sắn khi còn trong giai đoạn đầu, nhiều thông số tham gia vào quá trình này có thể

được tối ưu hóa hoặc chưa được nghiên cứu. Lần đầu tiên tìm hiểu thêm về sự biểu

hiện của gen ngoại lai trong sắn, các nhà khoa học đã sử dụng súng bắn gen để đưa

DNA vào tế bào lá [1]. Promotor CaMV 35S là ứng viên tốt để biểu hiện gen dị hợp

ở lá sắn. Tiếp theo là các phương pháp lây nhiễm Agrobacterium vào các mô lá và

vào phôi soma bằng cách ngâm thông thường. Sau 2 tuần chọn lọc, gen GUS được

biểu hiện ở tất cả các bộ phận của phôi. Tuy nhiên việc sử dụng các mô đích là mô lá

hoặc phôi soma trong chuyển gen thường tạo ra các thể khảm [63]. Vì vậy, để giải

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

quyết vấn đề này, ngày nay các nhà khoa học đã sử dụng mô sẹo phôi hóa (friable

embryogenic callus - FEC) trong chuyển gen thông qua Agrobacterium để cải thiện

hiệu quả chuyển gen [20], [49], [66], [74].

Với các tiêu chí đánh giá bao gồm: thời gian để phục hồi cây chuyển gen, khả

năng thích ứng, mức độ biểu hiện gen chuyển, khả năng tạo ra các biến thể và biến dị

soma. Cả bốn hệ thống sử dụng trong chuyển gen đều có những tiềm năng riêng.

Trong đó, hệ thống sử dụng FEC là mô đích được đánh giá cao nhất để đưa các gen

mong muốn vào cây sắn bằng phương pháp chuyển gen. FEC và hệ thống phôi treo

được tạo thành từ FEC đã được áp dụng thành công như mô mục tiêu để tiếp nhận

gen thông qua súng bắn gen [67] và A. tumefaciens [35], [85]. Việc sử dụng cấu trúc

FEC mới phát sinh từ các mô phôi có thể khắc phục vấn đề về biến dị soma trong quá

trình tái sinh cây từ phôi [59], [67], hơn nữa việc tái sinh cây từ FEC cho tỷ lệ chồi

thật cao hơn là tái sinh từ các cấu trúc phôi khác. Vì vậy khả năng tạo cây chuyển gen

thành công là rất cao [85].

Các nghiên cứu ban đầu trong công nghệ chuyển gen ở sắn đã xác định rằng

phôi soma tạo ra từ thùy lá non có thể được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen.

Những cấu trúc phôi đa bào, phôi thứ cấp có thể tạo ra từ phôi soma [58], được sử

dụng như là mục tiêu để chèn gen cần chuyển khi mà các chương trình kĩ thuật di

truyền ở cây sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990. Sau một khoảng thời gian

vất vả nghiên cứu, năm 1994 các nhà khoa học đã sản xuất được phôi biến đổi gen ở

sắn. Tiếp theo là bước đột phá trong việc tái sinh cây từ hệ thống phôi sắn, tạo ra cây

sắn biến đổi gen biểu hiện gen uidA [48] và gen luciferase [58]. Hiện nay có bốn hệ

thống chuyển đổi riêng biệt được sử dụng để tạo cây sắn chuyển gen (Hình 8). Tất cả

các hệ thống chuyển đổi trên được tạo ra từ các mô phôi được hình thành từ các thùy

lá non. Tuy nhiên mỗi hệ thống khác nhau lại có một phương thức chuyển gen riêng.

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 8: Sơ đồ khái quát các hệ thống đang được sử dụng để tạo cây sắn chuyển

gen [68]

Đối với sắn, có hai phương pháp phổ biến được sử dụng để chuyển gen. Trong

đó, phương pháp sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen có khả năng cao sẽ tạo được

cây chuyển gen chứa 1 bản copy của gen hơn là phương pháp sử dụng súng bắn gen.

Bằng phương pháp southern blot để phân tích 75 dòng cây chuyển gen cho đến nay

cho thấy, có tới 50% cây chuyển gen chứa 1 bản copy của gen khi sử dụng phương

pháp chuyển gen bằng A. tumefaciens trong khi đó phương pháp dùng súng bắn gen

chỉ tạo được 10% [67]. Năm 2009, Bull và cộng sự phát triển phương pháp cải tiến

kết hợp sử dụng Agrobacterium để chuyển gen vào phôi mô sẹo phôi hóa cho tần suất

biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn hẳn các phương pháp cũ. Cho đến nay,

phương pháp này vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong

muốn vào cây.

Hiện tại, đã có rất nhiều giống sắn từ châu Phi, châu Á và châu Mỹ đã tạo được

FEC và đã có khá nhiều giống sắn được chuyển gen thành công như: Col 22, Col

35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

1505, Col 2215, Per183 và Ica-Negrita có nguồn gốc từ Nam Mỹ; 60.444, Bonoua

Rouge, L2, Oko-iyawo (TME 7), Ebwanatereka, Serere, Mkombozi, Kibandameno,

Albert, Kibaha và TME14 từ châu Phi và Adira-4 từ Indonesia [56], [59], [67]…

Như vậy với hàng loạt hệ thống tế bào mầm đa dạng và quy trình chuyển gen

sẵn có thì trong tương lai gần, cây sắn nói riêng và nhiều loại cây trồng khác nói

chung sẽ có khả năng tích hợp và biểu hiện các gen mong muốn. Cũng như chọn tạo

giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn giống sắn

là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù hợp. Đây

cũng là một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì

lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro đặc biệt là

trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp. Do đó, việc nghiên cứu khả năng tái

sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng.

Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các

đặc tính khác nhau như: giảm hàm lượng cyanua [65], kháng sâu [46], tỉ lệ amylose

thấp [45], kháng thuốc trừ cỏ [62], kháng bệnh khảm [83]. Hiện tại trung tâm nông

nghiệp nhiệt đới quốc tế (CIAT) và viện quốc tế nông nghiệp nhiệt đới (IITA) đang

triển khai việc cung cấp các giống sắn tăng cường khả năng kháng bệnh và sâu bệnh,

tăng hàm lượng chất khô để cải thiện chất lượng chế biến các giống sắn Châu Phi,

Châu Á và Châu Mỹ [51]. Những thành tựu thu được cho thấy tiềm năng trong việc

tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp

gen.

Các tiến bộ trong chuyển gen sắn gần đây đã cho phép sản xuất một cách mạnh

mẽ cây sắn chuyển gen ngay cả dưới các điều kiện nuôi cấy mô thực vật chưa tối ưu.

Các quy trình chuyển gen vào sắn cho đến nay chủ yếu được thực hiện trên giống sắn

mô hình TMS 60444 vì mô phôi có khả năng tái sinh tốt [85].

1.4.2. Tình hình chuyển gen sắn ở Việt Nam

Việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất sắn đang được triển

khai rộng rãi. Tuy nhiên, lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp

toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản

36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen

để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú

là rất cần thiết [68].

Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn theo

cách này là cần thiết. Sau một thời gian phát triển công nghệ trong những năm 1990

đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng cường giá trị cho

người sản xuất và người tiêu dùng. Mọi nỗ lực hướng vào tích hợp những đặc điểm

nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại trong tương lai. Công nghệ

biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành cây lương thực và hàng hóa

trong thế kỷ 21 [68].

Có rất nhiều công trình chuyển gen thành công trên các giống cây trồng như:

đậu tương, ngô, lúa, bông, cà chua... nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên, ở Việt

Nam chưa có một công trình chuyển gen thành công nào ở sắn thông qua vi khuẩn

Agrobacterium được công bố mà chỉ có một công trình chuyển gen bằng phương

pháp bắn gen được công bố của nhóm tác giả Bùi Lan Anh và cs [1].

Hiện nay, ở Việt Nam nghiên cứu tạo giống sắn biến đổi gen vẫn còn khá mới

mẻ. Chỉ sau năm 2000, nước ta mới có một vài đề tài nghiên cứu đầu tiên về tạo

giống sắn biến đổi gen: chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào cây sắn

bằng A. tumefaciens [10], chuyển gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây sắn bằng

súng bắn gen [1]…Tuy nhiên, các cây sắn biến đổi gen này vẫn chưa được mở rộng

gieo trồng ở Việt Nam, mà mới trong phạm vi phòng thí nghiệm và trồng thử

nghiệm.

Năm 2008, Bùi Lan Anh và cs đã nghiên cứu chuyển gen vào sắn nhưng

nguyên liệu là mảnh lá non và sử dụng phương pháp súng bắn gen. Tuy nhiên,

phương pháp này có nhiều nhược điểm hơn phương pháp chuyển gen thông qua

Agrobacterium như: đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể gây ra sự xáo trộn trật tự của

đối tượng chuyển, tần số biến nạp ổn định thấp, nhiều bản sao của gen biến nạp có

thể được chuyển vào tế bào cùng lúc. Nghiên cứu chuyển gen vào giống sắn mô

hình TMS 60444 trong điều kiện ở Việt Nam là một hướng đi mới và mang ý nghĩa

37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

quan trọng cho sự phát triển của ngành trồng sắn ở nước ta hiện nay khi mà cây sắn

trở thành cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa gạo và ngô. Hơn thế nữa, phương pháp

tạo mô sẹo phôi hóa cũng là bước đi quan trọng cho việc tạo mô sẹo phôi hóa các

giống Việt Nam nhằm phục vụ cho công tác cải thiện những nhược điểm của các

giống sắn hiện có tại Việt Nam bằng công nghệ sinh học. Tuy nhiên, cho đến nay,

Việt Nam mới có 1 công trình khoa học công bố về lĩnh vực kết quả tạo mô sẹo

phục vụ cho chuyển gen vào cây sắn của nhóm tác giả Nguyễn Văn Đồng và cs [8].

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Mẫu thực vật

Vật liệu nghiên cứu: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi, đang trong giai

đoạn phát triển do Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực

vật cung cấp được sử dụng để tạo mô sẹo phôi hóa (FEC) cho chuyển gen.

Hình 9: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi

2.1.2. Vi khuẩn và các vector

- Chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA Dof1 chứa gen

Dof1 và chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA 1303 không

chứa gen chức năng làm đối chứng (plasmid, vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 do

Viện Nghiên cứu RIKEN, Nhật Bản cung cấp). Hai vector đều chứa gen chọn lọc

kháng kháng sinh kanamycine (50mg/L) và hygromycine (25 mg/L)

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 10: Sơ đồ vector pCAMBIA 1303 [75]

Hình 11: Sơ đồ vector pCAMBIA Dof1 [75]

- Trình tự cặp mồi gen Dof1:

ZmDof1_F3_140407 GCGGGACACCAAGTTCTG

ZmDof1_R3_140407 GAGGGGAAGTCGGAGAGG

- Kích thước sản phẩm: 423bp

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1.3. Môi trường nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy

Các loại môi trường nuôi cấy mô sẹo được cải tiến dựa trên các loại môi trường

có trong nghiên cứu của Zainuddin và cs (2012):

- Môi trường MS (môi trường nhân cây in vitro): 1× muối MS và các vitamin,

2% sucrose (w/v), 0,3% Gelrite (w/v), pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường CAM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar

(w/v), CuSO4 2mM, 0,1% BAP (w/v), pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường CIM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v) , 1% agar (w/v),

CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường DKW: Hỗn hợp muối bazo và vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar

(w/v), CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường MMS (1/10MS) có bổ sung 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar

(w/v), 12 mg/l picloram và vitamin, pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường MSN (môi trường tái sinh phôi tạo cây hoàn chỉnh): 1× muối MS

và các vitamin, 1mg/l NAA, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử

trùng.

- Môi trường CEM (môi trường tạo rễ): 1× muối MS và các vitamin, 2 μM

CuSO4, 0,4 mg/l BAP, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử trùng.

- Môi trường YEB đặc (yeast extract broth) dùng để chọn lọc Agrobacterium:

1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone,

5 g/l sucrose, 1,5% BactoTM agar (w/v), pH 7,2, khử trùng.

- Môi trường YEB lỏng (yeast extract broth) dùng để nuôi cấy Agrobacterium:

1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone,

5 g/l sucrose, pH 7,2, khử trùng. Bổ sung dung dịch MgSO4 vô trùng để đạt nồng độ

cuối cùng 2 mM.

41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các hóa chất khác

- Kháng sinh chọn lọc khuẩn: dung dịch kanamycin 50 mg/l.

- Kháng sinh diệt khuẩn: dung dịch cefotaxime 200 mg/mL.

- Chất chọn lọc thực vật chuyển gen: dung dịch hygromycin 25mg/mL.

- Dung dịch acetosyringone 200 mM.

Vật tư tiêu hao

+ Đĩa petri vô trùng 90 mm; rây nhựa vô trùng cỡ 100 μm; pipet 25 mL vô trùng;

lọ thủy tinh vô trùng; ống falcon vô trùng 15 mL và 50 mL; ống Eppendorf (1,5 mL);

parafilm; đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 μm); giấy nhôm; giấy lọc vô trùng; xi-lanh

(10 mL); các loại đầu côn vô trùng; chậu; cốc nhựa; bình phun sương.

Trang thiết bị

+ Nồi khử trùng; pH mét; cân điện tử chính xác; máy ly tâm; máy lắc; buồng

nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (28°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối cường độ ánh

sáng 3000 lux); buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (24°C, 16 giờ

sáng/8 giờ tối cường độ ánh sáng 3000 lux); bốc cấy vô trùng với đèn cồn; tủ lạnh

(4°C) và tủ âm sâu (−20°C); panh, dao, kéo, thìa xúc; que cấy; tủ lắc ổn nhiệt (28°C);

quang phổ kế; cu-vét 1 mL; thanh khuấy từ; máy vortex; micropipette; máy PCR;

máy điện di; máy chụp ảnh.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa

Các cây sắn TMS 60444 in vitro cao khoảng 5-6 cm được sử dụng để làm vật

liệu tạo mô sẹo phôi hóa theo 2 phương pháp:

- Phương pháp 1 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng chồi nách): Các cây con được loại

bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi

trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày, tách chồi nách

và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo.

Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi

42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp

tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang môi trường MMS có chứa

picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mô sẹo và tạo mô sẹo phôi hóa. Mô sẹo phôi hóa

được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram

12 mg/l để tăng sinh khối [8].

- Phương pháp 2 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng thùy lá non): Các cây con 4-8 tuần

tuổi sẽ được soi dưới kính hiển vi quang học để chọn ra các thùy lá ngọn còn non,

chưa mở, dài khoảng 0,5-1 cm. Tách từng thùy lá non được chọn cho vào môi trường

CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Sau 2-4 tuần thu được mô sẹo

tiến hành các bước tiếp theo giống phương pháp 1.

Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:

Bả ng 3: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn

Môi trường Giai đoạn Hormone Thời gian Chu kì sáng:tối (nhiệt độ) PP 1 PP 2

MS MS - 16h:8h (28°C) Tạo vật liệu khởi đầu 4-8 tuần

Tạo chồi nách CAM - 0h:24h (28°C) 2-4 ngày BAP 10mg/L

Tạo mô sẹo CIM CIM 0h:24h (28°C) 2-4 tuần Picloram 12mg/L

Chọn lọc mô sẹo DKW DKW 0h:24h (28°C) 2-4 tuần Picloram 12mg/L

0h:24h (28°C) Tạo và nhân mô sẹo phôi hóa 4–10 tuần 1/10MS (MMS) 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L

Sự lựa chọn các thùy lá non, các cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mô sẹo

phôi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.

43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sự hình thành mô sẹo phôi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự

gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mô sẹo,

màu sắc mô sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.

Tỷ lệ tạo mô sẹo được tính bằng số cụm mô sẹo trên số chồi ban đầu.

Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa được tính bằng số cụm mô sẹo phôi hóa trên số chồi

ban đầu.

2.2.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa

Các cụm mô sẹo phôi hóa từ 14-20 ngày tuổi có màu vàng tươi và tơi xốp được

chọn và tách ra để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp.

Hình 12: Cụm mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444

2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch khuẩn và biến nạp

A. tumefaciens mang plasmid mang các gen cần chuyển đã được chuẩn bị sẵn.

Khuẩn lạc sau chọn lọc của vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid cần chuyển được

nuôi trong 10ml môi trường YEB (lỏng) có bổ sung kanamycin 50 mg/l, hygromycin

25mg/l nuôi lắc 100 vòng/phút ở 280C trong thời gian 48 giờ (OD600 = 0,7 - 1) [85].

Ly tâm dịch nuôi khuẩn với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

để thu cặn A. tumefaciens. Hòa cặn trong MMS lỏng có chứa 200µM acetosyringone

và đo OD600 của dung dịch, pha loãng ở giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7. Dung dịch này

sẽ được sử dụng để lây nhiễm mô sẹo phôi hóa.

44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống Falcon 50ml có chứa mô sẹo phôi hóa,

sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 2-4 phút. Loại bỏ dung dịch, thấm

khô mô sẹo phôi hóa bằng giấy lọc vô trùng. Sau đó, chuyển mô sẹo phôi hóa sang

môi trường đồng nuôi cấy (môi trường MMS có bổ sung AS (acetosyringone)

200µM) trong 4 ngày ở điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối với cường độ ánh sáng

3000 lux và nhiệt độ trong dải 200C, 220C, 240C, 260C.

2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime đến khả năng loại khuẩn

thừa và tái sinh cây từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp

Khối mô sẹo được biến nạp sau 4 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để

loại bỏ vi khuẩn. Rửa mô bằng dung dịch MMS đã khử trùng có bổ sung kháng sinh

cefotaxime để diệt khuẩn. Sau đó, thấm khô mô phôi bằng giấy thấm vô trùng và

chuyển chúng sang môi trường nhân mô sẹo (MMS) có bổ sung cefotaxime ở các

nồng độ từ 0, 300, 400, 500, 600, 700 mg/l. Sau một tuần kiểm tra sự sống sót và mức

độ nhiễm khuẩn của mô sẹo phôi hóa và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa.

Nồng độ cefotaxime thích hợp thể hiện thông qua tỉ lệ cụm mô sẹo phôi hóa

sống sót mà không bị nhiễm khuẩn và đặc điểm mô sẹo phôi hóa trong môi trường

tái sinh có bổ sung các dải nồng độ cefotaxime khác nhau.

2.2.2.3. Nghiên cứu nồng độ chất chọn lọc thực vật hygromycin thích hợp để

chọn lọc mô được chuyển gen

Để xác định được ngưỡng có tác dụng gây chết 100% của chất chọn lọc đối với

mẫu đối chứng không chuyển gen để làm cơ sở cho chọn lọc cây chuyển gen. Các

cụm mô sẹo phôi hóa chưa chuyển gen được đưa vào môi trường MMS có bổ sung

hygromycin với dải nồng độ 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l và 25 mg/l. Theo dõi khả

năng sống sót của các cụm mô sẹo phôi hóa này sau 8 tuần xác định ngưỡng gây

chết của hygromycin cho chọn lọc mô chuyển gen.

45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Sau khi xác định được ngưỡng gây chết của hygromycin có khả năng chọn lọc

mô chuyển gen tốt nhất, mô sẹo phôi hóa đã được loại bỏ dịch khuẩn sẽ được đưa

vào môi trường nhân mô sẹo (MMS) có chứa cefotaxime với nồng độ thích hợp và

chất chọn lọc thực vật là hygromycin ở nồng độ thấp. Cứ sau 7 ngày khối mô sẹo

tiếp tục được chuyển sang môi trường MMS mới có chứa chất chọn lọc hygromycin

với nồng độ tăng dần lên cho tới khi đạt nồng độ hygromycin thích hợp, nhằm đảm

bảo khả năng sống sót và phục hồi của các mô yếu sau bước đồng nuôi cấy mà các

mô này có khả năng mang gen chuyển. Sau đó các mô chuyển gen sẽ được chuyển

đến môi trường tái sinh MSN có chứa nồng độ hygromycin thích hợp để tái sinh

thành cây hoàn chỉnh [20], [85].

2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa

sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen

Các mô sống sót sau 3 - 4 tuần nuôi cấy tại MMS được chuyển sang môi trường

tái sinh cây (MSN) có chứa cefotaxime và hygromycin ở nồng độ thích hợp với nhiệt

độ 280C thời gian chiếu sáng 16h/ ngày đêm và cường độ chiếu sáng 2000 lux. Sau

14 tuần, các cụm chồi thật xuất hiện từ các cụm mô sẹo phôi hóa sẽ được tách ra và

cấy chuyển sang môi trường tạo rễ (CEM) có bổ sung cefotaxime và hygromycin để

tiếp tục chọn lọc. Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, các cây tái sinh được

nhân trong môi trường MS, nuôi cấy trong 8 tuần để sử dụng làm nguyên liệu để tách

chiết DNA.

2.2.2.5. Phương pháp xác định sự có mặt của gen Dof1 trong cây sau chuyển gen

a. Phương pháp sàng lọc nhanh khả năng tạo rễ

Để xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây, chúng tôi đã tiến hành thí

nghiệm sàng lọc nhanh các dòng chuyển gen kháng hygromycin bằng cách: sau khi

thu được các chồi chuyển gen, cắt các chồi ngọn cấy chuyển sang môi trường MS có

bổ sung cefotaxime và hygromycin ở nồng độ thích hợp để kiểm tra sự ra rễ [84]. Để

46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

đảm bảo môi trường sàng lọc có hiệu quả, các cây TMS 60444 chưa chuyển gen cũng

được sử dụng như đối chứng âm.

b. Sử dụng phương pháp phân tích PCR (Polymerase chain reaction):

Các cây sau khi tái sinh được thành cây hoàn chỉnh sẽ tiến hành thu mẫu lá để

tách chiết DNA theo phương pháp của Gilberston và cs [34] và phân tích PCR kiểm

tra sự có mặt của gen Dof1.

Sau khi thu được mẫu DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi Dof1

F3/ Dof1 R3 để kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong cây như sau:

- Chuẩn bị các ống PCR có chứa các thành phần sau:

Bả ng 4: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3

Thể tích Thành phần phản ứng Điều kiện (µl)

Nước 17,375 - Thời gian biến tính ban đầu:

Đệm Taq DNA polymerase 10x 950C, 5 phút. 2,5 (Biolab)

- Lặp lại 35 chu kỳ, mồi chu kỳ dNTP mix (2mM mỗi loại) 0,5 gồm 3 bước:

Mồi Dof F3 10 µM + Biến tính: 950C, 30 giây. 0,5

Mồi Dof R3 10 µM + Gắn mồi: 600C, 30 giây. 0,5

DMSO + Tổng hợp: 680C, 40 giây. 2,5

Taq DNA polymerase Biolab 0,125 - Thời gian tổng hợp sau cùng :

DNA khuôn 680C, 5 phút. 1,0

Tổng 25,0

- Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.

47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 trong điều

kiện nhà lưới

2.2.3.1. Phương pháp đưa cây ra đất và chăm sóc cây trong nhà lưới

- Các cây sắn chuyển gen đã phát triển hoàn chỉnh, có chiều cao khoảng 3-4

cm và có bộ rễ cân đối với lá. Đó là các cây sắn đã đủ tiêu chuẩn để đưa ra trồng

trong nhà lưới.

- Giá thể được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong thời gian 30 phút

- Cây sắn hoàn chỉnh được đưa ra đất trồng với quy trình cơ bản như sau:

Bước 1: Đặt các bình nuôi cấy cây sắn chuyển gen vào các kệ trong nhà lưới để

cây thích nghi dần với điều kiện môi trường bên ngoài

Bước 2: Cho nước sạch vào bình lắc nhẹ để thạch tách ra khỏi rễ cây. Sau đó

lấy cây sắn hoàn chỉnh ra khỏi bình và rửa lại bằng nước sạch 2-3 lần để loại bỏ hết

thạch. Các thao tác được thực hiện nhẹ nhàng để tránh làm tổn thương đến cây và bộ

rễ của cây.

Bước 3: Đặt cây con vào cốc nhựa chứa đất giá thể, lấp đất quanh gốc cây, phun

sương cho ướt lá và giá thể, sau đó đậy cốc nhựa khác để đảm bảo độ ẩm cho cây

con.

Phương pháp tưới nước: Trong thời gian 2 tuần đầu tiên sau khi chuyển cây con

in vitro ra vườn ươm không nên sử dụng phân bón chỉ tưới nước 2 lần/ngày (chủ động

điều chỉnh liều lượng nước tưới tùy theo mùa nắng hay mùa mưa).

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính nông sinh học của cây sắn trồng

ngoài đồng ruộng

Tiến hành thí nghiệm mô tả và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây sắn

tái sinh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp so với cây đối chứng không chuyển gen với

các mốc thời gian là 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng sau khi trồng cây ra nhà lưới và giai

đoạn thu hoạch.

+ Sau trồng 3 tháng: Các chỉ tiêu được mô tả đánh giá bao gồm: Màu lá non,

màu lá mở đầu tiên, lông ở ngọn lá, tập tính sinh trưởng của cây non.

48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Sau trồng 6 tháng: Mô tả các chỉ tiêu: Số lượng thùy lá, dạng thùy trung tâm,

màu sắc lá, gân lá, màu sắc cuống lá, hướng cuống, chiều cao cây, sự phân chạc, ....

Đối với các tính trạng định tính: màu sắc lá, gân lá, màu thân, hình dạng lá,...

dựa vào tài liệu của Fukuda và cs (2010) làm cơ sở mô tả đánh giá.

Đối với các tính trạng định lượng: Chiều cao cây (cm): Đo từ phần mặt đất đến

đỉnh của tán cây.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444

Về mặt lý thuyết, bất kỳ bộ phận nào thu được từ bất kỳ loài thực vật nào cũng

có thể được sử dụng để tạo ra các mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công của quá trình

tạo mô sẹo phụ thuộc vào tính chất đặc trưng của chúng. Việc sử dụng bộ phận nào

làm nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến mức độ thành công và hiệu quả của quá trình

nuôi cấy. Các bộ phận khác nhau của cây đều có thể được sử dụng, tuy nhiên những

bộ phận cây non thường được sử dụng và cho hiệu quả cao nhất. Vì vậy, trong nghiên

cứu này, chúng tôi sử dụng 2 loại nguyên liệu là chồi nách từ thân và thùy lá non từ

chồi đỉnh của cây sắn in vitro để nghiên cứu khả năng tạo FEC của giống sắn TMS

60444. Kết quả thu được thể hiện trên bảng 5 như sau:

Bả ng 5: Kết quả tạo FEC từ chồi nách và thùy lá non cây sắn TMS 60444 in vitro

Số mẫu Loại vật liệu Tỷ lệ tạo FEC (%) Lần TN0 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ trung bình tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ trung bình tạo FEC (%)

1 100 96 63

2 100 98 64 97,7 64,3 Chồi nách

3 100 99 66

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

1 100 94 56

94,7 57,7 2 100 95 58 Thùy lá non

3 100 95 59

Kết quả thu được (bảng 5) cho thấy, khi nuôi cấy cả 2 loại vật liệu là chồi nách

và thùy lá non trong thời gian 2 tuần ở môi trường CIM chứa 12 mg/l picloram thì cả

2 loại vật liệu này đều đã cảm ứng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, chồi nách có thời gian cảm

ứng nhanh hơn, sau 2 tuần hầu như các chồi đều đã cảm ứng tạo mô sẹo với tỷ lệ

trung bình 97,7%, còn với mẫu thùy lá non thời gian cảm ứng tạo mô sẹo lâu hơn,

sau 3 tuần các thùy lá mới cảm ứng tạo mô sẹo hoàn toàn với tỷ lệ tạo mô sẹo 94,7%

thấp hơn không đáng kể so với tỷ lệ tạo mô sẹo bằng chồi nách.

Ở giai đoạn này, tất cả các khối mô sẹo khá giống nhau về màu sắc, tất cả đều

có màu vàng nhạt và có độ nhày cao. Các cụm mô sẹo hình thành từ chồi nách rời rạc

hơn và dễ dàng tách thành từng cụm nhỏ còn các cụm mô sẹo hình thành từ thùy lá

non thì phần lớn tạo thành một khối chặt khó tách nhỏ hơn (hình 13)

Sau 2-3 tuần tạo mô sẹo trong môi trường CIM, các khối mô sẹo sẽ được loại

bỏ hết dịch nhày và chuyển sang môi trường DKW nuôi cấy trong 2 tuần để chọn lọc

các cụm mô sẹo có chất lượng tốt.

Kết quả thu được sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường DKW cho thấy tất cả các

cụm mô sẹo đều phát triển tốt, có màu vàng tươi và bắt đầu có sự phân hóa thành các

dạng phôi khác nhau. Các cụm mô sẹo hình thành từ các mô khác nhau có sự phân

hóa khác nhau. Các cụm hình thành từ chồi nách có tỷ lệ phôi hình tim và hình thủy

lôi cao hơn, các cụm hình thành từ thùy lá non có ít phôi hình tim, phần lớn là phôi

hình thủy lôi và hình lá mầm. Điều này là do các tế bào từ thùy lá non đã phân hóa

nên khả năng phản biệt hóa trở về dạng phôi hình cầu chậm hơn và tạo ra nhiều phôi

hình lá mầm hơn các tế bào ở chồi nách.

Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường DKW các cụm mô sẹo tiếp tục được loại bỏ

dịch nhày và chuyển sang môi trường MMS có chứa 12 mg/l picloram để tạo FEC. Cứ

50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 tuần/lần chuyển các cụm mô sẹo sang môi trường MMS mới. Các cụm FEC từ nguồn

vật liệu chồi nách đã bắt đầu xuất hiện sau 2-3 tuần nuôi cấy trên môi trường MMS.

Với nguồn vật liệu là thùy lá non thì sau 4-5 tuần mới bắt đầu xuất hiện các cụm FEC,

chậm hơn vật liệu chồi nách 1-2 tuần. Đồng thời, tỷ lệ trung bình chồi nách tạo FEC là

64,3% cao hơn đáng kể so với 57,7% tỷ lệ các thùy lá tạo FEC. Các cụm FEC này đều

có màu vàng tươi, tròn như trứng cá, rời rạc và hầu như không có dịch nhày. Khi chuyển

sang môi trường MMS mới các cụm FEC tiếp tục nhân lên tạo ra các quần thể tế bào

khá đồng nhất về mặt hình dạng và kích thước.

Như vậy, trong thí nghiệm này sử dụng chồi nách của giống sắn TMS 60444

làm nguyên liệu tạo FEC mang lại hiệu quả tốt hơn do thời gian cảm ứng tạo mô sẹo

và FEC nhanh hơn, đồng thời tỷ lệ tạo FEC cũng cao hơn khi sử dụng thùy lá non.

Do đó, chúng tôi lựa chọn chồi nách để tạo FEC cho các thí nghiệm biến nạp tiếp

theo

Hình 13: Cụm mô sẹo giống sắn TMS 60444 hình thành và phát triển trên các

trường CIM; C, D: Cụm mô sẹo phát triển trên môi trường DKW.

môi trường từ các nguồn vật liệu khác nhau. A, B: Cụm mô sẹo hình thành trên môi

51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 14: Các khối FEC của TMS 60444 hình thành và phát triển trên môi trường

triển bình thường trên môi trường MMS

MMS; A, C. Cụm FEC bắt đầu hình thành trên môi trường MMS. B, D. Các cụm FEC đang phát

3.2. Kết quả chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444

Trước đây, việc nhiễm Agrobacterium đã được thực hiện bằng cách nhỏ trực

tiếp dịch treo lỏng Agrobacterium vào các cụm FEC trên môi trường rắn [19]. Tuy

nhiên, trong nghiên cứu này, việc nhiễm Agrobacterium đã được sửa đổi bằng cách

ngâm FEC trong dịch treo tế bào Agrobacterium trong 2-4 phút ở nhiệt độ phòng.

Điều này cho phép Agrobacterium tiếp xúc hiệu quả cho quá trình lây nhiễm tiếp theo

trên tế bào FEC tương tự như báo cáo của Nyaboga và cs (2013) và trong các cây

trồng khác như chuối [70].

Khả năng chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc khá nhiều

vào đối tượng cây trồng và nguồn mẫu lây nhiễm. Một số cây trồng, đã sản sinh ra

phytoxic trong quá trình sinh trưởng, chất này có khả năng ức chế rất mạnh sự sinh

trưởng đối với vi khuẩn [37]. Khi được đồng nuôi cấy với FEC của sắn, sự sinh trưởng

của vi khuẩn A. tumefaciens là khá mạnh và không phụ thuộc vào phương pháp lây

nhiễm. Rõ ràng, trên đối tượng này, vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng sinh trưởng và

52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

phát triển. Đây là một thuận lợi cho quá trình lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai

đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh trong quá

trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn lọc sau này sẽ rất khó khăn để

loại bỏ được chính vi khuẩn này. Sau khi đồng nuôi cấy các vi khuẩn nên được loại

bỏ để dừng quá trình chuyển gen nếu không các mô sẹo sẽ bị chết [23]. Vì vậy, cần

xác định được mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen và nồng độ kháng sinh thích

hợp cho việc loại khuẩn thừa sau biến nạp.

3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp

gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444

Các thí nghiệm với các loại mẫu cấy khác nhau của cây sắn cho thấy nồng độ

vi khuẩn cao có thể làm gia tăng sự biểu hiện tạm thời gen chỉ thị nhưng lại không

tương quan với hiệu suất biến nạp. Nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn nồng độ vi khuẩn

tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của mô.

Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn cao là rất cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các

mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm trong thời

gian ngắn, rửa lại nhẹ nhàng với môi trường vô trùng hay thêm vào môi trường các

tác nhân sát khuẩn [88].

Để tìm ra nồng độ khuẩn thích hợp nhất sử dụng cho biến nạp gen Dof1 vào

FEC giống sắn TMS 60444, chúng tôi đã thử nghiệm khả năng kháng hygromycin

của cụm FEC ở các giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7. Thực hiện 3 lần lặp lại thí nghiệm

và ghi nhận kết quả (hình 15). Sai số giữa các lần thí nghiệm được tính bằng hàm

STDEV trên excel.

Kết quả thu được trên hình 15 cho thấy, mật độ dịch khuẩn có ảnh hưởng khác

nhau đáng kể giữa OD600 = 0,25 và 0,5 nhưng không có sự khác nhau đáng kể giữa

OD600 = 0,5 và 0,7. Tại OD600 = 0,25 cho tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin trên môi

trường chọn lọc thấp nhất (Dof1: 12,9% và p1303: 11,6%) chỉ bằng một nửa so với

các mật độ khuẩn OD600 = 0,5 (Dof1: 24,7% và p1303: 24,2%) và OD600 = 0,7 (Dof1:

25,1% và p1303: 25,8%) tổng số mô sẹo được thử nghiệm.

53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 15: Ảnh hưởng của các mật độ dịch khuẩn khác nhau đến khả năng tiếp

lặp lại thí nghiệm độc lập.

nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444. Các giá trị sai khác có ý nghĩa giữa 3 lần

Để xác định mật độ Agrobacterium thấp nhất nhưng hiệu quả nhất phù hợp cho

sự tái sinh của cây chuyển gen, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ

tế bào Agrobacterium khác nhau đến tỷ lệ phôi tái sinh trên môi trường chọn lọc. Mặc

dù tỷ lệ FEC kháng hygromycin cao nhất trong các nghiệm thức là 25,1% (Dof1) và

25,8% (p1303) tại OD600 = 0,7 nhưng tỷ lệ phôi tái sinh chồi kháng hygromycin tại

OD600 = 0,7 với tỷ lệ 17,9 (Dof1) 18,2 (p1303) lại thấp hơn tại OD600 = 0.5 với tỷ lệ

là 22,8 (Dof1) và 21,9 (p1303), đây có thể là do sự phát triển quá mức của vi khuẩn

Agrobacterium. Saini và cs (2007) báo cáo rằng nồng độ Agrobacterium cao hơn có

thể dẫn đến gây phản ứng quá nhạy cảm của mẫu cấy [67]. Dựa vào tỷ lệ mô sẹo

kháng hygromycin và tạo phôi trên môi trường chọn lọc, OD600 = 0.5 đã được chọn

để chuyển gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 giúp cải thiện cả hiệu

quả chuyển gen Dof1 và giảm thiểu sự phát triển quá mức của Agrobacterium trong

nghiên cứu này. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đó về chuyển gen

vào cây sắn [20], [56], [69], [85].

54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng

tiếp nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444

Tích hợp T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào bộ gen mục tiêu là một quá

trình phức tạp: cảm ứng gen vir tối đa được quan sát thấy ở khoảng 25-27oC, tuy

nhiên không phải tất cả các chủng vi khuẩn đều ổn định ở nhiệt độ này, một số chủng

Agrobacterium lại có khả năng chuyển gen ổn định hơn ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng

18-20oC) và không ổn định ở nhiệt độ trên 28oC [33]. Một số báo cáo cho rằng chuyển

gen thông qua Agrobacterium cần được tiến hành ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng

21oC) [27], [41], [65]. Dillen và cs (1997) cũng báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho

chuyển gen phụ thuộc vào sự kết hợp của chủng Agrobacterium và vật liệu thực vật.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen

Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444, trong thí nghiệm này chúng tôi đã

tiến hành đồng nuôi cấy ở bốn chế độ nhiệt khác nhau: 20 oC, 22 oC, 24 oC, 26oC.

Theo dõi khả năng kháng hygromycin của các cụm FEC trên môi trường chọn lọc sau

4 tuần đồng nuôi cấy và khả năng tái sinh của các cụm FEC này sau 8 tuần với 3 lần

lặp lại, kết quả được ghi lại trên hình 16 như sau:

55

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen

Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bốn chế độ nhiệt ở trên cho thấy, nhiệt độ

có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tiếp nhận gen Dof1 của các FEC giống sắn TMS

60444 (hình 16).

Kết quả theo dõi sau 4 tuần cho thấy khi đồng nuôi cấy ở 22oC cho tỷ lệ các

cụm FEC kháng hygromycin là 32,5% (Dof1), 31,9% (p1303) cao hơn đáng kể so với

khi đồng nuôi cấy ở 20oC (11,7% (Dof1), 11,5% (p1303)) và ở 26oC (21,4% (Dof1),

22% (p1303)) nhưng không cao hơn đáng kể so với khi đồng nuôi cấy ở 24oC (30,2%

(Dof1), 30,7% (p1303)).

Để xác định được nhiệt độ đồng nuôi cấy phù hợp nhất cho chuyển gen Dof1 và

tái sinh của cây chuyển gen, chúng tôi tiếp tục theo dõi khả năng tái sinh của các cụm

FEC sau 8 tuần, kết quả cho thấy mặc dù các cụm FEC đồng nuôi cấy ở 22oC cho tỷ

lệ sống sót của các cụm FEC sau 4 tuần là cao nhất so với các nghiệm thức nghiên

cứu và cao hơn ở điều kiện 24oC nhưng tỷ lệ tái sinh của FEC ở 22oC là 12,4% (Dof1),

12,6% (p1303) thấp hơn đáng kể so với các cụm FEC đồng nuôi cấy ở 24oC với tỷ lệ

tái sinh 24,8% (Dof1), 24,3% (p1303). Điều này là do khi đồng nuôi cấy ở nhiệt độ

thấp (22oC) đã kìm hãm khả năng tái sinh của các cụm FEC sau đồng nuôi cấy và ảnh

hưởng đáng kể đến khả năng tạo cây chuyển gen Dof1. Kết quả nghiên cứu này tương

tự như kết quả của Bull và cs (2009) nhưng cao hơn 1-2oC so với một vài nghiên cứu

khác [56], [69], [71], [83].

Dựa vào tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin và tạo phôi trên môi trường chọn lọc,

chế độ nhiệt 24oC đã được chọn làm điều kiện đồng nuôi cấy cho chuyển gen Dof1

vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 ở các thí nghiệm tiếp theo giúp cải thiện

hiệu quả chuyển gen Dof1 và tái sinh cây hoàn chỉnh trong nghiên cứu này.

56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.3. Kết quả nghiên cứu hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của

nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen

Trong quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, các vi khuẩn

này có thể gây ra những sự bất lợi cho FEC trong suốt quá trình đồng nuôi cấy vì vậy

cần thiết phải loại bỏ triệt để các vi khuẩn sau đó phục hồi FEC cho các giai đoạn sau

[20]. Việc bổ sung kháng sinh khi tiến hành diệt vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả

năng tái sinh [37].

Để loại hoàn toàn vi khuẩn Agrobacterium dư thừa sau 4 ngày đồng nuôi cấy

cần có một nồng độ cefotaxime vừa có khả năng diệt khuẩn vừa đảm bảo được sức

sống của mô. Việc lựa chọn được nồng độ kháng sinh thích hợp và xác định ảnh

hưởng của kháng sinh đến khả năng tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen là rất quan

trọng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ kháng sinh

cefotaxime khác nhau đến khả năng loại khuẩn thừa và tiếp nhận gen Dof1 của giống

sắn TMS 60444. Các FEC sau khi đồng nuôi cấy sẽ được rửa trong môi trường MMS

lỏng có chứa kháng sinh cefotaxime ở dải nồng độ: 0 mg/l, 300 mg/l, 400 mg/l, 500

mg/l, 600 mg/l, 700mg/l, cho đến khi dịch trong, sau đó chuyển sang giấy thấm trên

môi trường MMS rắn có chứa cefotaxime ở nồng độ tương ứng để nuôi phục hồi và

loại khuẩn thừa. Việc sử dụng giấy thấm cho phép chuyển các FEC sang môi trường

mới hàng tuần một cách dễ dàng, đồng thời kiểm soát chặt chẽ các thành phần môi

trường cho sự phát triển của FEC như: pH, nồng độ muối và các vitamin, nồng độ

chất kháng sinh.

57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bả ng 6: Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của nó đến tỉ lệ sống sót và khả năng tái sinh của FEC giống sắn

TMS 60444 (sau 8 tuần)

Lượng FEC/ lần Tỷ lệ nhiễm khuẩn Thời gian bắt đầu Nồng độ Tỷ lệ tạo chồi (%) Số lá/cụm (lá) biến nạp (mg) lại (%) tạo chồi (ngày) cefotaxime

(mg/l) Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303

0 200 200 100 100 0 0 0 0 0 0

300 200 200 20,2±0,06 20±0,06 66±0,06 65,7±0,12 25,2±0,06 25,3±0,1 3,5±0,06 3,2±0,06

400 200 200 8,5±0,06 8,6±0,06 68,9±0,06 68,5±0,06 26±0,15 26,3±0,1 3,5±0,1 3,1±0,15

500 200 200 5,8±0,06 5,6±0,1 25,1±0,1 24,6±0,06 27,1±0,1 27±0,06 2,3±0,1 2,1±0,06

600 200 200 15,2±0,06 14,5±0,06 30,1±0,1 30,3±0,06 1,7±0,06 1,5±0,1 0 0

700 200 200 3,6±0,06 3,4±0,06 28±0,06 28±0,12 2,2±0,06 2±0,06 0 0

58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả theo dõi sau 8 tuần (bảng 6) với 3 lần lặp lại thí nghiệm cho thấy, ở

công thức đối chứng không bổ sung cefotaxime các FEC bị nhiễm khuẩn hoàn toàn

không còn khả năng sống sót và tái sinh, tỉ lệ nhiễm khuẩn giảm dần khi tăng nồng

độ cefotaxime ở các nghiệm thức nghiên cứu. Điều đó cho thấy ở nồng độ tương đối

thấp kháng sinh cefotaxime không gây ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mô sẹo

phôi hóa. Vì vậy có thể tiếp tục sử dụng kháng sinh này cho các bước chọn lọc tiếp

theo.

Tuy không gây chết đối với mô sẹo phôi hóa nhưng kháng sinh cefotaxime ức

chế khả năng tái sinh và ảnh hưởng đến thời gian tái sinh chồi từ FEC. Cụ thể, ở công

thức đối chứng không bổ sung cefotaxime thì tỷ lệ FEC sau biến nạp bị nhiễm khuẩn

lại là 100% do đó các FEC hoàn toàn không có khả năng tái sinh. Khi bổ sung chất

kháng sinh cefotaxime ở nồng độ 300 - 700 mg/l các FEC đều có khả năng tái sinh.

Tuy nhiên tỷ lệ tái sinh giảm dần khi tăng nồng độ cefotaxime. Điều này được thể

hiện rõ qua các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển như: tỷ lệ tạo chồi, thời gian tạo chồi,

màu sắc, số lá trên cụm... (bảng 6).

Cụ thể, khi bổ sung 300mg/l cefotaxime thì tỷ lệ nhiễm khuẩn lại giảm xuống

còn khoảng 20% đồng thời tỷ lệ tạo chồi tương đối cao (65-66%). Bổ sung cefotaxime

ở 400 mg/l cho tỷ lệ tạo chồi 68,7% (Dof1) và 68,5% (p1303) cao hơn không đáng

kể nhưng tỷ lệ nhiễm khuẩn lại thấp hơn đáng kể (từ 8,5-8,6%) so với 300 mg/l

cefotaxime thời gian bắt đầu tạo chồi ngắn và số lá trên cụm chồi nhiều (bảng 5).

Tăng nồng độ cefotaxime lên 500mg/l thì tỷ lệ nhiễm khuẩn giảm gần như bằng 0%

tuy nhiên tỷ lệ tạo chồi thấp hơn và thời gian tạo chồi dài hơn so với khi bổ sung các

nồng độ 300mg/l và 400mg/l. Khi tăng nồng độ cefotaxime lên 600-700 mg/l thì tỷ

lệ nhiễm khuẩn lại bằng 0% tuy nhiên tỷ lệ tái sinh rất thấp chỉ khoảng 3-15%. Như

vậy sẽ rất khó thu được cây chuyển gen.

Như vậy nồng độ cefotaxime 400mg/l là nồng độ thích hợp nhất so với các

nghiệm thức nghiên cứu để loại bỏ khuẩn trên cụm mô sẹo phôi hóa sau biến nạp, đồng

thời không gây ức chế mạnh khả năng tái sinh của mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS

60444. Kết quả này cao hơn kết quả nghiên cứu của Ubalua và Mbanaso (2013).

59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2.4. Kết quả khảo sát hiệu quả gây chết của chất chọn lọc hygromycin

Hygromycin B là một kháng sinh aminoglycoside không điển hình với cấu trúc

và chức năng độc đáo [52]. Trong phòng thí nghiệm nó được sử dụng cho chọn lọc

và lưu giữ các tế bào prokaryotic và eukaryotic chứa gen kháng hygromycin. Gen

kháng hygromycin thường được sử dụng như một marker chọn lọc trong nghiên cứu

trên thực vật. Gen kháng là một kinase ức chế hoạt động của hygromycin B thông

qua phosphoryl [60].

Phát triển cây trồng chuyển gen mang các gen quan tâm cho phép chúng ta đi

sâu nghiên cứu chức năng của gen. Vì vậy cần xác định được ngưỡng có tác dụng gây

chết 100% của chất chọn lọc hygromycin lên FEC chưa chuyển gen của giống sắn

TMS 60444 để phục vụ cho chọn lọc các mô đã chuyển gen sau này. Các FEC sau

đồng nuôi cấy và được loại khuẩn thừa sẽ được chuyển sang môi trường MMS có bổ

sung 400 mg/l cefotaxime và kháng sinh hygromycin ở các nồng độ tăng dần từ 0

mg/l; 5 mg/l; 10 mg/l; 15 mg/l; 20 mg/l; 25 mg/l. Theo dõi hiệu quả gây chết của

hygromycin ở các nồng độ sau thời gian 8 tuần với 3 lần lặp lại, kết quả thu được thể

hiện trong hình 17.

Hình 17: Hiệu quả gây chết của hygromycin lên FEC của giống sắn TMS 60444

sau 8 tuần

60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả sau 8 tuần chọn lọc trong môi trường MMS chứa hygromycin ở các

nồng độ khác nhau (hình 18) cho thấy, ở môi trường đối chứng không bổ sung

hygromycin, các cụm FEC không chết mà vẫn tiếp tục nhân lên. Với các môi trường

có bổ sung hygromycin nồng độ 5, 10, 15, 20 mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy, các cụm FEC

chết và giảm dần về số lượng tùy từng nồng độ hygromycin.

Ở nồng độ 5 mg/l và 10 mg/l hygromycin, sau 8 tuần chọn lọc số cụm FEC sống

vẫn còn nhiều tương ứng là 19,3 cụm và 9,7 cụm. Như vậy nồng độ này là chưa đủ

nên cho hiệu quả chọn lọc chưa cao. Còn ở nồng độ 25 mg/l các cụm FEC chết rất

nhanh và đen dần, chỉ sau 4 tuần nuôi cấy các cụm FEC đã chết gần như hoàn toàn

chỉ còn 2,7 cụm sống sót sang đến tuần thứ 5 và đến tuần thứ 6 thì không còn cụm

nào sống sót trên môi trường này. Như vậy, nồng độ này là quá cao cho chọn lọc FEC

của sắn, khi chọn lọc ở nồng độ này các cụm FEC yếu sẽ nhanh chóng bị giết chết

mà các cụm này có thể mang gen chuyển. Với nồng độ 15 mg/l hygromycin cho hiệu

quả tương đối tốt, các cụm FEC chết dần dần qua các tuần, vì vậy có thể đảm bảo

thời gian hồi phục cho các cụm FEC yếu mang gen chuyển sau thời gian đồng nuôi

cấy sau này. Tuy nhiên, sau 8 tuần chọn lọc vẫn còn một vài cụm FEC sống sót, do

đó việc chọn lọc sẽ mất nhiều thời gian và chưa thể chọn lọc triệt để các mô chưa

chuyển gen. Với nồng độ 20 mg/l hygromycin các cụm FEC chuyển màu vàng đậm,

khô dần và chết trong thời gian nuôi cấy, do đó, các cụm yếu sẽ có thời gian để hồi

phục. Sau 6 tuần các cụm gần như chết hoàn toàn, sang đến tuần thứ 8 thì ở nồng độ

20 mg/l các cụm FEC đã chết hoàn toàn. Kết quả này cao hơn ở trong các nghiên cứu

trước đó [20], [56]. Tuy nhiên, chọn lọc ở nồng độ này sẽ rút ngắn được thời gian và

chọn lọc triệt để hơn các cụm chưa chuyển gen so với nồng độ 15 mg/l hygromycin.

Như vậy, ở trong thí nghiệm này, bổ sung nồng độ 20 mg/l hygromycin là thích hợp

nhất cho việc chọn lọc các dòng chuyển gen sau này.

61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 18: Các cụm FEC trong môi trường MMS bổ sung hygromycin ở các nồng

hygromycin; B. 5 mg/l hygromycin; C. 10 mg/l hygromycin; D. 15 mg/l hygromycin; E. 20 mg/l

hygromycin; F. 25 mg/l hygromycin.

độ khác nhau sau 8 tuần chọn lọc (mũi tên chỉ cụm FEC còn sống); A. 0 mg/l

Nguyên nhân là do trong bộ gen của các cụm FEC chưa chuyển gen không chứa

gen kháng hygromycin, nên khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung

hygromycin ở nồng độ thích hợp thì các cụm FEC không có khả năng kháng lại và sẽ

yếu dần rồi chết. Trong khi đó, các cụm FEC được chuyển gen sẽ mang một đoạn gen

kháng hygromycin, do đó chúng có khả năng sống sót, nhân lên và tái sinh trong môi

trường chứa hygromycin. Quá trình thử FEC ở các nồng độ khác nhau giúp chọn ra

được nồng độ hygromycin thích hợp nhất cho việc chọn lọc các cụm FEC sau chuyển

gen: nồng độ hygromycin phải vừa đủ để làm cho các cụm FEC không chuyển gen

chết hoàn toàn, và cũng không được quá lớn vì sẽ ức chế khả năng phát triển tốt của

cả các cụm FEC đã mang gen chuyển.

3.2.5. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen sau biến nạp

Bước chọn lọc sau khi chuyển gen là bước quan trọng nhất để xác định cây

chuyển gen và cây không chuyển gen [28]. Sau khi loại khuẩn thừa trên môi trường

62

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

MMS có chứa 400 mg/l cefotaxime (C400), các mẫu FEC được chuyển sang môi

trường MMS chứa kháng sinh hygromycin ở nồng độ thấp 10mg/l (MMS + C400 +

H10) trong 1 tuần; sau đó tăng dần nồng độ hygromycin lên mỗi tuần sau đó (MMS

+ C400 + H15, rồi MMS + C400 + H20). Cuối cùng chuyển sang môi trường tái sinh

MSN + C400 + H20 và theo dõi, do hygomycin bị phân hủy bởi nhiệt và ánh sáng

nên sau khi chuyển FEC sang môi trường tái sinh phải 2 tuần/lần cấy chuyển sang

môi trường mới. Quá trình này tạo ra một môi trường ngày càng khắt khe cho phép

các cụm FEC biểu hiện gen kháng kháng sinh và bắt đầu phân chia tế bào. Bắt đầu

theo dõi quá trình chọn lọc và ghi nhận kết quả sau 3 lần biến nạp (mỗi lần biến nạp

sử dụng 100 mg FEC cho mỗi vector):

Bả ng 7: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường chứa hygromycin

Tỷ lệ cụm FEC nảy mầm (%) Lượng FEC được chọn lọc (mg) Số cây tái sinh (cây) TN0

Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303

100 1 100 36,7 ± 1,2 19,3 ± 1,4 7 2

100 2 100 36,1 ± 1,0 19,8 ± 1,0 5 3

100 3 100 37,0 ± 1,2 20,1 ± 1,2 6 1

Trong giai đoạn chọn lọc, để tạo điều kiện cho các cụm FEC yếu sau đồng nuôi

cấy có thời gian hồi phục và làm quen dần trên môi trường chọn lọc, trong tuần đầu

tiên các cụm FEC chuyển gen được chọn lọc trên môi trường MMS ở nồng độ

hygromycin thấp 10 mg/l, do đó các cụm FEC đều vẫn tươi và có sự phân chia tăng

sinh về kích thước. Sang tuần thứ 2 nồng độ hygromycin được tăng dần lên 15mg/l

bắt đầu có một vài cụm FEC dừng tăng sinh và hơi sậm màu hơn. Đến tuần thứ 3 tiếp

tục nâng nồng độ hygromycin lên 20 mg/l thì chỉ còn một số cụm FEC vẫn tiếp tục

nhân lên, hầu hết các cụm FEC còn lại đều không nhân lên và trở nên sậm màu (hình

19).

63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 19: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường tái sinh (MSN) chứa

hygromycin qua các giai đoạn khác nhau.

Khi chuyển sang môi trường tái sinh (MSN + C400 + H20) ở tuần thứ tư thì

hiệu quả chọn lọc của hygromycin bắt đầu thể hiện rõ rệt hơn, một vài cụm đang

phân chia bắt đầu chuyển sang giai đoạn biệt hóa thành các dạng phôi thứ cấp, các

cụm còn lại bắt đầu chết và đen dần. Ở giai đoạn tái sinh này, cứ sau 2 tuần tiếp tục

64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

chuyển các cụm FEC sang môi trường tái sinh mới (MSN + C400 + H20). Đến tuần

thứ 6 các phôi bắt đầu nảy mầm và bắt đầu xuất hiện các cụm lá xanh (hình 19) với

tỷ lệ tái sinh của các cụm giả định mang gen Dof1 và các cụm mang vector trống

p1303 tương ứng là 36,67% và 19,33%. Từ các cụm lá này, sau 2 tuần tiếp theo bắt

đầu xuất hiện các chồi thật ở tuần thứ 8 (hình 19). Sự nảy mầm của phôi soma được

đi kèm bởi sự hoạt động biểu hiện của vô số các gen mã hóa quang hợp và các thành

phần của lục lạp [19]. Thời gian khác nhau trong kích hoạt của các gen này có thể

gây ra sự thay đổi trong sự nảy mầm của phôi soma giống sắn TMS 60444. Các dòng

chuyển gen được tái sinh trong khoảng thời gian 3-4 tháng sau khi đồng nuôi cấy.

Kết quả chúng tôi đã thu được 18 dòng T0 (được đánh số từ dòng D1-D18) và 6

dòng T0 (đánh số từ T1-T6) giả định đã mang tương ứng vector mang gen Dof1 và

mang vector trống p1303, do các cây này có khả năng kháng lại và sống sót trên môi

trường chọn lọc với 20mg/l hygromycin. Kết quả này tương đương với kết quả của

Taylor và cs (2012) thu được 14-28 dòng chuyển gen trên mỗi cm3 khối lượng ổn

định FEC của TMS 60444 nhưng thấp hơn của Bull và cs (2009) với 50 dòng chuyển

gen từ 100 cụm FEC giống sắn TMS 60444. Các kết quả nghiên cứu từ trước cùng

với kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng, sự tái sinh của cây sắn từ phôi

soma là một việc hết sức khó khăn, đặc biệt là do tần số nảy mầm của phôi thấp.

Khi các cây con thu được đã có chiều cao khoảng 1-2 cm tiến hành cắt và chuyển

các cây này sang môi trường kéo dài chồi (CEM) để tạo cây hoàn chỉnh.

3.2.6. Kết quả sàng lọc và phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong

cây sau chuyển gen

 Kết quả sàng lọc thông qua kiểm tra sự tạo rễ:

Sau khi thu được các dòng chuyển gen, để xác định sự có mặt của gen chuyển

trong cây, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc nhanh các dòng chuyển gen

kháng hygromycin bằng cách cắt các chồi ngọn cấy chuyển sang môi trường MS +

C400 + H20 để kiểm tra sự ra rễ [84]. Để đảm bảo môi trường sàng lọc có hiệu quả,

các cây TMS 60444 chưa chuyển gen cũng được sử dụng như đối chứng âm.

65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Theo dõi kết quả sau 2 tuần cho thấy 100% cây chuyển gen đã phát triển rễ mới

(và số lá cũng nhiều hơn) trên môi trường chứa hygromycin, trong khi các cây không

được chuyển gen vẫn không có rễ và cuối cùng cây không sinh trưởng được, mất màu

và chết (hình 20). Điều này chứng tỏ gen đã được chuyển vào trong cây nên các cây

này có khả năng kháng lại hygromycin và vẫn sinh trưởng tốt. Còn các cây đối chứng

không chuyển gen, do trong hệ gen của cây không có gen kháng hygromycin nên

nhanh chóng mất màu và chết trên môi trường chứa chất kháng sinh này.

Việc kiểm tra sự ra rễ là một bước sàng lọc nhanh chóng và chính xác sự khác

biệt giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen trước khi tiến hành .

Hình 20: Kết quả kiểm tra sự ra rễ của cây chuyển gen Dof1 trên môi trường

chứa kháng sinh hygromycin

 Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây sắn chuyển gen Dof1

Thí nghiệm sàng lọc sự ra rễ trên môi trường chứa hygromycin đã chứng tỏ gen

đã được chuyển vào cây. Tuy nhiên đây chỉ là kết quả tạm thời. Mặc dù hiệu suất

chuyển gen không cao nhưng biểu hiện của gen chuyển trong phương pháp chuyển

gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens lại rất bền vững nhờ gen đích được gắn trực

tiếp vào bộ gen của tế bào thực vật.

Vì vậy, sau khi sàng lọc trên môi trường MMS chứa hygromycin, các cây

chuyển gen sống sót sẽ được tách DNA tổng số của các cây chuyển gen thu được

phục vụ cho việc phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 và gen HPT trong

cây. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết bằng CTAB của CIAT và tách

thành công DNA tổng số từ mô lá non của cây sắn chuyển gen Dof1 và cây chuyển

66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

vector trống p1303 mang gen chỉ thị HPT. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

0,8%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm.

Kết quả điện di được minh họa trong hình 21:

DNA tổng số cây TMS 60444 chuyển gen Dof1; Giếng 19-24: DNA tổng số cây TMS 60444 chuyển

vector p1303 mang gen HPT

Hình 21: Kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra cây chuyển gen Dof1. Giếng 1-18:

Hình ảnh điện di và nhuộm ethidium bromide cho thấy các băng ADN tổng số

tương đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao, ít bị đứt gãy và

sạch. Một số mẫu tuy có vệt đứt gãy nhưng băng vẫn sáng rõ, cả 24 mẫu đều đủ điều

kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của các gen chuyển trong cây

Để phát hiện sự có mặt của gen chuyển Dof1 và HPT, chúng tôi tiến hành phản

ứng PCR kiểm tra các mẫu DNA tổng số đã tách sử dụng cặp mồi Dof1 F3/Dof1 R3

và HPT F3/ HPT R3 bắt cặp đặc hiệu với trình tự 35S promoter và Nos terminator

nằm trên cấu trúc T-DNA của pCAMBIA Dof1 và pCAMBIA 1303 với đối chứng

dương là plasmid chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA

67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Dof1 và chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA 1303 và đối

chứng âm là DNA tổng số của cây đối chứng không chuyển gen. Điện di kiểm tra sản

phẩm trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở

bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 22 và hình 23:

Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HPT trong

chuyển gen Dof1; Giếng 10-12 và 22-24: mẫu DNA tổng số cây chuyển vector trống p1303; Giếng

các cây chuyển gen. Giếng M: thang chuẩn 1kb; Giếng 1-9 và 13-21: mẫu DNA tổng số cây

(+): plasmid vi khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1; Giếng (++): plasmid vi khuẩn mang vector

pCAMBIA 1303; Giếng (-): H2O; Giếng (--): mẫu DNA tổng số cây đối chứng không chuyển gen.

68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 23: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong các cây chuyển gen.

69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả trên ảnh điện di (hình 22 và hình 23) cho thấy:

Giếng (-): tất cả các giếng đối chứng âm (sử dụng nước tinh khiết thay cho

ADN) không xuất hiện băng, chứng tỏ hỗn hợp phản ứng PCR không bị nhiễm tạp.

Giếng (--): sử dụng ADN tổng số của cây kiểu dại làm khuôn cho phản ứng

PCR, kết quả điện di không thấy xuất hiện băng. Giếng (+) và (++): sử dụng plasmid

của khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1 (mang gen Dof1 và gen chỉ thị HPT) và

plasmid khuẩn mang vector trống pCAMBIA 1303 (chỉ mang gen chỉ thị HPT), kết

quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi HPT F3/ HPT R3 tất cả các giếng đều lên

băng sáng rõ, còn sản phẩm PCR với cặp mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 thì chỉ plasmid của

khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1 lên băng còn plasmid của khuẩn mang vector

pCAMBIA 1303 không lên băng, chứng tỏ các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR

đặc hiệu cho gen Dof1 và gen chỉ thị HPT.

Các giếng từ 1-24 (hình 22) và giếng 1-18 (hình 23): sử dụng DNA tổng số của

các cây chuyển gen làm khuôn cho phản ứng PCR, băng ADN thu được có kích thước

mong đợi, sáng và rõ nét, chứng tỏ gen đã được chuyển thành công vào cây sắn TMS

60444. Do đó, chúng tôi sử dụng các dòng cây chuyển gen này để nhân vô tính tạo

số lượng lớn hơn trước khi đưa ra vườn ươm trồng và đánh giá các đặc tính nông sinh

học của cây chuyển gen Dof1.

3.3. Kết quả đưa cây ra vườn ươm và đánh giá các đặc tính nông sinh học của

cây chuyển gen Dof1

3.3.1. Kết quả đưa cây ra vườn ươm

Các cây sắn TMS 60444 chuyển gen Dof1 sau khi kiểm tra sự có mặt của gen

Dof1 và có bộ rễ khoảng 3-4 cm, tiến hành tập làm quen với môi trường bên ngoài

trong khoảng 2-4 tuần. Sau đó, tiến hành thí nghiệm đưa cây ra bầu đất với giá thể

đất pha cát (tỷ lệ đất : cát là 2:1), để đánh giá các đặc tính nông sinh học của các

cây chuyển gen Dof1 trong nhà lưới. Sử dụng các cây TMS 60444 in vitro không

chuyển gen làm đối chứng. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 8 và hình 24:

70

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bả ng 8: Kết quả đưa cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 ra nhà lưới sau 1 tháng

Số cây đưa ra bầu Số cây sống sót Tỷ lệ sống sót Lần TN0 ĐC Dof1 ĐC Dof1 ĐC Dof1

18 Lần 1 18 18 83,3% 100% 15

18 Lần 2 18 17 77,8% 94,4% 14

18 Lần 3 18 16 66,7% 88,9% 12

Hình 24: Kết quả đưa cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng ra đất sau 1 tháng.

A. Cây trước khi ra đất; B. Cây trồng trong bầu đất sau 1 tuần; C. Cây trồng trong nhà lưới sau 1 tháng.

Kết quả thu được cho thấy, sau 1 tháng đưa cây ra nhà lưới ở cả 3 lần ra cây tỷ

lệ sống sót của cây chuyển gen Dof1 đều đạt cao hơn đáng kể so với cây đối chứng

không chuyển gen.

Lần ra cây đầu tiên, các cây chuyển gen Dof1 có tỷ lệ sống sót rất cao (100%)

khỏe mạnh, thân mập và lá xanh, còn các cây đối chứng không chuyển gen do không

thích ứng được với điều kiện thời tiết của vùng nên nhiều cây có sức sống kém hơn

71

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

với tỷ lệ sống sót chỉ đạt 83,3%, thân mảnh và lá hơi vàng. Điều này có thể là do sự

biểu hiện của gen Dof1 trong cây đã giúp cây có sức sống cao hơn các cây đối chứng.

Ở các lần ra cây thứ 2 và thứ 3 do thời tiết nắng nóng hơn nên tỷ lệ sống sót của

cả cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng đều bị giảm xuống tương ứng là 94,4%,

77,8% trong lần thứ 2 và lần 3 giảm xuống còn 88,9% và 66,7% số cây sống sót. Các

cây sống sót đều phát triển tốt. Tiếp tục theo dõi sự phát triển của các cây trong nhà

lưới để đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 so với cây đối

chứng không chuyển gen qua các giai đoạn.

3.3.2. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế

hệ T0 sau 3 tháng trồng ra vườn ươm

Theo dõi sự phát triển của các cây chuyển gen Dof1 trồng trong điều kiện nhà

lưới, sau 3 tháng tiến hành quan sát và đánh giá các đặc điểm hình thái cây chuyển

gen Dof1 so với cây đối chứng theo phương pháp đánh giá của Fukuda và cs (2010)

và ghi lại kết quả theo bảng 9 và hình 25 như sau:

Bả ng 9: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau

3 tháng trồng trong nhà lưới

Các chỉ tiêu đánh giá Dof1 ĐC

Màu lá ngọn Xanh nhạt Xanh tía

Có Lông lá ngọn Có

Xanh phớt đỏ Màu cuống Xanh

Cao cây (cm) 50,6 ± 1,7 72,4 ± 1,9

7 Số thùy lá 5

Ngang Hướng cuống Lên

72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 25: Cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 3 tháng trồng trong

nhà lưới. A, B. Hình dạng và màu sắc lá; C, D. Màu sắc lá ngọn; E, F. Màu sắc thân, cuống

và hướng cuống.

73

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Qua quan sát và đánh giá các cây con 3 tháng tuổi trong nhà lưới, chúng tôi

nhận thấy, tất cả các cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng đều phát triển tốt, thân

và lá xanh, đều có lông ở lá ngọn và đều có 5 thùy lá. Tuy nhiên, các cây chuyển gen

Dof1 có một số khác biệt cơ bản về hình thái so với cây đối chứng như: màu sắc lá

ngọn, màu sắc lá và cuống lá, hình dạng lá, chiều cao cây.

Cụ thể, về màu sắc, các cây chuyển gen Dof1 có lá ngọn màu xanh nhạt, thân

và lá có màu xanh đậm, cuống lá hướng lên và có màu xanh, khác hoàn toàn so với

đối chứng với lá ngọn xanh tía, thân và lá xanh nhạt, cuống lá hướng ngang và có

màu xanh phớt đỏ.

Về chiều cao cây, sau khi quan sát và đo chiều cao cây, chúng tôi thấy sau 3

tháng trồng trong nhà lưới các cây chuyển gen Dof1 có chiều cao trung bình (50,6

cm) thấp hơn đáng kể so với các cây đối chứng (72,4 cm), đồng thời các đốt thân của

cây chuyển gen cũng dày hơn so với cây đối chứng. Những khác biệt này có thể sẽ là

những tính trạng có lợi của cây chuyển gen sau này giúp giảm chiều cao cây so với

cây đối chứng.

Đặc biệt, tất cả các cây chuyển gen Dof1 đồng loạt có mép lá cong rủ, cụp xuống

dưới trong khi các cây đối chứng có mép lá phẳng. Điều này có thể là do sự siêu biểu

hiện của promoter 35S trong cây chuyển gen đã làm cho cây biểu hiện kiểu hình khác

cây đối chứng. Cần tiếp tục theo dõi thêm sự biểu hiện kiểu hình của các cây chuyển

gen để đánh giá.

Như vậy, sau 3 tháng trồng ra nhà lưới, các cây chuyển gen Dof1 đã có biểu

hiện một vài sự khác biệt rất rõ ràng so với cây đối chứng về cả màu sắc, hình dạng,

số thùy lá và chiều cao cây.

3.3.3. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế

hệ T0 sau 6 tháng trồng ra nhà lưới.

Tiếp tục theo dõi và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen

Dof1 trong nhà lưới ở các giai đoạn khác nhau, kết quả đánh giá sau 6 tháng trồng

được ghi lại trong bảng 10:

74

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bả ng 10: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau

6 tháng so với đối chứng trong điều kiện nhà lưới

Dof1 ĐC Chỉ tiêu theo dõi

Kém Trung bình Độ bền lá

Dạng thùy lá giữa Ngọn giáo Mác elip

Xanh Xanh phớt đỏ Màu cuống

Xanh đậm Xanh nhạt Màu lá

7 9 Số thùy lá

Mượt Mượt Viền lá

Xanh Xanh phớt đỏ Màu gân lá

Hướng cuống Không đều Không đều

Cao cây (cm) 123,7 ± 11,2 192,5 ± 8,9

Sự phân chạc Không phân chạc Phân chạc

Kiểu chạc Mọc thẳng đứng 2-4

Hoa Chưa có Chưa có

Kết quả theo dõi sau 6 tháng trồng trong nhà lưới thể hiện trong bảng 10, hình

26 và hình 27 cho thấy các cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng đều phát triển khá

tốt, các cây đều chưa có hoa, viền lá mượt, hướng cuống không đều. Tất cả các cây

chuyển gen Dof1 phát triển khá đồng đều nhau cả về hình thái cũng như sự phát triển

và có sự khác biệt đáng kể so với đối chứng về nhiều đặc điểm như: màu sắc, hình

dạng, chiều cao, số lượng thùy lá và sự phân chạc.

Đa số các cây mang gen Dof1 có thân, lá ngọn, gân lá và cuống lá đều có màu

xanh nhạt, lá trưởng thành có màu xanh đậm, lá giữa có dạng hình ngọn giáo. Trong

khi tất cả các cây đối chứng có thân và lá trưởng thành màu xanh nhạt còn lá ngọn và

75

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

cuống lá có màu xanh phớt đỏ, lá giữa có dạng hình mác elip. Tuy nhiên khả năng

giữ lá của các cây chuyển gen Dof1 kém hơn các cây đối chứng.

Ở giai đoạn này, các cây chuyển gen Dof1 và các cây đối chứng đã có sự chênh

lệch đáng kể về chiều cao cây trung bình so với giai đoạn 3 tháng tuổi, các cây chuyển

gen Dof1 có chiều cao trung bình (123,7 cm) thấp hơn so với cây đối chứng (192,5

cm), đồng thời các cây chuyển gen Dof1 có kiểu hình mọc thẳng không phân chạc

trong khi các cây đối chứng hầu hết có sự phân chạc từ 2-4 chạc, tán xòe rộng dẫn

đến tốn nhiều diện tích trồng sắn hơn các cây chuyển gen Dof1. Có thể thấy, đây là

một tính trạng có lợi của cây chuyển gen Dof1 giúp tiết kiệm diện tích, tăng mật độ

trồng sắn, và có tiềm năng mang lại năng suất tốt hơn trên một đơn vị diện tích canh

tác so với đối chứng.

Như vậy, sau 6 tháng trồng trong nhà lưới, các cây chuyển gen Dof1 đều đã

thích ứng được với điều kiện khí hậu của vùng và phát triển rất tốt, thể hiện nhiều đặc

điểm khác biệt và có lợi hơn so với các cây đối chứng. Các cây này sẽ được theo dõi

và đánh giá tiếp trong các giai đoạn 9 tháng và khi thu hoạch để phát hiện thêm các

đặc điểm có lợi của cây chuyển gen Dof1 so với cây đối chứng.

76

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 26: Các cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 6 tháng

trồng trong nhà lưới.

Hình 27: Một số hình ảnh về sự phân chạc của cây đối chứng (vòng tròn đỏ biểu

thị vị trí phân chạc).

77

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

KẾT LUẬN

1. Tạo thành công FEC giống sắn TMS 60444, chồi nách của giống sắn TMS 60444

cho hiệu quả tạo FEC cao hơn và hết ít thời gian hơn thùy lá non.

2. Mật độ khuẩn OD600 = 0,5 là thích hợp cho chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn

TMS 60444; nồng độ 400 mg/l cefotaxime thích hợp cho loại khuẩn thừa sau biến

nạp; nồng độ 20 mg/l hygromycine là ngưỡng gây chết 100% đối với FEC giống sắn

TMS 60444 được dùng để chọn lọc cây chuyển gen Dof1.

3. Qua nghiên cứu chuyển gen chúng tôi đã tạo thành công 18 dòng cây sắn chuyển

gen Dof1 và đưa các dòng cây sắn chuyển gen Dof1 thế hệ T0 ra trồng tại nhà lưới.

4. Cây chuyển gen Dof1 có các đặc tính nông sinh học khác với cây đối chứng: lá

ngọn màu xanh nhạt, lá màu xanh đậm, xẻ 5-7 thùy, thùy lá trung tâm có dạng hình

ngọn giáo, gân lá và cuống lá màu xanh khác với cây đối chứng có lá ngọn màu xanh

tía, lá màu xanh nhạt, xẻ 7-9 thùy, thùy lá trung tâm có dạng hình mác elip, gân lá và

cuống lá có màu xanh phớt đỏ.

KIẾN NGHỊ

- Tiến hành các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử (southern blot, northern

blot…) để kiểm tra các cây chuyển gen

- Tiếp tục theo dõi và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen

Dof1 thế hệ T0 và các thế hệ tiếp theo.

78

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Tiến hành các thí nghiệm hóa sinh phân tích hàm lượng protein, axit amin

trong cây chuyển gen Dof1 so với cây đối chứng không chuyển gen.

79

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008), “Xây

dựng quy trình biến nạp gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì

(Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”, Tạp chí phát triển

KH&CN, 11(1), tr. 90-95.

2. Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2005), Tinh bột sắn và các

sản phẩm từ tinh bột sắn, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật.

3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật

trong cải tiến giống cây trồng-Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp.

4. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005),

Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp I.

5. Nguyễn Thị Hòa Vân (2009), Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAc

vào cây hoa đồng tiền, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nông nghiệp.

6. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Hưng Quang (2011), Hiện trạng sử dụng sắn

và phụ phẩm từ sắn trong chăn nuôi gia súc nhai lại tại Việt Nam, Tạp chí Khoa

học và công nghệ, 82(06): 59 – 63.

7. Nguyễn Văn Đồng và Lê Thị Thủy (2013), Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế

bào trong việc nhân nhanh một số giống sắn sạch bệnh, Tạp chí Nông nghiệp và

phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 5/2013.

8. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Tiến Dũng, Tống Thị Hường, Lê Thị

Ngọc Quỳnh, Lê Thị Lý, Vũ Anh Thu, Vũ Hoàng Nam, Vũ Thế Hà, Lê Huy Hàm,

Chikako Utsumi, Yoshinori Utsumi, Motoaki Seki (2014), Kết quả tạo mô sẹo

phôi hóa phục vụ cho chuyển gien vào cây sắn, Tạp chí Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn, 8(1):29-35, 2014; Đính chính: Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, 9(2):147–148, 2015.

80

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

9. Phạm Văn Biên và Hoàng Kim (1995), Cây sắn, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí

Minh.

10. Quách Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Đức Doanh, Nhữ Viết Cường, Hoàng Thị

Ngát, Lê Thị Ánh Hồng (2006), Một số kết quả về chuyển gen kháng nấm

Chitinase gluconase vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens,

Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20, 41-44.

11. Tổng cục thống kê (2014), Niên giám thống kê, NXB Thống kê.

12. Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình cây sắn, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

13. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển

gen (động vật, thực vật), Đại học Huế.

14. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công nghệ

gen trong Nông nghiệp, Đại học Huế.

15. Trần Văn Minh (2003), Công nghệ sinh học thực vật, Giáo trình cao học – nghiên

cứu sinh, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

16. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4 – Công nghệ sinh học di truyền,

Nxb Giáo Dục.

Tài liệu tiếng Anh

17. Abrahamian P. and Kantharajah A. (2011), "Effect of Vitamins on In Vitro

Organogenesis of Plant", American Journal of Plant Sciences, 2, pp. 669-674.

18. Allem, A.C. (2002), "The Origins and Taxonomy of Cassava", in Cassava:

Biology, Production and Utilization, (Eds). R.J. Hillocks, J.M. Thresh, and A.C.

Bellotti. CABI Publishing: New York, USA, pp. 1-16.

19. Baba A. I., Nogueira F. C. S., Pinheiro C. B., Brasil J. N., Jereissati E. S., Jucá

T. L., Soares A. A., Santos M. F., Domont G. B. And Campos F. A. P. (2008),

Proteome analysis of secondary somatic embryogenesis in cassava (Manihot

esculenta), Plant Sci., 175, 717–723. doi: 10.1016/j.plantsci.2008.07.014.

81

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

20. Bull S. E., Owiti J. A., Niklaus M., Beeching J. R., Gruissem W. and

Vanderschuren H. (2009). Agrobacterium-mediated transformation of friable

embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava, Nat. Protoc., 4,

1845–1854. doi: 10.1038/nprot.2009.208.

21. Ceballos H., Iglesias C. A., Perez J. C. and Dixon A. G. O. (2004), Cassava

breeding: opportunities and challenges, Plant Mol. Biol., 56: 503-16; PMID:

15630615; http:// dx.doi.org/10.1007/ s11103-004-5010-5.

22. Ceballos H. and G. de la Cruz (2012), "Cassava Taxonomy and Morphology", in

Ospina B. and Ceballos H. (Eds), Cassava in the Third Millenium: Modern

Production, Processing, Use and Market System,. CIAT. Vol. 377, CIAT

Publication: Colombia, pp. 15-28.

23. Cheng M., Brenda A. L., Spencer T. M., Xudong Ye and Charles L. Armstrong.

(2004), Invited review: Factors influencing Agrobacterium-mediated

transformation of monocotyledonous species. In Vitro Cellular and

Developmental Biology-Plant, 40: 31–45.

24. Cock J. H. (1982), Cassava: a basic energy source in the tropics, Science, 218,

755–762.

25. Coruzzi G. M. & Zhou L. (2001), Carbon and nitrogen sensing and signaling in

plants: emerging ‘matrix effects’, Curr. Opin. Plant Biol. 4 , 247-253.

26. Dai D., Hu Z., Pu G., Li H., Wang C. (2006), Energy efficiency and potentials of

cassava fuel ethanol in Guangxi region of China, Energy Convers Manage 47:

1686–1699.

27. Dillen W., De Clercq J., Kapila J., Zambre M., Van Montagu M., Angenon G.

(1997), The effect of temperature on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene

transfer to plants, Plant J., 12:1459–1463

28. EE S. F., Khairunnisa M. B., Zeti-Azura M. H., Noor Azmi S. and Zamri Z.

(2014), Effective hygromycin concentration for selection of Agrobacterium-

mediated transgenic Arabidopsis thaliana, Malaysian Applied Biology, 43 (1).

pp. 119-123, ISSN 0126-8643.

82

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

29. Fauquet C. M. (2008), Cassava: A Gift to the World and a Challenge for

Scientists. Paper presented at “Cassava meeting the challenges of the new

millennium” hosted by IPBO- Ghent University, Belgium, 21-25.

30. Foyer, C. H. & Ferrario, S. (1994), Modulation of carbon and nitrogen

metabolism in transgenic plants with a view to improved biomass

production, Biochem. Soc. Trans., 22 , 909-915.

31. Fukuda W. M. G., Guevara C. L., Kawuki R. and Ferguson M. E. (2010), Selected

morphological and agronomic descriptors for the characterization of cassava,

International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria, 19pp.

32. Gallardo F., Fu J., Canton F. R., Garcia-Gutierrez A., Canovas F. M. & Kirby E.

G. (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic

poplar, Planta, 210 , 19-26.

33. Gelvin S. B. (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology

behind the ‘‘gene-jockeying’’ tool, Microbiol Mol Biol Rev, 67:16–37.

34. Gilberston R. L.; Rojas M.R.; Russell D.; Maxwell D. P. (1991), The use of the

asymmetric polymerase chain reaction and DNA sequencing to determinate

genetic variability among isolates of bean golden mosaic geminivirus in the

Dominican Republic, J. Gen. Virol., 72: 2843-2848.

35. González A. E., Schöpke C., Beachy N. R. N., MIFauquet C. (1998),

Regeneration of transgenic plants (Manihot esculenta. Crantz) through

Agrobacterium mediated transformation of embryogenic suspension cultures,

Plant Cell Rep, 17: 827–831.

36. Hoang Kim, Le Huy Ham, Manabu Ishitani, Hernan Ceballos, Nguyen Van Bo,

Tran Ngoc Ngoan, Kazuo Kawano, Reinhardt Howeler, Rod Lefroy, Nguyen

Phuong, Hoang Long, Nguyen Thi Le Dung, Tran Cong Khanh, Vo Van Quang,

Dao Trong Tuan, Nguyen Minh Cuong, Nguyen Van Vu and Nguyen Van Dong

(2013). Vietnam cassava breeding overview: the broad perspective. Presentation

to Kickoff Meeting of a Cooperative Research Project under the East Asia Joint

Research Program (e-ASIA JRP) at AGI, Hanoi on Jan.8 and 9, 2013.

83

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

37. Hoshi Y., Kondo M., Mori S., Adachi Y., Nakano M. and Kobayashi H. (2004),

"Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated

transformation", Plant Cell Rep, 22 (6), pp. 359-364.

38. Howeler R. và Aye T. M. (2015), Sustainable management of cassava in Asia –

From research to practice, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT),

396, 148p.

39. Ihemere U., Arias-Garzon D., Lawrence S. and Sayre R. (2006), Genetic

modification of cassava for enhanced starch production, Plant Biotechnology

Journal, 4, pp. 453–465.

40. Jaglo-Ottosen K. R., Gilmour S. J., Zarka D. G., Schabenberger O. &

Thomashow M. F. (1998), Arabidopsis CBF1 overexpression

inducees COR genes and enhances freezing tolerance, Science, 280, 104-106.

41. Jin S. X., Zhang X. L., Liang S. G., Nie Y. C., Guo X. P., Huang C. (2005),

Factors affecting transformation efficiency of embryogenic callus of Upland

cotton (Gossypium hirsutum) with Agrobacterium tumefaciens, Plant Cell Tissue

Organ Cult, 81:229-237.

42. Joseph R., Yeoh H.-H. and C.-S. (2004), Loh Induced mutations in cassava using

somatic embryos and the identification of mutant plants with altered starch yield

and composition. Plant Cell Reports 23(1-2): 91-98.

43. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. & Shinozaki K. (1998),

Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single

stress-inducible transcription factor. Nat. Biotechnol. 17, 287-291.

44. Katagiri F., and Chua N. H. (1992), Plant transcription factors: Present

knowledge and future challenges, Trends Genet, 8, 22–27.

45. Koehorst-van Putten H. J. J., Sudarmonowati E., Herman M., Pereira-Bertram I.

J., Wolters A. M. A., Meima H., Vetten N., Raemakers C. J. J. M., and Visser R.

G. F. (2012), "Field testing and exploitation of genetically modified cassava with

low-amylose or amylose-free starch in Indonesia", Transgenic Research, 21(1),

pp. 39-50.

46. Ladino J. J., Echeverry M., Mancilla L. I., Lopez D., Chavarriaga P., Tohme J.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

and Roca W. (2002), Genetic transformation of cassava: confirmation of 84

transgenesis in clone 60444 and analysis of CRY1Ab protein in transgenic lines.

Preliminary data on transformation of farmer-preferred cultivars SM1219-9 and

CM3306-4. Annual Report, CIAT, Cali, Colombia.

47. Lam H.-M., Coschigano K. T., Oliveira I. C., Melo-Oliveira R. & Coruzzi G. M.

(1996), The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in

higher plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47, 569-593.

48. Li H.-Q., Sautter C., Potrykus I. and Puonti-Kaerlas J. (1996), "Genetic

transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz)", Nat Biotech, 14(6), pp.

736-740.

49. Liu J., Zheng Q., Ma Q., Gadidasu K. K. and Zhang P. (2011). Cassava genetic

transformation and its application in breeding. J. Integr. Plant Biol. 53, 552–569.

doi: 10.1111/j.1744-7909.2011.01048.x

50. Ma Q., Zhou W. and Zhang P. (2015), Transition from somatic embryo to friable

embryogenic callus in cassava: Dynamic changes in cellular structure,

physiological status, and gene expression profiles, Front. Plant Sci., 6:824.

doi:10.3389/fpls.2015.00824

51. Manyong V. M., Dixon A. G. O., Makinde K. O., Bokanga M. and Whyte J.

(2000), The contribution of IITA-improved cassava to food security in sub-

Saharan Africa: an impact study. IITA Report, IITA, Ibadan, Nigeria.

52. Maria A. B., Shinichiro S., Kurt F. and Jamie H. D. C. (2008), Structural basis

for hygromycin B inhibition of protein biosynthesis, Published by Cold Spring

Harbor Laboratory Press, RNA, 14:1590–1599.

53. Mena M., Vicente-Carbajosa J., Schmidt R.J., Carbonero P. (1998), An

endosperm-specific DOF protein from barley, highly conserved in wheat, binds

to and activates transcription from the prolamin-box of a native β-hordein

promoter in barley endosperm, Plant J., 16, 5362.

54. Menkens A. E., Schindler U. and Cashmore A. R. (1995), The G-box: A

ubiquitous regulatory DNA element in plants bound by the GBF family of bZIP

proteins, Trends Biochem, Sci, 13, 506–510.

55. Nosengo N. (2003), Fertilized to death. Nature 425, 894-895.

85

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

56. Nyaboga E., Njiru J., Nguu E., Gruissem W., Vanderschuren H., and Tripathi

L. (2013). Unlocking the potential of tropical root crop biotechnology in east

Africa by establishing a genetic transformation platform for local farmer

preferred cassava cultivars. Front. Plant Sci. 4:526. doi: 10.3389/fpls.2013.

00526.

57. Oliveira I. C., Brears T., Knight T. J., Clark A. & Coruzzi G. M. (2002),

Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase. Relation to Nitrogen, Light,

and Photorespiration, Plant Physiol., 129, 1170-1180.

58. Raemakers C. J. J. M., Sofiari E., Jacobsen E., and Visser R. G. F. (1997),

"Regeneration and transformation of cassava", Euphytica, 96(1), pp. 153-161.

59. Raemakers K., Schreuder M., Pereira I., Munyikwa T., Jacobsen E., and Visser R.

(2001), "Progress made in FEC transformation of cassava", Euphytica, 120(1), pp.

15-24.

60. Rao R. N., Allen N. E., Hobbs J. N., Alborn W. E., Kirst H. A., Paschal J. W.

(1983), "Genetic and enzymatic basis of hygromycin B resistance in Escherichia

coli", Antimicrobial Agents and Chemotherapy 24 (5): 689–95.

61. Saini R., Singh R. P., Jaiwal P. K. (2007) Agrobacterium tumefaciens-mediated

transfer of Phaseolus vulgaris α-amylase inhibitor-1 gene into mungbean Vigna

radiata (L.) Wilcaek using bar as selectable marker. Plant Cell Rep 26:187–19

62. Sarria R., Torres E., Angel F., and Chavarriga P. (2000), "Transgenic plants of

cassava (Manihot esculenta) with resistance to basta obtained by

Agrobacerium - mediated transformation", Plant Cell Rep., 19, pp. 339-344.

63. Schöpke C., Franche C., Bogusz D., Chavarriaga P., Fauquet C., Beachy N. R.

(1993), "Transformation in Cassava (Manihot esculenta Crantz)", Plant

Protoplast and Genetics Engineering IV, Biotechnology in Agriculture and

Forestry, Springer-Verlag Berlin, Vol. 23, pp. 273-289.

64. Siritunga D. and Sayre R. (2004), "Engineering cyanogen synthesis and turnover

in cassava (Manihot esculenta)", Plant Molecular Biology, 56, pp. 661–669.

65. Sunilkumar G. và Rathore K. S. (2001), Transgenic cotton: factors influencing

Agrobacterium-mediated transformation and regeneration, Mol. Breed, 8:37–52.

86

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

66. Taylor N. J., Edwards M., Kiernan R. J., Davey C. D. M., Blakesley D. and

Henshaw G. G. (1996), Development of friable embryogenic callus and

embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot

esculenta Crantz), Nat. Biotechnol. 14, 726–730.

67. Taylor N. J., Masona M. V., Carcano R., Ho T., Schopke C., Fauquet C. M.

(2001), Production of embryogenic tissues and regeneration of transgenic plants

in cassava (Manihot esculenta Crantz). Euphytica. 120:25-34.

68. Taylor N., Chavarriaga P., Raemakers K., Siritunga D. and Zhang P. (2004),

Development and application of transgenic technologies in cassava. Plant

Molecular Biology, 56: 671–688.

69. Taylor T., Gaitán-Solís E., Moll T., Trauterman B., Jones T., Pranjal A.,

Trembley C., Abernathy V., Corbin D. and Fauquet C. M. (2012), A High-

throughput platform for the production and analysis of transgenic cassava

(Manihot esculenta) plants, Trop. Plant Biol. 5, 127–139, doi: 10.1007/s12042-

012-9099-4.

70. Tripathi J. N., Muwonge A., and Tripathi L. (2012). Efficient regeneration and

transformation protocol for plantain cultivar ‘Gonja Manjaya’ (Musa spp. AAB)

using embryogenic cell suspension. In vitro Cell Dev. Biol. Plant 48, 216–224.

doi: 10.1007/s11627-011-9422-z.

71. Ubalua A. O. and Mbanaso ENA (2013), A Novelgene Transformation

Technique for Farmer’s Preferred Cassava Cultivar (Nwibibi) from Nigeria,

World Journal of Agricultural Sciences, 9 (3): 284-289.

72. Vicente-Carbajosa J., Moose S. P., Parsons R., Schmidt R. J. (1997), A maize

zinc-finger protein binds the prolamin box in zein gene promoters and interacts

with the basic leucine zipper transcriptional activator Opaque2, Proc. Natl Acad.

Sci. USA , 94, 7685 7690.

73. Vincent R., Fraisier V., Chaillou S., Limami M. A., Deleens E., Phillipson B.,

Douat C., Boutin J.-P. & Hirel B. (1997), Overexpression of a soybean gene

encoding cytosolic glutamine synthetase in shoots of transgenic Lotus

corniculatus L. plants triggers changes in ammonium assimilation and plant

development, Planta, 201 , 424-433.

87

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

74. Welsch R., Arango J., Bar C., Salazar B., Al-Babili S., Beltrán J., Chavarriaga

P., Ceballos H., Tohme J. and Beyer P. (2010), Provitamin A Accumulation in

Cassava (Manihot esculenta) Roots Driven by a Single Nucleotide

Polymorphism in a Phytoene Synthase Gene, The Plant Cell, Vol. 22: 3348–

3356.

75. Xu W. R., Wang Y. J., Wang X. P., Hao W., Sun M. (2005), Construction of the

plant expression vectors carrying resistant genes to powdery mildew and

adversities in wild species of Vitis in China, Acta Botanic Boreali-Occidentalia

Sinica 25:851–857 (in Chinese, with English abstract).

76. Xu J., Duan X. G., Yang J., Beeching J. R. and Zhang P. (2013), Enhanced

reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase

and catalase delays post-harvest physiological deterioration of cassava storage

roots, Plant Physiol., 161, 1517–1528. doi: 10.1104/pp.112.212803

77. Yanagisawa S., and Izui K. (1993), Molecular cloning of two DNA binding

proteins of maize that are structurally different but interact with the same

sequence motif, J. Biol. Chem, 268, 16028–16036.

78. Yanagisawa S. (1995), A novel DNA binding domain that may form a single zinc

finger motif, Nucleic Acids Res, 23, 3403–3410.

79. Yanagisawa S. (1996), Dof DNA binding proteins contain a novel zinc finger

motif, Trends Plant Sci, 1, 213–214.

80. Yanagisawa S. and Sheen J. (1998), Involvement of Maize Dof Zinc Finger

Proteins in Tissue-Specific and Light-Regulated Gene Expression, The Plant

Cell, Vol. 10, 75–89.

81. Yanagisawa S. (2000), Dof1 and Dof2 transcription factors are associated with

expression of multiple genes involved in carbon metabolism in maize, Plant J.,

21, 281-288.

82. Yanagisawa S. (2002), The Dof family of plant transcription factors, Trends

Plant Sci., 7 , 555-560.

83. Yanagisawa S., Akiyama A., Kisaka H., Uchimiya H. & Miwa T. (2004),

Metabolic engineering with Dof1 transcription factor in plants: Improved

88

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

nitrogen assimilation and growth under low nitrogen conditions, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 101, 7833-7838.

84. Yanagisawa S. (2004), Improved nitrogen assimilation using transcription

factors,

85. Zainuddin I. M., Schlegel K., Gruissem W. and Vanderschuren H. (2012),

“Robust transformation procedure for the production of transgenic farmer-

preferred cassava landraces”, Plant Methods, 8:24.

86. Zhang P., Legris G., Coulin P. & Puonti-Kaerlas J. (2000), Production of stably

transformed cassava plants via particle bombardment. Plant Cell Rep., 19,

939–945.

87. Zhang P., Phansiri S., Puonti-Kaerlas J. (2001), Improvement of cassava shoot

organogenesis by the use of silver nitrate in vitro, Plant Cell.

88. Zhang P., Bohl-Zenger S., Puonti-Kaerlas J., Potrykus I., Gruissem W. (2003),

Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation,

Planta, 218:192-203.

Tài liệu World Wide Web

89. http://www.asiacreative.vn/en/tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-ethanol-tren-the-

gioi/

90. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ti_plasmid.svg

91. http://hiephoisanvietnam.org.vn/chi-tiet-tin/xuat-khau-nong-san-9-thang-ca-

phe-tut-sau-san-tang-vut

92. http://isa.ciat.cgiar.org/urg/csearchacc.do

93. http://orientbiofuels.com.vn/index.php/vi/cay-san/tong-quan-ve-cay-san

94. http://petrotimes.vn/san-trong-lo-trinh-san-xuat-ethanol-160145.html

95. www.science.leidenuniv.nl/index.php/ibl/van_heusden/research

96. http://www.vaas.org.vn/cay-sa-n-vie-t-nam-nghien-cu-u-pha-t-trie-n-

a15192.html

89

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn