Nghiên cứu cấu trúc quần thể loài cá trích Sardinella gibbosa bleeker, 1849 tại vùng biển Việt Nam

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 180-188<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC QUẦN THỂ LOÀI CÁ TRÍCH Sardinella gibbosa<br /> Bleeker, 1849 (Clupeiformes: Clupeidae) TẠI VÙNG BIỂN VIỆT NAM<br /> Đặng Thúy Bình1*, Nguyễn Thị Bảo Châu2, Bùi Kim Lý2<br /> 1<br /> <br /> Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại Học Nha Trang, *binhdangthuy@gmail.com<br /> 2<br /> Trường Đại học Nha Trang<br /> TÓM TẮT: Cá trích có khoảng 50 giống gồm rất nhiều loài, phân bố rộng, chủ yếu sống ở tầng nước<br /> mặt, di chuyển thành từng đàn và không di cư xa. Mẫu cá trích Sardinella gibbosa Bleeker, 1849 được thu<br /> từ Phú Quốc, Khánh Hòa, Đà Nẵng và Cát Bà. Cây đa dạng loài được xây dựng dựa trên thuật toán<br /> neightbour joining sử dụng trình tự vùng gen điều khiển (Control region-CR) và 16S của DNA ti thể của<br /> các quần đàn S. gibbosa. Mạng lưới haplotype được xây dựng dựa trên phần mềm Network sử dụng tính<br /> năng Network Draw. Kết quả cho thấy vùng gen điều khiển (1122 bp) của 80 cá thể có tổng số 32<br /> haplotype được phát hiện với đa dạng haplotype là h=0,916±0,00041. Đối với gen 16S (550 bp) của 81 cá<br /> thể có tổng số 31 haplotype được phát hiện và đa dạng haplotype là h=0,804±0,0017. Mạng lưới haplotype<br /> cho thấy sự kết nối rộng rãi giữa các quần thể cá trích S. gibbosa dọc theo bở biển Việt Nam trừ quần thể<br /> ở Phú Quốc. Hệ thống dỏng chảy đại dương và dòng chảy sông Mê Kông được cho là rào cản sinh học<br /> cho sự phát tán ấu trùng và sự hình thành các quần thể cá trích theo vùng biển.<br /> Từ khóa: Sardinella gibbosa, gen điều khiển, mạng lưới haplotype, Việt Nam.<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> Sardinella gibbosa là loài thuộc giống<br /> Sardinella, một trong những loài cá có giá trị<br /> kinh tế cao thuộc họ Clupeidae, đây là một đối<br /> tượng quan trọng của nghề cá tại Việt Nam nói<br /> riêng và thế giới nói chung [3, 6]. Cá trích là<br /> loài phát triển nhanh, phân bố rộng và đặc điểm<br /> sống phản ánh sự nóng lên của đại dương do<br /> biến đổi khí hậu [7, 8].<br /> Các dòng chảy dọc theo bờ biển Việt Nam<br /> tạo ra khả năng kết nối rộng rãi giữa các quần<br /> thể sinh vật biển, trừ các khu vực ven biển phía<br /> tây nam của Việt Nam gần vịnh Thái Lan (hình<br /> 1B, 1C). Điều này dẫn đến giả thuyết cho rằng<br /> dòng chảy của sông Mê Kông có thể là rào cản<br /> sinh học cho sự di chuyển gen của các sinh vật<br /> biển thông qua sự phát tán ấu trùng, vì vậy, có<br /> thể có sự phân tách giữa các quần thể ở phía bắc<br /> và phía nam cửa sông Mê Kông.<br /> Với nhận thức về vai trò quan trọng trong hệ<br /> sinh thái và giá trị kinh tế của các loài cá<br /> Sardinella, nhiều nghiên cứu về cấu trúc quần<br /> thể của các loài cá này đã được tiến hành.<br /> Gregory et al. (1998) [9] đã nghiên cứu sự sinh<br /> sản ở giai đoạn trứng và ấu trùng của loài<br /> Sardinops sagax ở Thái Bình Dương trong vịnh<br /> California. Wang et al. (2008) [19] đã nghiên<br /> <br /> 180<br /> <br /> cứu về đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể<br /> của loài Sardinella zunasi.<br /> Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới chưa có<br /> công trình nghiên cứu nào về đa dạng di truyền<br /> và cấu trúc quần thể được thực hiện đầy đủ và<br /> đồng bộ về loài S. gibbosa. Các nghiên cứu liên<br /> quan đến đặc điểm sinh học, sinh thái, đa dạng<br /> di truyền của loài S. gibbosa còn ít.<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng các<br /> chỉ thị phân tử control region (CR mtDNA) và<br /> 16S mtDNA của DNA ti thể để xác định sự đa<br /> dạng di truyền của quần thể cá trích Sardinella<br /> gibbosa ở các vùng biển Phú Quốc, Nha Trang,<br /> Đà Nẵng, Cát Bà, đồng thời xác định cấu trúc<br /> quần thể của loài cá trích ở vùng biển Việt<br /> Nam. Nghiên cứu này góp phần vào việc cung<br /> cấp dữ liệu ban đầu cho công tác bảo tồn và lưu<br /> giữ nguồn gen của loài cá trích Sardinella<br /> gibbosa ở Việt Nam.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Đối tương nghiên cứu là loài cá trích<br /> Sardinella gibbosa Bleeker, 1849, được thu tại<br /> các vùng biển Phú Quốc (28 mẫu), Nha Trang<br /> (18 mẫu), Đà Nẵng (17 mẫu), Cát Bà (18 mẫu)<br /> (hình 1A). Mẫu cá trích được tách lấy cơ sau đó<br /> được bảo quản ở -40oC.<br /> <br /> Dang Thuy Binh, Nguyen Thi Bao Chau, Bui Kim Ly<br /> <br /> Tách chiết DNA và nhân gen bằng kỹ thuật<br /> PCR<br /> DNA tổng số được tách chiết từ phần cơ của<br /> mỗi cá thể cá trích bằng bộ kit Wizard SV<br /> genomic DNA purification (Promega) theo<br /> hướng dẫn của nhà sản xuất. Vùng gen điều<br /> khiển (CR) và gen 16S của DNA ti thể được<br /> <br /> khuếch đại bằng đoạn mồi bao gồm mồi xuôi và<br /> mồi ngược, cụ thể như sau: gen CR: CRA<br /> 5’TTC CAC CTC TAA CTC CCA AAG<br /> CTA3’và CRE 5’ CCT GAA GTA GGA ACC<br /> AGA TG 3’[12], và gen 16S: 16Sar 5’CGC<br /> CTG TTT ATC AAA AAC AT3’, 16Sbr 5’<br /> CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACGT3’ [5].<br /> <br /> Hình 1. A. Bản đồ các khu vực thu mẫu (đánh dấu hình tròn); B, C. dòng chảy bề mặt đại dương<br /> khu vực biển Đông và tam giác san hô theo gió mùa<br /> Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể<br /> tích 50 µl gồm: 1 µl khuôn với DNA tách chiết<br /> từ mẫu cơ, 5 µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25<br /> mM mỗi loại dNTP, 2 µM mỗi mồi (10 mM), 2<br /> mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5 U/1µl)<br /> và nước cất cho đủ thể tích. Phản ứng được<br /> chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo<br /> chương trình nhiệt độ: biến tính ban đầu tại<br /> 94oC trong 7 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 94oC<br /> trong 30 giây; 50oC trong 30 giây; 72oC trong 1<br /> phút; cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong<br /> 10 phút. Sản phẩm PCR (3 µl) sau đó được<br /> kiểm tra trên thạch agarose 1,5% nhuộm với<br /> ethidiumbromide và chụp hình bằng hệ thống<br /> đọc và phân tích hình ảnh gel (GelDoc-Biorad).<br /> Giải trình tự gen<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít<br /> “Wizard SV Gel and PCR clean-up System” của<br /> Promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử<br /> dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải<br /> trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy<br /> terminator (Big Dye® Terminator v.3.1.<br /> Applied Biosystems) với các đoạn mồi tương tự<br /> <br /> như phản ứng PCR, theo chương trình nhiệt như<br /> sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây,<br /> cuối cùng là 60oC trong 4 phút. Sản phẩm được<br /> phân tích trên máy phân tích trình tự tự động<br /> ABI Prism® 3700 DNA Analyser (Applied<br /> Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ<br /> thuật Contig Express trong phần mềm package<br /> vector NTI v.11.<br /> Phân tích đa dạng di truyền loài Sardinella<br /> gibbosa<br /> Trình tự của Sardinella gibbosa được xác<br /> nhận<br /> bằng<br /> chương<br /> trình<br /> BLAST<br /> (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).<br /> Các<br /> trình tự được chỉnh sửa bằng phần mềm<br /> Sequencher 4.0.4 (Gene Codes Corporation,<br /> 2002) và dóng hàng bằng phần mềm Clustal X<br /> v.1.8 [18].<br /> Đa dạng di truyền (genetic diversity) giữa<br /> các quần thể được tính bằng tổng số haplotype<br /> (k), số lượng của vị trí đa hình-polymorphic<br /> sites (s), đa dạng haplotype-haplotype diversity<br /> (d) và đa dạng nucleotide-nucleotide diversity<br /> <br /> 181<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 180-188<br /> <br /> (), số đột biến (n) sử dụng phần mềm DNAsp<br /> v 4.0 [15].<br /> Tổng số hapotype<br /> Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất<br /> của một gen tại cùng một locus trong bộ gen.<br /> Các trình tự gen có cùng số điểm đột biến lập<br /> thành một haplotype. Các haplotype khác nhau<br /> bởi một điểm đột biến.<br /> Đa dạng haplotype: xác suất hai lựa chọn<br /> ngẫu nhiên các haplotype trong một mẫu là<br /> khác nhau (tương đương với dị hợp tử được<br /> mong đợi).<br /> 2<br /> n <br /> k<br /> h<br /> 1  i 1 pi <br /> <br /> n 1 <br /> Trong đó: h là đa dạng haplotype; n là số<br /> lượng các haplotype trong một mẫu; p là tần số<br /> của từng haplotype trong mẫu.<br /> Đa dạng nucleotide: là số lượng trung bình<br /> của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi<br /> nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu.<br /> <br /> ∏ = (n/(n-1)) Σxi xj πij<br /> Trong đó, xi, xj là tần số của các alen i và j;<br /> πij là tần suất sai khác giữa alen i và j; n là chiều<br /> dài của chuỗi nucleotide.<br /> Số đột biến: xác suất mà bất kỳ một vị trí<br /> xảy ra đột biến: xác suất đột biến = số đột<br /> biến/tổng số nucleotide trong chuỗi/thế hệ.<br /> Tổng số đột biến trên cả chiều dài chuỗi<br /> nucleotide: η = xác suất đột biến  (tổng số<br /> nucleotide - số nucleotide đã bị đột biến).<br /> Xây dựng cây đa dạng loài<br /> Các phân tích được thực hiện dựa trên tập<br /> hợp các trình tự gen CR mtDNA và 16S<br /> mtDNA của Sardinella gibbosa. Trình tự của ba<br /> loài Sardinops sagax, Sardinops ocellatus và<br /> Sardinops caeruleus được sử dụng làm nhóm<br /> ngoại. Trình tự sử dụng trong nghiên cứu được thể<br /> hiện cụ thể ở bảng 1. Phân tích được tiến hành<br /> dựa trên thuật toán Neightbour joining (NJ)<br /> bằng phần mềm Mega 5.0 [17].<br /> <br /> Bảng 1. Thông tin về trình tự CR mtDNA và 16S mtDNA của Sardinella gibbosa và khu vực thu<br /> mẫu sử dụng trong nghiên cứu<br /> Trình tự<br /> <br /> Khu vực thu mẫu<br /> CR mtDNA<br /> <br /> SGPQ1, SGPQ2, SGPQ5, SGPQ6, SGPQ7,<br /> SGPQ9, SGPQ12, SGPQ14, SGPQ16,<br /> SGPQ18, SGPQ20, SGPQ21, SGPQ22,<br /> SGPQ24, SGPQ27, SGPQ30,<br /> SGPQ31,SGPQ32, SGPQ34, SGPQ36,<br /> SGPQ37, SGPQ38, SGPQ42, SGPQ43,<br /> SGPQ47, SGPQ48, SGPQ49, SGPQ50<br /> SGNT1, SGNT2, SGNT3, SGNT4, SGNT5,<br /> SGNT6, SGNT7, SGNT8, SGNT9, SGNT10,<br /> SGNT11, SGNT12, SGNT13, SGNT14,<br /> SGNT15, SGNT16, SGNT17, SGNT18<br /> SGDN1, SGDN2, SGDN3, SGDN4,<br /> SGDN5, SGDN6, SGDN7, SGDN8,<br /> SGDN9, SGDN10, SGDN11, SGDN12,<br /> SGDN13, SGDN14, SGDN15, SGDN16,<br /> SGDN17<br /> SGCB1, SGCB2, SGCB3, SGCB4, SGCB5,<br /> SGCB6, SGCB7, SGCB8, SGCB9, SGCB10,<br /> SGCB11, SGCB12, SGCB13, SGCB14,<br /> SGCB15, SGCB16, SGCB17, SGCB18<br /> Sardinops sagax (EU95933),<br /> Sardinops ocellatus (EU95942)<br /> 182<br /> <br /> Nguồn tham khảo<br /> <br /> Phú Quốc<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Nha Trang<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Đà Nẵng<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Cát Bà<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> Bowen et al., 1997, đăng kí<br /> trực tiếp<br /> <br /> Dang Thuy Binh, Nguyen Thi Bao Chau, Bui Kim Ly<br /> <br /> Sardinops neopilchardus (U95932)<br /> 16S mtDNA<br /> SGPQ1, SGPQ2,<br /> SGPQ20, SGPQ21, SGPQ22, SGPQ24,<br /> SGPQ27, SGPQ28, SGPQ29, SGPQ31,<br /> SGPQ36, SGPQ37, SGPQ38, SGPQ39,<br /> Phú Quốc<br /> SGPQ40, SGPQ41, SGPQ42, SGPQ43,<br /> SGPQ44, SGPQ45, SGPQ46, SGPQ47,<br /> SGPQ48, SGPQ49, SGPQ50, SGPQ52<br /> SGNT1, SGNT2, SGNT3, SGNT4, SGNT5,<br /> SGNT6, SGNT7, SGNT8, SGNT9, SGNT10,<br /> SGNT11, SGNT12, SGNT13, SGNT14,<br /> Nha Trang<br /> SGNT15, SGNT16, SGNT17, SGNT18,<br /> SGNT19<br /> SGDN1, SGDN2, SGDN3, SGDN4,<br /> SGDN5, SGDN6, SGDN7, SGDN8,<br /> SGDN9, SGDN10, SGDN11, SGDN12,<br /> Đà Nẵng<br /> SGDN13, SGDN14, SGDN15, SGDN16,<br /> SGDN17<br /> SGCB1, SGCB2, SGCB3, SGCB4, SGCB5,<br /> SGCB6, SGCB7, SGCB8, SGCB9, SGCB10,<br /> Cát Bà<br /> SGCB11, SGCB12, SGCB13, SGCB14,<br /> SGCB15, SGCB16, SGCB17, SGCB18<br /> Sardinops sagax (EU552729)<br /> Sardinops caeruleus (AY428444)<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> <br /> Nghiên cứu hiện tại<br /> Wilson et al., 2008, đăng<br /> kí trực tiếp<br /> Leyva-alencia et al.,<br /> 2003, đăng kí trực tiếp<br /> <br /> Đa dạng haplotype<br /> <br /> haplotype/18 mẫu, Đà Nẵng có 3 haplotype/17<br /> mẫu, Cát Bà có 3 haplotype/18 mẫu.<br /> Đối với gen 16S mtDNA, trong số 80 trình<br /> tự thu được ở Phú Quốc, Nha Trang, Đà Nẵng<br /> và Cát Bà, quan sát được 31 haplotype với sự đa<br /> dạng haplotype (h=0,927±0,00031), đa dạng<br /> nucleotide π=0,268, số lượng đa dạng<br /> (polymorphic sites) s=304, số đột biến η=423.<br /> Trong đó, quần thể Sardinella gibbosa ở Phú<br /> Quốc có 6 haplotype/26 mẫu, Nha Trang có 16<br /> haplotype/19 mẫu, Đà Nẵng có 10 haplotype/17<br /> mẫu, Cát Bà có 14 haplotype/18 mẫu.<br /> <br /> Trong số 81 trình tự CR mtDNA thu được ở<br /> Phú Quốc, Nha Trang, Đà Nẵng và Cát Bà,<br /> quan sát được 32 haplotype với sự đa dạng<br /> haplotype<br /> (h=0,804±0,00176),<br /> đa<br /> dạng<br /> nucleotide π=0,147, số lượng đa dạng<br /> (polymorphic sites) s=282, số đột biến η=347.<br /> Trong đó, quần thể Sardinella gibbosa ở Phú<br /> Quốc có 27 haplotype/28 mẫu, Nha Trang có 4<br /> <br /> Di truyền quần thể loài Sardinella gibbosa<br /> Kết quả phân tích đối với dữ liệu trình tự<br /> gen CR và 16S mtDNA được trình bày ở hình<br /> 2A, 2B với cây phát sinh loài thu được từ phân<br /> tích NJ và giá trị bootstrap được biểu hiện trên<br /> các nhánh. Mạng lưới haplotype của các quần<br /> thể cá trích Sardinella gibbosa dựa trên gen CR<br /> và 16S được trình bày ở hình 3A, 3B.<br /> <br /> Xây dựng mạng lưới haplotype<br /> Để xây dựng mạng lưới haplotype, sử dụng<br /> phần mềm Network 4.6.1 [1]. Phần mềm này sử<br /> dụng kết nối mạng dữ liệu đầu vào được tạo ra<br /> từ phần mềm DnaSPv5 và sử dụng thuật toán<br /> Median joining để tính, chức năng draw<br /> network cho phép tự động vẽ ra mạng lưới<br /> haplotype.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> 183<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 180-188<br /> <br /> Di truyền quần thể loài Sardinella gibbosa dựa<br /> trên gen CR mtDNA<br /> Qua hình 2A có thể cho thấy sự xuất hiện của<br /> 2 nhóm, nhóm 1 bao gồm quần thể Sardinella<br /> gibbosa ở Nha Trang, Đà Nẵng và Cát Bà. Nhóm<br /> 1 chia làm 2 nhóm nhỏ, nhóm 1A bao gồm quần<br /> thể Nha Trang, Đà Nẵng và Cát Bà, nhóm 1B<br /> <br /> A<br /> <br /> bao gồm các quần thể thể Cát Bà; nhóm 2 bao<br /> gồm các quần thể Phú Quốc. Cây đa dạng loài<br /> cho thấy quần thể S. gibbosa giữa các khu vực<br /> biển Nha Trang, Đà Nẵng và Cát Bà có mối quan<br /> hệ gần gũi với nhau, trong khi đó, quần thể<br /> S. gibbosa vùng biển Phú Quốc tách ra thành một<br /> nhánh riêng biệt.<br /> <br /> B<br /> <br /> Nhóm 1A<br /> Nhóm 1<br /> <br /> Nhóm 1A<br /> <br /> Nhóm 1<br /> <br /> Nhóm 1B<br /> <br /> Nhóm 1B<br /> <br /> Nhóm 2<br /> Nhóm 2<br /> <br /> Hình 2. Cây phát sinh loài dựa trên gen CR mtDNA (A) và gen 16S mtDNA (B) của cá trích<br /> Sardinella gibbosa thu tại các vùng biển Phú Quốc, Nha Trang, Đà Nẵng, Cát Bà; Sardinops sagax,<br /> Sardinops ocellatus và Sardinops caeruleus được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup)<br /> <br /> 184<br /> <br />