Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae

Chia sẻ: Sunshine_2 Sunshine_2 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh nhân....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae

Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae P. H. Van(1), N. P. N. Ha(2), N. T. M. Thu(3), D. T. T. Thuy(4) Tóm tắt Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh nhân. Summary “Prepare the Multiplex PCR mix detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae sulmutaneously” With two strains of N. gonorrhoeae and C. trachomatis in hand, the authors have prepared successfully the multiplex PCR mix detecting these two bacteria sulmutaneously with the sensitivity in detecting these bacteria separately reaches 1 DNA genome of the target bacteria in the volume of reaction; and the study also revealed that the sensitivity in detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae simultaneously is favored for the detecting of these bacteria from infected patients. Đặt vấn đề soát chất lượng. Chính vì vậy mặc dù trước đây chúng tôi đã có kit phát hiện C. trachomatis C. trachomatis và N. gonorrhoeae là hai tác nhưng vì hiện vẫn có nhiều khách hàng muốn nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng đường sinh dục rất được chúng tôi cung cấp thêm kit PCR phát hiện thường gặp với các hậu quả cũng khá nặng nề nếu đồng thời C. trachomatis và N. gonorrhoeae cho không phát hiện và chữa trị(1,2). Phương pháp tiện sử dụng, nên đơn vị R&D của chúng tôi cũng thông thường nhất hiện nay để phát hiện C. đã đặt ra mục tiêu chế tạo kit PCR phát hiện đồng trachomatic là dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh thời hai tác nhân này. Mục tiêu của công trình này quang trực tiếp để phát hiện vi khuẩn trong các là tìm hiểu độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của kit quệt cổ tử cung, tuy nhiên phương pháp này cho PCR này trên các chủng vi khuẩn C. trachomatis kết quả khá chủ quan vì tuỳ thuộc vào kỹ năng và và N. gonorrhoeae thật sự. kinh nghiệm người đọc kết quả trên kính hiển vi huỳng quang. Để phát hiện N. gonorrhoeae thì Vật liệu và phương pháp nghiên cứu nuôi cấy là phương pháp thường được dùng nhất, tuy nhiên có rất nhiều trường hợp nuôi cấy thất bại Mẫu thử trong nghiên cứu là các trích biệt vì bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó. Chính DNA từ các huyền dịch vi khuẩn N. gonorrhoeae vì vậy phương pháp được cho là nhạy cảm và và C. trachomatis. Vi khuẩn N. gonorrhoeae là thích hợp nhất hiện nay để phát hiện hai tác nhân chủng vi khuẩn được phân lập trên bệnh nhân, C. trachomatis và N. gonorrhoeae là kỹ thuật PCR. được định danh chính xác nhờ hình ảnh song cầu Hiện nay đã có kit phát hiện đồng thời N. Gram [-], tính chất oxidase [+], và chỉ lên men gonorrhoeae và C. trachomatis bằng kỹ thuật đường glucose trong thử nghiệm lên men đường PCR-ELISA được sản xuất bởi Roche Diagnostic. nhanh Cummitech 4. Vi khuẩn được phòng R&D Tuy nhiên kit này ít được sử dụng tại Việt Nam vì của công ty Nam Khoa bảo quản ở -70oC. Để giá thành khá cao, đồng thời cũng khá phức tạp chuẩn bị cho thử nghiệm, vi khuẩn được cấy phân khi thực hiện xét nghiệm. Trong nước cũng có vài lập lại trên thạch nâu, ủ 37oC trong tủ ấm CO2 tác giả cố gắng sản xuất kit PCR phát hiện đồng trong 48 giờ. Sau đó vi khuẩn được gặt trong nước thời hai tác nhân này nhưng cũng chưa thành công muối sinh lý để đạt độ đục tương đương 106 vi vì không có điều kiện thử nghiệm trên chủng vi khuẩn/ml). Huyền dịch vi khuẩn này được đun khuẩn thật sự, đặc biệt là chủng C. trachomatis, cách thuỷ trong 10 phút kể từ lúc nước sôi, sau đó ngoài ra các nơi dự định sản xuất các kit này cũng ly tâm 13.000RPM/5 phút. Dịch nổi chính là trích không phải là nơi sản xuất chuyên nghiệp với đầy biệt DNA của N. gonorrhoeae. Dịch nổi này được đủ kinh nghiệm sản xuất cũng như hệ thống kiểm pha loãng trong đệm TE theo hệ số pha loãng 10 (1) BS., TS., Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM; Cố vấn chất lượng và trưởng phòng QA Công Ty Nam Khoa. (2)CN., Trưởng phòng Vi Sinh-SHPT Bệnh Viện Phong và Da Liễu Qui Hòa, Qui Nhơn. (3)CN., Nghiên cứu viên phòng R&D Công Ty Nam Khoa. (4)BS., ThS., Giảng viên Bộ Môn Hoá Sinh, Khoa Y, ĐHYD 1 TP. HCM; Trưởng phòng R&D công ty Nam Khoa. Công trình được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa.
để có các độ pha loãng 1 (không pha loãng), 10-1, Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời C. 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, và 10-6 được đặt tên là G0, G1, trachomatis và N. gonorrhoeae do phòng R&D G2, G3, G4, G5 và G6 tương đương 104/10µl, của công ty Nam Khoa điều chế gồm các thành 103/10µl, 102/10µl, 10/10µl, 1/10µl và 0.1/10µl. phần chính: Taq polymerase và PCR buffer của Vi khuẩn C. trachomatis là hai dòng vi khuẩn 1 và Biorad, dNTP của Roche, dUTP và UNG của 2 xin từ Khoa Sinh Học, Đại Học Royal Holloway Amersham, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng thuộc Đại Học London, Anh. Hai dòng này được hợp) cho đoạn DNA dài 241bp trên crytic plasmid cung cấp dưới dạng huyền dịch có nồng độ vi của C. trachomatic, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen khuẩn đạt 107 vi khuẩn/ml. Tại Phòng R&D của tổng hợp) cho đoạn DNA dài 390bp trên crytic công ty Nam Khoa, hai dòng vi khuẩn được giữ ở plasmid của N. gonorrhoeae, MgCl2 của Biorad. -70oC. Trước khi trích biệt DNA, pha loãng hai Có hai loại multiplex PCR mix được pha, loại huyền dịch vi khuẩn này 1/100 trong đệm TE để chứa hàm lượng mồi 50pm/thể tích phản ứng, và đạt nồng độ vi khuẩn 105/ml. Dùng hai phương loại chứa hàm lượng mồi 25pm/thể tích phản ứng. pháp trích biệt DNA cho huyền dịch C. Hai loại PCR mix này được đặt tên là Multiplex trachomatis này: Phương pháp đun cách thuỷ CHL-GNC PCR mix 50pm và Multiplex CHL- trong 10 phút kể từ lúc nước sôi và sau đó ly tâm GNC PCR mix 25pm. Thể tích của PCR mix là để lấy dịch nổi – như vậy là có 2 mẫu d1 và d2, và 40µl, để thể tích của mẫu thử cho vào là 10µl, và phương pháp trích biệt DNA bằng bộ DNAPREP- như vậy thể tích phản ứng là 50µl. BOOM do công ty Nam Khoa sản xuất theo đúng Trước hết chúng tôi tìm hiểu phương pháp qui trình hướng dẫn kèm theo – như vậy là có 2 trích biệt DNA của huyền dịch C. trachomatis mẫu b1 và b2. Ngoài ra, chúng tôi còn dùng thêm bằng phương pháp BOOM và bằng phương pháp mẫu chứng âm là trích biệt DNA từ quệt cổ tử đun cách thuỷ, phương pháp nào tốt hơn?. Đồng cung lấy từ người không nhiễm hai tác nhân trên thời chúng tôi cũng tìm hiểu hàm lượng mồi 50pm đã được xác định bằng phương pháp miễn dịch và 25pm đặc hiệu C. trachomatis và N. huỳnh quang trực tiếp phát hiện C. trachomatis gonorrhoeae, hàm lượng nào cho kết quả khuếch âm tính và cấy cũng như soi trực tiếp âm tính N. đại tốt hơn?. Để trả lời hai câu hỏi này chúng tôi gonorrhoeae. Mẫu chứng âm này được trích biệt thực hiện thử nghiệm PCR với các mẫu trích biệt DNA bằng phương pháp dùng phenol-chloroform DNA đã chuẩn bị ở trên cho vào 9 tube PCR mix với bộ DNAPREP-PHCHL do công ty Nam Khoa 50pm và 7 tube PCRmix 25pm theo như trình bày sản xuất và thực hiện theo hướng dẫn đi kèm. trong bảng 1 sau đây. Bảng 1: Mẫu trích biệt DNA và thể thích mẫu (µl) được cho vào hai loại PCR mix CHL-GNC PCR mix 50pm CHL-GNC PCR mix 25pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 d1 (µl) 10 10 d2 (µl) 10 10 b1 (µl) 10 10 b2 (µl) 10 10 G1 (µl) 10 10 G2 (µl) 10 10 G3 (µl) 10 10 G4 (µl) 10 C (-) 10 Các PCR mix sau khi đã cho các mẫu thử dẫn đi kèm. Thang DNA được chạy điện di song được cho vào máy PCR, chúng tôi sử dụng máy song với sản phẩm PCR cũng do công ty Nam iCycler loại Dual-block của Biorad, và chạy PCR Khoa sản xuất, đây là thang 100-1000bp với theo chương trình luân nhiệt sau: 40oC/10 phút, khoảng cách mỗi vạch là 100bp. 95oC/5 phút, 40 chu kỳ 94oC/45 giây – 55oC/45 Sau khi đã có kết quả xác định được PCR mix giây – 72oC/1 phút, 72oC/7 phút. Sản phẩm có hàm lượng mồi nào là thích hợp nhất và trích khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch biệt nào là tốt nhất đối với huyền dịch C. agarose 2% pha trong TBE 0.5X và có trộn thêm trachomatis, chúng tôi tiến hành xác định độ nhạy 0.01mg ethidium bromide trong 50ml thạch. cảm của PCR mix này trong phát hiện C. Thạch điện di được pha từ bộ thuốc thử điện di trachomatis và N. gonorrhoeae riêng lẻ cũng như AGE do công ty Nam Khoa sản xuất theo hướng 2
trong phát hiện đồng thời. Phương pháp xác định cảm là hàm lượng thấp nhất của DNA bộ gen của độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân riêng lẻ hai vi khuẩn C. trachomatis và N. gonorrhoeae được tiến hành như sau: (1) Trước hết pha loãng còn cho được kết quả sản phẩm khuếch đại. Để trích biệt DNA (cho kết quả tốt nhất) trong TE xác định độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân theo hệ số pha loãng 10 để có các độ pha loãng 1 C. trachomatis và N. gonorrhoeae đồng thời, (không pha loãng), 10-1, 10-2, 10-3 được đặt tên là chúng tôi thực hiện thử nghiệm PCR với các độ C0, C1, C2, và C3, tương đương 103/10µl, 102/10µl, pha loãng của các trích biệt DNA của C. 10/10µl, và 1/10µl. (2) Cho các độ pha loãng của trachomatis và N. gonorrhoeae các cho vào 16 trích biệt DNA của C. trachomatis vừa chuẩn bị PCR mix sao cho các nồng độ DNA của C. và các độ pha loãng của trích biệt DNA của N. trachomatis đều gặp được các nồng độ DNA của gonorrhoeae đã chuẩn bị trước đó (các mẫu G0, N. gonorrhoeae. Sau đó chạy PCR và phát hiện và G1, G2, G3, G4, G5 và G6) vào các PCR mix, lượng đánh giá các kết quả sản phẩm khuếch đại điện di mẫu cho vào là 10µl. (3) Chạy PCR theo chương trong thạch agarose 2% như phương pháp đã trình trình luân nhiệt sau: 40oC/10 phút, 95oC/5 phút, 40 bày ở trên. Bảng 2 dưới đây trình bày cách cho chu kỳ 94oC/45 giây – 55oC/45 giây – 72oC/1 phút, các pha loãng mẫu trích biệt DNA của C. 72oC/7 phút. (4) Sản phẩm khuếch đại được phát trachomatis và N. gonorrhoeae vào các PCR mix hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% pha trong để đạt được yêu cầu này. TBE 0.5X như trên, đọc kết quả xác định độ nhạy Bảng 2: Các pha loãng mẫu trích biệt DNA và thể tích mẫu (µl) được cho vào PCR mix PCR mix 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 C0 (µl) 5 5 5 5 C1 (µl) 5 5 5 5 C2 (µl) 5 5 5 5 C3 (µl) 5 5 5 5 G3 (µl) 5 5 5 5 G4 (µl) 5 5 5 5 G5 (µl) 5 5 5 5 G6 (µl) 5 5 5 5 Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix. Kết quả điện di trong hình 1 cho thấy phương pháp trích biệt DNA của C. trachomatis bằng Kết quả điện di trong hình 2 cho thấy phương pháp đun tỏ ra có hiệu quả hơn phương Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm có độ nhạy pháp Boom vì trong cả hai mẩu C. trachomatis 1 cảm phát hiện N. gonorrhoeae và C. trachomatis và C. trachomatis 2, vạch khuếch đại sản phẩm riêng lẻ đạt đến 1 bộ gen vi khuẩn trong một thể PCR với DNA trích biệt bằng phương pháp đun tích mẫu cho vào tube phản ứng. Tuy nhiên, kết cách thuỷ (giếng 2, 4, 11 và 13) cho kết quả sáng quả điện di trong hình 3 thì cho thấy trong phát đậm hơn và rõ nét hơn phương pháp Boom (giếng hiện hai tác nhân vi khuẩn này cùng một lúc thì 1, 3, 10 và 12). Ngoài ra kết quả trên hình 1 cũng với các mẫu thử có hàm lượng DNA bộ gen C. cho thấy PCR mix 50pm có vẻ tốt hơn PCR mix trachomatis cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiện N. 25pm vì với mẫu trích biệt DNA của C. gonorrhoeae. Trong khi các mẫu có hàm lượng trachomatis bằng phương pháp Boom, kết quả DNA bộ gen của N. gonorrhoeae dù rất cao (đến PCR cho thấy mẫu b1 không cho sản phẩm khuếch 104 bộ gen DNA trong thể tích phản ứng) vẫn đại với PCR mix 25pm, nhưng vẫn cho sản phẩm không ảnh hưởng đến khả năng phát hiện C. khuếch đại với PCR mix 50pm. Từ kết quả này, trachomatis. Kết quả này rất thuận lợi trong thực chúng tôi chọn phương pháp trích biệt DNA cho tế phát hiện bệnh vì thông thường nếu một người huyền dịch vi khuẩn C. trachomatis là phương nhiễm C. trachomatis thì số lượng vi khuẩn trong pháp đun cách thuỷ, đồng thời chúng tôi chọn PCR mẫu thử sẽ rất thấp, trong khi đó nếu nhiễm N. mix có hàm lượng mồi 50pm cho các thí nghiệm gonorrhoeae thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử sẽ cao hơn. 3
1 2 mk 3 4 5 6 7 8 9 mk 10 11 12 13 14 15 16 mk PCR mix 50pm PCR mix 25pm Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR, gel bên trái là PCR mix 50, gel bên phải là PCR mix 25. Giếng 1,3, 10, 12: trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp Boom; giếng 2, 4, 11, 13 là trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp đun cách thuỷ; Giếng 5 đến 16 là trích biệt DNA của N. gonorrhoeae bằng phương pháp đun cách thuỷ với giếng 5, 14 là G1; giếng 6, 15 là G2; giếng 7, 16 là G3; giếng 8 là G4. Hình 2: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 C0 C1 C2 C3 mk mk G2 G3 G4 G5 G6 trong phát hiện từng tác nhân C. trachomatis (gel bên trái) và N. gonorrhoeae (gel bên phải). Kết quả cho thấy PCR mix có khả năng phát hiện N. gonorrhoeae đến nồng độ G5, tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng; khả năng phát hiện C. trachomatis đến nồng độ C3, tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng. G3 G4 G5 G6 G3 G4 G5 G6 G3 G4 G5 G6 G3 G4 G5 G6 C0 C0 C0 C0 C1 C1 C1 C1 C2 C2 C2 C2 C3 C3 C3 C3 Hình 3: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong phát hiện cùng một lúc hai tác nhân C. trachomatis (vạch khuếch đại 241bp) và N. gonorrhoeae (vạch khuếch đại 390bp). 4
Bàn luận phẩm chứ không phải là có tác nhân này thì không có tác nhân kia. Chính vì vậy khi thiết kế Chlamydia trachomatis là một trong các tác Multiplex PCR này, phải dự đoán được sự cạnh nhân nhiễm trùng lây truyền bằng đường tình dục tranh của cả hai loại DNA đích của cả hai tác nhân phổ biến nhất tại các nước đang phát triển(1). Bởi khi cùng tham gia vào phản ứng khuếch đại. vì hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh đều không có triệu chứng do vậy mà các trường hợp phát Kết quả nghiên cứu cho thấy, để phát hiện hiện được bệnh chỉ là một phần nổi của một tảng từng tác nhân riêng lẻ, Multiplex PCR mix do băng chìm(1). Người ta phỏng đoán ở Hoa Kỳ mỗi chúng tôi chế tạo có khả năng phát hiện rất cao, có năm có 3-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh và trên thể nói là lý tưởng: đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ toàn thế giới có đến 90 triệu trường hợp nhiễm cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong bệnh(3). Tỷ lệ phụ nữ dưới 25 tuổi nhiễm C. phản ứng là hoàn toàn có thể phát hiện được. Đây trachomatis có thể rất cao (đến 30%), trong đó chỉ là sự tính toán lý thuyết vì với phương pháp nguy cơ cao nhất là ở phụ nữ có hoạt động tình trích biệt DNA mà chúng tôi sử dụng trong công dục nhiều(3-5). Nếu nhiễm bệnh mà không điều trị trình này chỉ là phương pháp đun cách thuỷ do vậy thì có thể đưa đến viêm vùng chậu và dẫn đến các lượng DNA bộ gen trích ra ngoài dung dịch chắc di chứng nghiêm trọng như thai ngoài tử cung hay sẽ thấp hơn lượng DNA bộ gen thật sự có trong vô sinh(1,2). Tuy nhiên nhiễm trùng C. trachomatis huyền dịch vi khuẩn. là một nhiễm trùng rất dễ dàng để điều trị bằng Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy đối với kháng sinh do vậy việc phát hiện và điều trị được huyền dịch C. trachomatis, phương pháp BOOM các trường hợp riêng lẻ là một trong các chìa khoá để trích biệt DNA bộ gen tỏ ra không hiệu quả. trong chương trình kiểm soát nhiễm trùng. Chính Điều này hoàn toàn có thể giải thích được nếu vì thế có nhiều nơi, người ta đã khuyến cáo là các chúng ta hiểu được nguyên tắc trích biệt DNA của thanh niên nam nữ trưởng thành dưới 25 tuổi nên phương pháp BOOM, đó là dùng triton X100 để được sàng lọc phát hiện nhiễm C. trachomatis mỗi phá huỷ tế bào giải phóng DNA, dùng Guanidine năm một hay thậm chí hai lần(4-7). Cũng như vậy, thiocyanate để bất hoạt các men nuclease. Các nhiễm N. gonorrhoeae mạn tính hay không triệu DNA tự do sẽ bám vào các hạt silica nhờ vậy mà chúng là một trong các yếu tố gây lây lan lậu trong trích biệt được DNA. Tuy nhiên vì trong dịch cấy cộng đồng(8). Lậu không triệu chứng hay mạn tính C. trachomatis là dịch cấy tế bào, do vậy bên cạnh có ở cả đàn ông và phụ nữ(9,10). Một trong các tiếp DNA của C. trachomatis, vẫn có nhiều DNA của cận tốt nhất để kiểm soát và loại trừ được bệnh lậu tế bào và chính các DNA này đã cạnh tranh với chính là việc phải phát hiện và điều trị cho được DNA của C. trachomatis khi bám vào các hạt các trường hợp mang mầm bệnh này vì đây chính silica do vậy khả năng DNA của C. trachomatis là các nhân tố nguy cơ cao. được trích biệt sẽ thấp đi nhiều. Do vậy, dù chúng Độ nhạy của các phương pháp truyền thống tôi là những người đầu tiên mang về Việt Nam kỹ như nuôi cấy hay phát hiện kháng nguyên để phát thuật BOOM để trích biệt DNA nhưng không áp hiện C. trachomatis hiện nay đã bị các phương dụng BOOM một cách máy móc vào tất cả các pháp khuếch đại nucleic acid qua mặt. Cũng như bệnh phẩm mà phải xác định các bệnh phẩm nào vậy, phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã không lẫn nhiều DNA tạp nhiễm mới dùng bị chứng minh là không đủ nhạy cảm để phát hiện BOOM. được N. gonorrheae trong các đối tượng nhiễm Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy là trong lậu không triệu chứng hay mạn tính, do vậy các phát hiện đồng thời cả hai tác nhân N. phương pháp khuếch đại nucleic acid hiện đang gonorrhoeae và C. trachomatis; nếu C. rất được quan tâm để áp dụng. Có nhiều phương trachomatis trong mẫu thử có lượng DNA bộ gen pháp khuếch đại nucleic acid đã được đưa ra là 103 thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 10 thương mại như các phương pháp dựa vào kỹ DNA bộ gen trong mẫu thử, nếu C. trachomatis thuật LCR (Abbott), PCR (Roche)(11), TMA có lượng DNA bộ gen là 102 thì ngưỡng phát hiện (Bayer), hay SDA (BD). Trong các phương pháp N. gonorrhoeae là 1, nếu C. trachomatis có lượng này, dễ tiếp cận nhất là phương pháp PCR vì đây DNA bộ gen là 10 và 1 thì ngưỡng phát hiện N. là phương pháp mà các nhà nghiên cứu dễ dàng gonorrhoeae là 0.1 bộ gen trong mẫu thử. Ngược thiết kế nhất và không cần phải bị phụ thuộc vào lại lượng DNA bộ gen của N. gonorrhoeae không một hệ thống kín nào. Mục tiêu chính của công có ảnh huởng nhiều đến ngưỡng phát hiện C. trình này là thiết kế được multiplex PCR mix phát trachomatis. Như vậy có nghĩa là lượng vi khuẩn hiện được đồng thời cả hai tác nhân C. C. trachomatis trong mẫu cao thì sẽ ức chế khả trachomatis và N. gonorrhoeae, và cả hai tác nhân năng phát hiện N. gonorrhoeae. Trên thực tế thì này đều có thể hiện diện cùng một lúc trong bệnh thông thường với một người nhiễm C. trachomatis 5
thì ít khi lượng vi khuẩn trong mẫu cao đến mức 3. Burstein, G., C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R. Howell, J. Zenilman, and T. C. Quinn. 1998. Incident 103 vi khuẩn trong 10µl mẫu thử tức là đến 105/ml Chlamydia trachomatis infections among inner city mẫu thử vì nếu với những người đã từng quan sát adolescent females: implications for frequency of phát hiện C. trachomatis trong các quệt cổ tử cung chlamydial screening. JAMA 280:521–526. bằng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 4. Burstein, G., G. Waterfield, A. Joffe, J. M. Zenilman, T. thì không bao giờ có thể thấy được vi khuẩn này C. Quinn, and C. A. Gaydos. 1998. Screening for gonorrhea and chlamydia by DNA amplification in nhiều trên quang trường quan sát. Do vậy hiệu adolescents attending middle school health centers: ứng này chắc chắn sẽ không ảnh hưởng đến việc opportunity for early intervention. Sex. Transm. Dis. phát hiện cả hai tác nhân này cùng một lúc trên 25:395–402. thực tế mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân. 5. Burstein, G. R., J. M. Zenilman, C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R. Howell, W. Brathwaite, and T. C. Quinn. 2001. Predictors of repeat Chlamydia trachomatis Kết luận infections diagnosed by DNA amplification testing among inner city females. Sex. Transmit. Infect. 77:26– Nghiên cứu đã thành công trong việc chế tạo 32. được multiplex phát hiện đồng thời cả hai tác nhân 6. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong mẫu thử, Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and ngoài ra còn xác định được độ nhạy cảm trong Neisseria gonorrhoeae infections, 2002. Morb. Mortal. phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này một cách Wkly. Rep. 51:1–38. 7. U.S. Preventive Services Task Force. 2001. Screening for riêng lẻ hay đồng thời. Thành công này là chìa chlamydial infection, recommendations and rationale. Am. khóa để có thể tiến tới chế được bộ thử nghiệm J. Prev. Med. 20:90–94. PCR phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae 8. Handsfield, H. H. 1990. Neisseria gonorrhoeae, p. 1613– trong các bệnh phẩm lấy từ đường tiết niệu và sinh 1631. In G. L. Mandell, R. G. Jr. Douglas, and J. E. Bennett (ed.), Principles and practice of infectious dục bệnh nhân. diseases, 3rd ed. Churchill Livingstone, New York, N.Y. 9. Biro, F. M., S. L. Rosenthal, and M. Kiniyalocts. 1995. Tài liệu tham khảo Gonococcal and chlamydial genitourinary infections in symptomatic and asymptomatic adolescent women. Clin. 1. Centers for Disease Control and Prevention. 2001. Pediatr. 34:419–423. Sexually transmitted disease surveillance 2000 10. Dalabetta, G., and E. W. Hook III. 1987. Gonococcal supplement: Chlamydia Prevalence Monitoring Project. infections. Infect. Dis. Clin. N. Am. 1:25–24. U.S. Department of Health and Human Services, CDC, 11. Roche Diagnostic Systems Inc. 1996. AMPLICOR™ Atlanta, Ga. Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) 2. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. test package insert. Roche Diagnostic Systems,Inc., Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002. Branchburg, N.J. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–78. 6