Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN<br /> ĐỘC TỐ VI KHUẨN TẢ<br /> Phạm Đức Minh*; Hoàng Văn Lương*<br /> TãM T¾T<br /> Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả (VKT). Đối tượng và phương<br /> pháp nghiên cứu: sử dụng kháng thể đơn dòng kháng độc tố CTX của VKT. Que thử dựa trên<br /> nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể xảy ra trên màng mỏng. Có đối chiếu<br /> với kỹ thuật ELISA trên mẫu nhiễm CTX. Kết quả: que thử có khả năng phát hiện được độc tố<br /> CTX ở nồng độ 50 ng/ml và có độ đặc hiệu 100%. Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố<br /> CTX trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 53% so với kỹ thuật ELISA. Que thử<br /> nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao trong thực tiễn y học và cộng<br /> đồng. Kết luận: Học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc<br /> tố CTX của VKT. Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao.<br /> * Từ khóa: Vibrio cholerae; Độc tố tả; Que thử nhanh.<br /> <br /> Studying Development of Rapid Test to Detect Vibrio Cholerae Toxin<br /> Summary<br /> Objective: Production of test strips for rapid detection of Cholera toxin. Subjects and methods:<br /> The study used monoclonal antibodies against CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips based<br /> on the principle of antigen-antibody immune response occur on thin films. The result will be<br /> compared to ELISA in samples infected with CTX. Results: The strips have the ability to detect<br /> CTX toxin at concentrations of 50 ng/mL and a specificity of 100%. At the concentration of<br /> 50 ng/mL and 25 ng/mL of CTX toxin in the sample, the test strip has a sensitivity of 95%<br /> and 53%, respectively, compared to ELISA. The strips are low cost, easy to use, and have high<br /> applicability in medicine practice and community. Conclusion: Military Medical University has<br /> initial successfully made the rapid test strips to detect CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips<br /> are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community.<br /> * Key words: Vibrio cholerae; CTX; Rapid test.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Vi khuẩn tả là một trong những mầm<br /> bệnh nguy hiểm, do nó có thể sinh ra độc<br /> tố gây dịch tiêu chảy cấp [1, 7]. Độc tố VKT<br /> còn có nguy cơ sử dụng trực tiếp như là<br /> <br /> một vũ khí sinh học nguy hiểm [4]. Hiện<br /> tại Việt Nam đã có vắcxin phòng bệnh tả,<br /> nhưng hiệu quả chỉ đạt từ 66 - 90% [6]<br /> và chưa phổ biến. Chẩn đoán nhanh và<br /> <br /> * Häc viÖn Qu©n y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Ph¹m §øc Minh (drminh103@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 15/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015<br /> <br /> 18<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> chính xác mẫu có chứa độc tố CTX của<br /> VKT sẽ giúp ích cho quá trình phát hiện,<br /> điều trị và dự phòng ngộ độc do độc tố<br /> của VKT [3, 4]. Hiện nay, que thử nhanh<br /> đã và đang chiếm ưu thế trong ứng dụng<br /> y học và các lĩnh vực liên quan [3].<br /> Que thử nhanh được Singer J M và<br /> Plotz C M (1956) [8] nghiên cứu và phát<br /> triển, cho đến nay đã cải tiến nhiểu. Với<br /> ưu điểm giá thành thấp, dễ áp dụng, độ<br /> chính xác cao, que thử nhanh đang là<br /> mục tiêu của nhiều phòng thí nghiệm<br /> cũng như các công ty sản xuất sản phẩm<br /> liên quan đến sinh học phân tử. Học viện<br /> Quân y đang quản lý một dây chuyền sản<br /> xuất que thử nhanh. Hệ thống này được<br /> nhập từ Công ty Arista (Hoa Kỳ), có khả<br /> năng hoạt động tự động hoàn toàn hoặc<br /> bán tự động.<br /> Hiện tại có một số phương pháp thường<br /> dùng để phát hiện VKT và độc tố trong<br /> thực phẩm, bao gồm nuôi cấy, phương<br /> pháp ELISA, phương pháp khuếch đại<br /> gen (PCR), que thử nhanh... [1, 3, 4].<br /> Trong đó, que thử có ưu thế trong sàng<br /> lọc và được ưu tiên sử dụng. Xuất phát từ<br /> những yêu cầu đó, đề tài này thực hiện<br /> nhằm: Chế tạo que thử nhanh phát hiện<br /> độc tố CTX của VKT.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn<br /> các nhóm vi khuẩn sau:<br /> - Độc tố chuẩn: CTX code G-117 Lot #<br /> P5351 (Enza Life Sciences).<br /> 19<br /> <br /> - Độc tố đối chứng: độc tố không chịu<br /> nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn E. coli;<br /> độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin<br /> B) của vi khuẩn Staphylococcus aureus.<br /> 2. Vật liệu nghiên cứu.<br /> * Dụng cụ, thiết bị:<br /> Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng của<br /> Khoa Vi sinh vật và Trung tâm nghiên cứu<br /> Y Dược học - Học viện Quân y. Hệ thống<br /> sản xuất que thử nhanh của Hãng Arista<br /> (Hoa Kỳ).<br /> * Kháng thể:<br /> Bảng 1: Các kháng thể sử dụng trong<br /> nghiên cứu.<br /> TÊN<br /> KHÁNG THỂ<br /> <br /> VẬT<br /> CHỦ<br /> <br /> TYPE:<br /> KÝ HIỆU<br /> ISOTOPE (Catalog #)<br /> <br /> MAb to Cholera<br /> Toxin<br /> Monoclonal<br /> Antibody to<br /> Cholera Toxin<br /> beta subunit<br /> MAb to Cholera<br /> Toxin<br /> Monoclonal<br /> Antibody to<br /> Cholera Toxin<br /> beta subunit<br /> <br /> Chuột<br /> <br /> MAb-IgG1 C01593M Meridian<br /> <br /> Chuột<br /> <br /> MAb-IgG1 C01594M Meridian<br /> <br /> Anti Mouse IgG<br /> <br /> Dê<br /> <br /> IgG<br /> <br /> ABCAM0500<br /> <br /> HÃNG<br /> SẢN<br /> XUẤT<br /> <br /> ABCAM<br /> <br /> Có 3 kháng thể được gắn lên màng:<br /> kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt<br /> giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3).<br /> Kháng thể phát hiện (Detection Antibody)<br /> là C01594M, sẽ được gắn với hạt vàng,<br /> sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp<br /> (Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture<br /> antibody) là C01593M, sẽ được gắn lên<br /> màng NC ở vị trí test line. Kháng thể kiểm<br /> tra là ABCAM-0500, sẽ gắn lên màng NC<br /> ở vị trí vạch đối chứng (control line).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> * Màng gắn trên que thử:<br /> Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ<br /> phận chính: màng hút mẫu (Sample pad);<br /> màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate<br /> pad); màng nitrocellulose (Nitrocellulose<br /> membrance); màng hút trên (Absorbent<br /> pad) và đế nhựa giữ (Plastic adhesive<br /> backing card) của que thử, đặt mua<br /> của Công ty Ahlstrom, P.O. Box 329,<br /> Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki<br /> (Phần Lan) và của Công ty Advanced<br /> Microdevices (mdi), 20-21 Industrial Area,<br /> Ambala Cantt 133 006 (Ấn Độ).<br /> * Dung môi xử lý màng:<br /> Các màng đều có chức năng riêng biệt<br /> và để tối ưu hóa hoạt động của que thử,<br /> loại màng đều cần phải xử lý trước khi<br /> gắn lên test. Mỗi dung môi sẽ đặc hiệu<br /> cho một loại màng nhất định và làm tăng<br /> hoạt tính của màng sau xử lý.<br /> 3. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp chế tạo que thử nhanh:<br /> - Thiết kế: chế tạo que thử nhanh<br /> dựa theo quy trình của Công ty Arista<br /> (Hoa Kỳ). Trước tiên, xử lý loại màng<br /> bằng các dung môi thích hợp, để khô.<br /> Tiếp theo, phun kháng thể lên màng,<br /> cuối cùng lắp ghép và giữ chặt các bộ<br /> phận trên một đế nhựa. Quá trình tiến<br /> hành ở điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC,<br /> độ ẩm tương đối < 40%. Sau khi hoàn<br /> thành, cất giữ sản phẩm trong gói hàn<br /> nhiệt kín, có vật liệu chống ẩm bảo quản.<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1: Màng hút mẫu<br /> 2: Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1).<br /> 3: Màng phát hiện đầu tiên<br /> 4: Màng Nitrocellulose<br /> 5(a): Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2)<br /> 5(b): Vạch đối chứng (Chứa KT3)<br /> 6: Màng hút trên<br /> 7: Đế nhựa giữ<br /> <br /> Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test<br /> phát hiện nhanh.<br /> - Nguyên lý hoạt động của que thử:<br /> kháng thể phát hiện (KT1) sẽ gắn với<br /> kháng nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể<br /> bắt giữ (KT2). Nếu phản ứng miễn dịch<br /> đặc hiệu xảy ra sẽ cho kết quả vạch<br /> dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp<br /> gặp kháng thể kiểm tra (KT3) sẽ làm xuất<br /> hiện màu tại vạch đối chứng.<br /> - Tối ưu hóa: công đoạn tối ưu hóa sẽ<br /> cho công thức phối hợp tối ưu giữa nồng<br /> độ kháng thể cũng như các hóa chất khác<br /> trên que nhúng, phải đảm bảo nguyên tắc<br /> “sử dụng hàm lượng tối thiểu các chất để<br /> tạo được thiết bị có tính năng tối ưu”.<br /> * Phương pháp thử nghiệm que nhúng<br /> với mẫu thử:<br /> Que nhúng sẽ được đối chiếu với kỹ<br /> thuật ELISA trong thử nghiệm với mẫu<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> độc tố để xác định độ nhạy và độ đặc<br /> hiệu. Đánh giá độ nhạy của que thử qua<br /> khả năng phát hiện mẫu CTX ở các nồng<br /> độ pha loãng khác nhau từ 5 - 200 ng/ml.<br /> Kiểm chứng độ đặc hiệu với độc tố không<br /> chịu nhiệt LT của vi khuẩn E. coli và độc<br /> tố ruột SEB của vi khuẩn S. aureus.<br /> <br /> * Địa điểm và thời gian nghiên cứu:<br /> Nghiên cứu thực hiện tại Labo Vi sinh<br /> và các Mầm bệnh sinh học, Trung tâm<br /> Nghiên cứu Y Dược học Quân sự. Khoa<br /> Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 từ 10 2012 đến 6 - 2014.<br /> * Xử lý số liệu: số liệu được quản lý và<br /> phân tích bằng phần mềm Epi.info 7.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Chế tạo và tối ƣu hóa que nhúng.<br /> * Nồng độ kháng thể trên màng que thử:<br /> <br /> Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.<br /> <br /> Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.<br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Hình 4: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.<br /> (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test)<br /> Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card đã<br /> cho tín hiệu có thể nhận biết được.<br /> * Khả năng phát hiện của que thử trên mẫu độc tố chuẩn:<br /> <br /> Hình 5: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml.<br /> <br /> Hình 6: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 100 ng/ml.<br /> (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test)<br /> Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét khi mẫu CTX ở nồng độ 50 ng/ml<br /> (hình 5).<br /> <br /> 23<br /> <br />