Nghiên cứu chỉ thị phân tử SSR ở một số giống /dòng chè trồng tại Thái Nguyên

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

86
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, bài viết phân tích đặc điểm kích thước của một số đoạn SSR và đánh giá sự đa dạng genome các giống/dòng chè thu thập tại xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thải Nguyên; Công ty chè Sông Cầu và xã Trại Cài – huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên. DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu được sử dụng làm khuôn để thực hiện kỹ thuật PCRSSR với 5 cặp mồi đặc hiệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chỉ thị phân tử SSR ở một số giống /dòng chè trồng tại Thái Nguyên

Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 120(06): 93 – 99 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Ở MỘT SỐ GIỐNG/DÒNG CHÈ TRỒNG TẠI THÁI NGUYÊN Hoàng Thị Thu Yến1*, Lê Quang Thƣơng2, Dƣơng Thị Nhung2, Hà Thị Loan2 1 Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên Trường Trung học Phổ thông chuyên Tuyên Quang 2 TÓM TẮT PCR-SSR là kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng, đƣợc sử dụng phổ biến và hiệu quả để nghiên cứu chỉ thị phân tử trong c đánh giá sự đa dạng genome các giống/dòng chè thu thập tại xã Tân Cƣơng, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thải Nguyên; Công ty chè Sông Cầu và xã Trại Cài – huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên. DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu đƣợc sử dụng làm khuôn để thực hiện kỹ thuật PCRSSR với 5 cặp mồi đặc hiệu. Kết quả khuếch đại ở mỗi mồi đều chỉ ra sự đa dạng trình tự lặp lại của đoạn SSR và đa dạng các phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại. Sử dụng phần mền NTSYS version 2.1 phân tích sự đa dạng các phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR-SSR, các giống/dòng chè nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm 22 mẫu chè, chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 1 gồm 19 mẫu (M1, M2, M17, M7, M10, M20, M22, M23, M11, M21, M4, M8, M16, M15, M3, M14, M5, M6, M13), hệ số sai khác giữa chúng với nhóm phụ còn lại là 0,412. Nhóm phụ 2 gồm 3 mẫu M12, M24 và M25 có hệ số sai khác là 0,252. Nhóm chính II gồm 3 mẫu là M9, M18, M19, ba mẫu này có hệ số di truyền sai khác lớn nhất so với nhóm khác là 0,46. Từ khóa: Cây chè, Camellia sinensis, đa dạng di truyền, quan hệ di truyền, SSR, microsatellite, PCR-SSR MỞ ĐẦU* Chè là thứ nƣớc uống tự nhiên lâu đời nhất, đƣợc tiêu thụ rộng rãi với chi phí thấp, đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc nhiệt đới của Châu Á (Ấn Độ, SriLanka, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam..), Châu Phi (Kenya, Uganda, Malawi..) và Châu Mĩ la tinh (Argentina). Camellia sinensis (Camellia ( (Angiospermae) [11] (Camellia sinensis (Camellia assamica (Camellia assamica lasiocalyx -Campod). Ba loài chè này là nguồn gốc cho hầu hết các loài chè trồng ở các nƣớc trên thế giới hiện nay [19] * Tel: 0982 752153, Email: yenhtt@tnus.edu.vn Camellia sinensis (L) O. Kuntze đƣợc phân chè Camellia sinensis var sinensis, Camellia sinensis var pubilimba, Camellia sinensis var Assamica và Camellia sinensis var dehungensis [11]. Đặc điểm về giống và chu kỳ sống của chè phức tạp tạo nên một số hạn chế cho chọn tạo và cải tiến giống theo phƣơng pháp truyền thống. Việc phân biệt giữa các thứ chè thuộc chè China, Assmam và Compod gặp khó khăn do tính chất không đồng nhất của chè [15]. Hơn nữa, các mô tả về hình thái không phản ánh các biến đổi về mặt di truyền trong cây trồng mà chỉ cho thấy khi mô tả về sinh hóa và sinh lý [17], [18]. Do đó, việc sử dụng các chỉ thị phân tử ở mức độ DNA đƣợc các nhà khoa học quan tâm sử dụng để phát hiện các biến đổi về mặt di truyền. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu đa dạng cây chè ở mức độ phân tử [7], [8], [16] 93 Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ [6], [12], [16] [10] [9], [13], [14]. Trong đó SSR (simgle sequence repeats – SSR) còn đƣợc gọi là DNA vệ tinh (microsatellite) là một đoạn DNA có sự lặp lại của trình tự nulceotide nào đó. Hiện tƣợng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lƣợng nucleotide trong mỗi đơn vị lại có thể thay đổi từ một đến hàng trục và số lƣợng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng ngàn lần. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucletotide phân bố phổ biến trọng genome của các loài động thực vật. Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn SSR (PCR-SSR) với mồi thiết kế dựa trên trình tự genome của từng loài nên chỉ thị SSR cho kết quả nhanh và cao. Chỉ thị phân tử SSR với nhiều đặc tính nhƣ độ đa dạng cao, phân bố rộng rãi trong genome, di truyền theo quy luật Mendel, biểu hiện đồng hợp trội. Trình tự SSR đƣợc xác định từ trình tự DNA genome và cDNA (EST – Expression Sequence Tag). Chỉ thị SSR có nguồn gốc từ cDNA/EST (EST-SSR) có thể giúp giảm chi phí và thời gian xây dựng chỉ thị do các đoạn cDNA/EST liên quan trực tiếp đến các gen chức năng, nên SSR phát triển từ nguồn dữ liệu này có thể sẽ hữu ích hơn [14]. Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Sharma đã thống kế có 2181 đoạn EST từ cơ sở dữ liệu NCBI, trong đó có 1223 gen có trình tự SSR từ 2-34 nucleotide. Trong 109 gen phân tích nghiên cứu có chứa 120 SSR đƣợc xác định [14]. Theo thống kê của Ma và cộng sự (2010), ở chè có 6899 đoạn EST đƣợc công bố trên ngân hàng gen và có thêm 74 chỉ thị SSR-EST mới đƣợc nghiên cứu thực nghiệm [9]. Năm 2012, nhóm tác giả Sahu thống kê đƣợc 12852 đoạn EST ở chè, theo tính toán lý thuyết có 1636 đoạn EST chứa 2371 SSR. Khi so sánh các đoạn EST ở chè với các gen đã biết chức năng từ các loài khác cho thấy hầu hết các chỉ thị SSR-EST đƣợc nghiên cứu cho đến nay liên quan đến các quá trình sinh học, thành phần tế bào và chức năng phân tử ở chè [13]. 94 120(06): 93 – 99 Ở Việt Nam, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử vào việc đánh giá hệ gen của cây chè trong chọn tạo giống cây trồng còn là vấn đề mới mẻ. Năm 2004, nhóm tác giả Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của một số dòng chè đột biến [2] thuật này để phân tích sự đa dạng trình tự genome ở các dòng chè Shan [3] t [1], [5]. Năm 2009, Trần Đức Trung và đtg đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền 96 giống/dòng chè trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCRSSR [4]. Với mục đích nhằm tìm kiếm chỉ thị phân tử có tiềm năng ứng dụng trong chọn giống chè, chúng tôi tiến hành phân tích chỉ thị SSR ở một số giống/dòng chè trồng ở các địa phƣơng của tỉnh Thái Nguyên. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Nguyên liệu Sử dụng lá của một số giống/dòng chè đƣợc thu thập tại xã Tân Cƣơng – thành phố Thái Nguyên, xã Minh Lập và công ty chè Sông Cầu thuộc huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên (Bảng 1). Phƣơng pháp Tách chiết DNA tổng số Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số đƣợc thực theo mô tả của Hoàng Thị Thu Yến và đtg [5]. PCR-SSR Dựa trên cơ sở các dữ liệu mồi SSR đã công bố [9], [14] 2). Phản ứng đƣợc thực hiện trong 12,5 l thể tích với các thành phần: 6,25 l master mix (Qiagen), 0,5 l mồi F (10mM), 0,5 l mồi F (10mM), 1 l DNA (40 ng/ l); 4,25 l H2O. Chu trình nhiệt của phản ứng là: 940C trong 3 phút, (940C trong 1 phút, Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 120(06): 93 – 99 480C trong 45 giây, 720C trong 45 giây) lặp lại 32 chu kỳ, 720C trong 10 phút và lƣu giữ ở 40C. Sản phẩm PCR-SSR đƣợc bằng điện di trên gel agarose 3% và chụp ảnh bằng Gel Doc (Pharmacia Amersham Biotech). phân đoạn DNA. Các số liệu này đƣợc xử lý trên máy tính theo chƣơng trình NTSYSpc version pc 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) để xác định quan hệ di truyền của các dòng chè. Phân tích số liệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCRSSR, sự xuất hiện các băng điện di đƣợc ƣớc lƣợng kích thƣớc dựa vào marker chuẩn và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di đƣợc tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: số 1- xuất hiện phân đoạn DNA và số 0 - không xuất hiện Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR-SSR Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 5 cặp mồi với 25 giống/dòng chè nghiên cứu chỉ ra sự đa dạng trình tự SSR. Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR ở 3 mồi đặc trƣng nhất đƣợc thể hiện trên hình 1, hình 2 và hình 3. Bảng 1: Các mẫu chè nghiên cứu STT Ký hiệu Tên giống STT Ký hiệu Tên giống Nguồn gốc 1 M1 Keo Am Tích 14 M14 LDP2 Công ty chè Sông Cầu 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 Hùng Đỉnh Bạch Tri 777 Shan Phúc Vân Tiên LDP1 Trung Du Yabukita Long Vân Bát Tiên Yakatamidozi Kim Tuyên Phú Thọ 10 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 Keo Am Tích Hùng Đỉnh Bạch Kim Tuyên LDP2 Tri 777 Trung Du Trung Du Kim Tuyên Bát Tiên LDP1 Tri 777 Nguồn gốc Công ty chè Sông Cầu Xã Tân Cƣơng Xã Minh Lập Bảng 2: Thông tin vể cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu TT Tên mồi 1 YS27 2 YS28 3 11 3 YTS64 YS83 YTS98 Trình tự mồi F: 5'- GGGGATAGTACAAACACACAAC -3' R: 5'- GCTCCTCTTTCTTCACCACTT - 3' F: 5' - GTCCCCATTGCTCTTAGTTT - 3' R: 5' - GACAATCATTGCCACCACAT- 3' F: 5’ – AGTTGGCTGAATCAGTCCCTT -3’ R: 5’ - GCTTAAATCACAATTCAAAGC -3’ F: 5'- GAGGATTTGGGTTTGTGAAC -3' R: 5' - TCATTCTCTCTGGCATCACC -3’ F: 5’ – TCACCACCTTCCCTTGATAG - 3’ R: 5’ - GCATTGGCAATATGAACATG - 3’ Kích thƣớc dự kiến 80 - 110 bp Motif lặp 170-200 bp 260 -275 bp (TG)(GA ) TTGTT 250 – 600 bp TGG 230 – 245 bp AAAT GA 95 Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 120(06): 93 – 99 Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR của 25 mẫu chè với mồi YS27 (M: Marker 100bp, 1 - 25: các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 1) Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28 (M: Marker 100bp, 1 - 25: các mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 1) Với mồi YS27, sản phẩm PCR-SSR dự kiến có kích thƣớc khoảng 80-110bp. Kết quả trên hình 1 cho thấy sản phẩm PCR-SSR của 25 giống/dòng chè nghiên cứu có kích thƣớc giống nhƣ tính toán lý thuyết. Tuy nhiên, một số mẫu có 2 băng (6, 7, 8, 10, 11 và 12). Nhƣ vậy, giữa các giống/dòng chè nghiên cứu có sự đa dạng alen và kết quả này phù hợp với công trình nghiên cứu đã công bố [14]. Với mồi YS28, sản phẩm PCR-SSR dự kiến có kích thƣớc khoảng 170-200bp. Kết quả trên hình 2 cho thấy sản phẩm PCR-SSR của 25 giống/dòng chè nghiên cứu có kích thƣớc ƣớc tính khoảng 290 - 320 bp. Kết quả chúng tôi thu đƣợc cho thấy sự sai khác về kích thƣớc đoạn DNA so với kết quả đã đƣợc công bố bởi Sharma và đtg [14]. Nhƣ vậy, giữa các giống/dòng chè nghiên cứu có sự đa dạng về trình tự (TG)(GA) lặp lại. Với mồi YS83, sản phẩm dự kiến có kích thƣớc 250-600bp. Sản phẩm PCR-SSR ở 25 mẫu chè nghiên cứu có kích thƣớc dao động từ 290-320bp. Trong đó, 96 ở kích thƣớc 290 bp chỉ xuất hiện ở mẫu số 9, 18 và 19. Nhƣ vậy mồi YS83 thể hiện tính đa dạng alen không cao khi so sánh với kết quả của Sharma và đtg [14]. Với mồi YTS64, sản phẩm PCR-SSR dự kiến có kích thƣớc khoảng 260-275bp. Kết quả ở hình 3 cho thấy tất cả các mẫu đều có băng khoảng 260-275bp, một số mẫu có thêm các băng phụ khoảng 300bp (mẫu 11, 12 và 13). Nhƣ vậy, kết quả với cặp mồi YTS64 cho thấy sự đa dạng alen giữa các mẫu chè khảo sát. Với mồi YTS98, kích thƣớc sản phẩm PCR-SSR dự kiến khoảng 230-245bp. Tại vị trí khoảng 240bp tất cả các giống/dòng đều xuất hiện băng DNA, hầu hết các mẫu có thêm băng phụ khoảng 600bp. Nhƣ vậy, kết quả với cặp mồi YTS98 cho thấy hầu nhƣ không có sự đa dạng alen giữa các mẫu chè khảo sát. Kết quả PCR-SSR mồi YTS64 và YTS98 của chúng tôi giống với kết quả đã đƣợc công bố năm 2010 bởi Ma và đtg [9]. Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 120(06): 93 – 99 Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR của 25 mẫu chè với mồi YS64 (M: Marker 100bp, 1 - 25: Ccác mẫu nghiên cứu theo thứ tự bảng 1) Bảng 3. Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi Mồi YS98 YS28 YS27 YS64 YS83 Tổng Phân đoạn DNA khuếch đại 3 4 4 4 3 18 Phân đoạn DNA đa hình 2 4 4 4 3 17 Mối quan hệ di truyền giữa các dòng chè dựa trên phân tích SSR Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 25 mẫu chè với 5 cặp mồi thu đƣợc 18 phân đoạn DNA, Mồi YS27, YS28 và YTS64 có 4 phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại, mồi YS83 và YTS98 có 3 phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại. Nhƣ vậy, sử dụng kỹ thuật PCR-SSR với 5 cặp mồi SSR cho thấy sự khác nhau trong cấu trúc genome của 25 mẫu chè. Tính đa hình đƣợc thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA khi so sánh giữa các mẫu với nhau. Thông qua kết quả phân tích đa dạng sử dụng 5 cặp mồi SSR cho thấy số phân đoạn DNA xuất hiện là khác nhau và thể hiện tính đa hình là khác nhau, số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi đƣợc thể hiện ở bảng 3. Kết quả ở bảng 3 cho thấy các phân đoạn đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 80600bp. Trong đó các mồi YS28, YS27, YS64, YS83 cho kết quả đa hình cao (100%). Còn mồi YS98 cho kết quả đa hình thấp hơn (66,67%). Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn DNA của các mẫu khi phân Tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình 66.67 100 100 100 100 93.3 tích điện di sản phẩm PCR-SSR, chúng tôi xác định đƣợc hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu chè ở cấp độ phân tử. Số liệu đƣợc phân tích theo chƣơng trình NTSYSversion 2.0 (theo quy ƣớc 1= xuất hiện băng, 0 = không xuất hiện băng). Kết quả cho thấy hệ số di truyền dao động từ 0,33 – 1. Trong đó mẫu M1 và M2; mẫu M1 và M17; mẫu M2 và M17; mẫu M20 và M22 có hệ số tƣơng đồng lớn nhất là 1, còn mẫu M4 có hệ số tƣơng đồng nhỏ nhất với mẫu M12 là 0,33. Kết quả phân tích hệ số di truyền giữa các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện bằng sơ đồ hình cây của 25 mẫu chè ở hình 4. Cụ thể, cây phân loại đƣợc chia thành hai nhóm rõ ràng, hệ số tƣơng đồng giữa hai nhóm là 0,54 (tức 54%). Nhóm I gồm 22 mẫu chè, chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 1 gồm 19 mẫu (M1, M2, M17, M7, M10, M20, M22, M23, M11, M21, M4, M8, M16, M15, M3, M14, M5, M6, M13), hệ số sai khác giữa chúng với nhóm phụ còn lại là 0,412. Nhóm phụ 2 gồm 3 mẫu M12, M24 và M25 có hệ số sai khác là 0,252. Nhóm chính II gồm 3 mẫu là M9, M18, M19, ba mẫu này có hệ số di truyền sai khác lớn nhất so với nhóm khác là 0,46. 97