intTypePromotion=1

Nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: NI NI | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
34
lượt xem
4
download

Nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết này nghiên cứu chuyển gen ipt vào cây hoa cẩm chướng với hy vọng biểu hiện của gen chuyển sẽ có tác dụng làm tăng tuổi thọ của hoa và lá của giống cẩm chướng. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT TẠO CYTOKININ NHẰM LÀM TĂNG<br /> TUỔI THỌ HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.)<br /> NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens<br /> Nguyễn Thị Thanh1*, Lê Thị Phương Quyên2, Nguyễn Phương Thảo2<br /> (1*)<br /> <br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thanh.nguyen.itb@gmail.com<br /> 2<br /> Trường đại học Quốc tế, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5  0,5cm và đặt trên môi<br /> trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày. Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá<br /> với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12<br /> mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng<br /> hygromycin và gen gusA. Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi<br /> trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua<br /> 3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen. Các dòng chuyển gen được tách và<br /> cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l. Một số ít dòng chuyển<br /> gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính. Sự hiện hiện của gen ipt, hpt<br /> và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615<br /> bp; 508 bp; 365bp. Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển<br /> bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot.<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dianthus caryophyllu, hoa cẩm chướng, gen hpt, gen ipt, gen gusA,<br /> GUS, PCR, promoter SAG12, TDZ.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus<br /> L.) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có<br /> nguồn gốc từ châu Âu. Hoa cẩm chướng có<br /> nhiều màu sắc đa dạng, hình dạng phong phú,<br /> nhiều chủng loại, màu sắc và mùi hương hấp<br /> dẫn. Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã<br /> trở thành một trong bốn loại hoa cắt cành phổ<br /> biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt<br /> cành. Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm<br /> chướng lớn nhất thế giới với sản lượng 2.500<br /> triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đứng thứ hai<br /> với sản lượng 1.800 triệu cành, Ba Lan đứng<br /> thứ ba với sản lượng 400 triệu cành... Colombia<br /> được xem là thiên đường hoa cẩm chướng với<br /> chất lượng hoa tốt nhất thế giới. Các nước khác<br /> cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng<br /> đáng kể, đó là Israel, Trung Quốc... [24].<br /> Hiện nay, cẩm chướng được trồng làm hoa<br /> cảnh trong nước và xuất khẩu có khoảng trên 20<br /> giống, chủ yếu được trồng nhiếu ở Đà Lạt.<br /> Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,5 triệu<br /> cành cẩm chướng các loại và xuất khẩu qua các<br /> nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Ôxtrâylia, Đài<br /> Loan, Pháp, Đức, Nga...[23].<br /> <br /> Trên thế giới cũng như Việt Nam, ngoài<br /> nhân giống cẩm chướng phục vụ sản xuất bằng<br /> phương pháp nuôi cấy mô, việc nghiên cứu tạo<br /> ra giống mới như giống kháng nấm, virus... có<br /> hoa màu sắc mới lạ, tươi lâu là vấn đề đang<br /> được quan tâm. Nghiên cứu tạo giống mới bằng<br /> công nghệ gen đã và đang được thực hiện và đã<br /> có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên<br /> cứu trên thế giới về chuyển một số gen có ý<br /> nghĩa khoa học và thực tiễn trên đối tượng cây<br /> cẩm chướng như gen ACC, bar, gusA, nptII,<br /> LEACO1, PttKN1, rolC, [1, 2, 3, 6, 7, 13, 22].<br /> Trong các chất điều hoà sinh trưởng như<br /> auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và<br /> ethylen có vai trò nhất định trong điều hoà sự<br /> lão hoá. Trong đó, cytokinin đóng vai trò quan<br /> trọng trong hạn chế quá trình lão hóa. Trong<br /> nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật,<br /> cytokinin có vai trò rõ rệt trong quá trình giữ<br /> cho mô lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố,<br /> được xanh tươi lâu. Ví dụ, như cytokinin liên<br /> quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu<br /> hoạch và kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành,<br /> mang ý nghĩa kinh tế rất cao. Các nghiên cứu đã<br /> được công bố trên thế giới của các nhà khoa học<br /> về nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme<br /> 227<br /> <br /> Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao<br /> <br /> isopentenyl transferase (ipt) tạo sinh tổng hợp<br /> cytokinin isopentenyl adenin, zeatin và<br /> dihydrozeatin vào cây trồng với mục đích làm<br /> mô tế bào của cây tự sản xuất cytokinin: cây<br /> hoa giả yên (Petunia), cải bông, hoa cúc, hoa<br /> hướng dương, cây rau cải xà lách, khoai tây,<br /> thuốc lá... [4, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 20]. Tác<br /> dụng của cytokinin nội sinh còn làm tăng hoạt<br /> chất artemisinin của cây thanh hao chuyển nạp<br /> gen ipt lên 70% so với cây đối chứng không<br /> chuyển gen [8]. Ngoài ra, các nghiên cứu<br /> chuyển nạp gen ipt tạo cây chuyển gen có khả<br /> năng chống lại được những điều kiện bất lợi của<br /> thời tiết như khô hạn, như trường hợp của cây<br /> thuốc lá [18, 21]. Kế thừa những nghiên cứu<br /> trên thế giới chuyển gen ipt vào thực vật, chúng<br /> tôi nghiên cứu chuyển gen ipt vào cây hoa cẩm<br /> chướng với hy vọng biểu hiện của gen chuyển<br /> sẽ có tác dụng làm tăng tuổi thọ của hoa và lá<br /> của giống cẩm chướng.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro<br /> Hạt giống cẩm chướng CCF của công ty<br /> Trang Nông (tp. Hồ Chí Minh) được khử trùng<br /> với cồn 70% trong 1 phút, sau đó với sodium<br /> hypochloride 30% [5,0 g/l (w/v), Công ty CP<br /> hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo, tp. Hồ Chí Minh] trong<br /> 10 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng.<br /> Sau cùng, các hạt đã khử trùng được gieo trên<br /> môi trường 1/2 MS, để trong tối khoảng 1 tuần,<br /> ở nhiệt độ 27-28 oC. Khi hạt bắt đầu nảy mầm,<br /> <br /> cây con được cấy chuyển 1 tháng một lần trên<br /> môi trường MS không chất điều hoà sinh trưởng<br /> (ĐHST).<br /> Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô<br /> Môi trường 1, môi trường nuôi và nhân<br /> giống cẩm chướng. MS (Murashige-Skoog,<br /> 1962), vitamin B5 (Gamborg B5 vitamin)<br /> [MSB5] không chất (ĐHST);<br /> Môi trường 2, môi trường tái sinh. MSB5 có<br /> TDZ 1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (v/v);<br /> Môi trường 3, môi trường tạo sự vươn chồi<br /> và ra rễ. MSB5 + IBA 0,5 mg/l.<br /> Điều kiện nuôi cấy với 9 giờ chiếu<br /> sáng/ngày, nhiệt độ 25-27oC.<br /> Chủng vi khuẩn, môi trường và điều kiện<br /> nuôi cấy<br /> Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens<br /> LBA4404<br /> chứa<br /> plasmid<br /> pVDH1396 (kích thước 15,9 kb) mang các gen<br /> ipt tạo enzyme isopentenyl transferase dưới sự<br /> điều khiển của promoter SAG12 (senescence<br /> associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana),<br /> gen gusA (có intron, promoter CaMV 35S), gen<br /> kháng hygromycin hpt dưới sự điều khiển của<br /> promoter CaMV35S (hình 1) do chúng tôi thiết<br /> kế. Môi trường nhân và giữ chủng vi khuẩn là<br /> môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin.<br /> Nhân giống vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu<br /> chuyển gen, được nuôi lắc 200 vòng/phút qua<br /> đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung<br /> kanamycin 50 mg/l, ở nhiệt độ 28oC.<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ plasmid VDH1396 kích thước 15,890 kb<br /> RB và LB. bờ phải và bờ trái; hpt. gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S);<br /> ipt. gen ipt (pSAG12/ipt/Tnos) và gen gusA (T35S/gus/p35S).<br /> <br /> Chuyển gen vào cây cẩm chướng nhờ khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens<br /> Lá khoảng 4-6 tuần tuổi được cắt thành<br /> những mảnh có kích thước khoảng 0,5  05 cm<br /> <br /> 228<br /> <br /> được sử dụng làm vật liệu chuyển nạp gen. Các<br /> bước thí nghiệm được tiến hành như sau: 1.<br /> Nuôi cấy các mẫu mô lá trên môi trường số 2<br /> trong thời gian 5 ngày; 2. Gây nhiễm các mẫu<br /> mô lá với vi khuẩn tỉ lệ 1:10 (v/v) trong vòng 30<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> phút; 3. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn<br /> thừa bằng giấy lọc vô trùng; 4. Nuôi chung các<br /> mô lá với vi khuẩn trong 2-3 ngày. Sử dụng môi<br /> trường số 2 lỏng có bổ sung acetosyringone 100<br /> µM. Sau 3 ngày nuôi cấy chung, rửa sạch vi<br /> khuẩn bằng nước cất có bổ sung dung dịch<br /> cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ. Vớt mẫu ra, thấm<br /> khô nước và cấy các mẫu mô lá trên môi trường<br /> chọn lọc (số 2) có bổ sung hygromycin 4 mg/l,<br /> cefotaxime 500 mg/l. Sau 3 tuần, chuyển qua<br /> môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin 510 mg/l, cefotaxime 500 mg/l. Tiếp tục chu kỳ 3<br /> tăng nồng độ hygromyicn từ 5-10 mg/l, tiếp tục<br /> chọn lọc thêm 2 chu kỳ (3 tuần/chu kỳ). Cấy<br /> truyền các mẫu mô kháng hygromycin qua môi<br /> trường số 2 chứa hygromycin 10 mg/l, đến khi<br /> vươn chồi, thời gian khoảng 2 tháng.<br /> Kiểm tra phát triển cá thể chuyển gen trên<br /> môi trường có hygromycin<br /> Tách các dòng cây chuyển gen kháng<br /> hygromycin và cấy chuyển qua môi trường số 3<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l, theo dõi sự<br /> sinh trưởng của cây.<br /> Thử GUS [20]: Ngâm mẫu mô vào dung dịch<br /> thuốc thử GUS, hút thấm chân không, ở 37oC<br /> trong 16 giờ.<br /> Phân tích PCR<br /> Tách chiết và tinh sạch DNA dòng cẩm<br /> chướng không chuyển gen và các dòng chuyển<br /> gen bằng DNesasy plant Mini kit (QIAGEN,<br /> Đức). Kiểm tra sự có mặt của các gen ipt hpt,<br /> gusA trong các dòng cẩm chướng chuyển gen<br /> giả định bằng các cặp mồi đặc hiệu của gen như<br /> sau: hpt-1: 5’-AGCTGCGCCGATGGTTT<br /> CTACAA-3’ hpt-2: 5’-ATCGCCTCGCTCCA<br /> GTCAATG-3’. Sản phẩm PCR được khuếch đại<br /> có kích thước đoạn DNA 508 bp; gusA-1:5’CCTGTAGAAACCCCAACCCGG-3.’<br /> và<br /> gusA-2: 5’-CCCGGCAATAACATACGGCG<br /> TG-3’. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA<br /> có kích thước 365 bp; ipt-1: 5’-TCGGTCCAAC<br /> TTGCACAGGAA-3’ và ipt-2: 5’-TACTCCTG<br /> AGCGATCCCAT-3’. Sản phẩm PCR khuếch<br /> đại đoạn DNA có kích thước 615 bp. Chương<br /> trình luân nhiệt: 95 oC: 2 phút; 30 chu kỳ (95oC:<br /> 1 phút, 52 -55oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72 oC: 5<br /> phút, sau cùng bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mô<br /> lá đối với kháng sinh hygromycin<br /> Kết quả nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên<br /> của mẫu mô lá giống cẩm chướng CCF có khả<br /> năng kháng hygromycin tự nhiên 4 mg/l. Vì<br /> vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ hygromycin<br /> chọn lọc các dòng chuyển nạp gen, nồng độ từ<br /> thấp lên cao từ 5-10 mg/l (đối chứng<br /> hygromycin 4 mg/l, gây chết mẫu mô lá sau 3<br /> tuần nuôi cấy). Ở thí nghiệm của chúng tôi, nếu<br /> chọn ngay lúc đầu nồng độ hygromycin 10 mg/l<br /> thì không thu nhận được kết quả.<br /> Giai đoạn nuôi chung mẫu mô lá với<br /> vi khuẩn<br /> Nhiều nghiên cứu công bố trên thế giới đã<br /> dùng phương pháp chuyển nạp gen vào cây<br /> trồng, thời gian nuôi cấy chung khoảng 2-3<br /> ngày [8, 10, 15]. Nhưng ở đối tượng cẩm<br /> chướng, thời gian nuôi chung với vi khuẩn sau<br /> 2-3 ngày nuôi cấy mọc rất yếu [3, 5]. Vì vậy,<br /> chúng tôi đã tăng thời gian nuôi ủ chung với vi<br /> khuẩn lên 5 ngày. Có nhiều khả năng, trong quá<br /> trình nuôi cấy chung với vi khuẩn một số giống<br /> cẩm chướng tiết ra phenol gây cản trở sự phát<br /> triển của vi khuẩn. Chính vì lý do này,<br /> thí nghiệm của chúng tôi nuôi chung mẫu mô lá<br /> với vi khuẩn tốt nhất thời gian là 5 ngày và<br /> nồng độ kháng sinh hygromycin bước đầu cho<br /> chọn lọc các các thể chuyển nạp gen giả định là<br /> 5 mg/l.<br /> Chọn lọc cá thể chuyển nạp gen<br /> Sau giai đoạn nuôi chung với vi khuẩn, nếu<br /> cấy chuyển các mẫu mô trên môi trường tái sinh<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l, các mẫu mô<br /> này bị chết (số liệu chưa công bố). Vì vậy, chế<br /> độ chọn lọc các tế bào chuyển nạp gen lần lượt<br /> từ thấp đến cao (hygromycin 5-10 mg/l). Sau<br /> khoảng một tháng chọn lọc, có nhiều mẫu mô bị<br /> chết, và có sự hình thành một số cụm callus mới<br /> tăng sinh trên môi trường có hygromycin 5mg/l.<br /> Tiếp theo, cấy chuyển callus qua môi trường có<br /> hygromycin 6-10 mg/l và tăng dần của lần chọn<br /> lọc thứ 3 là 10 mg/l (hình 2). Sau 3 chu kỳ chọn<br /> lọc triệt để, chúng tôi đã thu nhận được 5 dòng<br /> chuyển gen giả định từ 135 mẫu mô lá. Tần số<br /> chuyển gen 3,7%.<br /> 229<br /> <br /> Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao<br /> <br /> Kiểm tra khả năng phát triển rễ trên môi<br /> trường có hygromycin<br /> Năm dòng chuyển gen giả định thu nhận<br /> <br /> được trên môi trường chọn lọc có hygromycin<br /> 10 mg/l được cấy chuyển qua môi trường số 3<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l. Kết quả các<br /> chồi phát triển và ra rễ tốt (hình 2).<br /> <br /> Hình 2. Chọn lọc và tái sinh các dòng cẩm chướng chuyển gen<br /> và kiểm tra tính kháng hygromycin của cá thể chuyển gen<br /> a. (DC. đối chứng không chuyển gen; CG. Callus phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l);<br /> b: Callus kháng hygromycin; c. Chồi phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l; d, e. cây con<br /> chuyển gen trên môi trường 3 có hygromycin 10 mg/l; g. Cẩm chướng đối chứng không được chuyển gen.<br /> <br /> Thử GUS: Lấy ngẫu nhiên 3 dòng cẩm chướng<br /> chuyển gen giả định (CCF-T1; CCF-T3 và CCFT5) thử với X-GUC. Kết quả, hầu hết các mô của<br /> cẩm chướng kháng hygromycin đều có kết quả<br /> dương tính với thuốc thử GUS (hình 3d).<br /> Phân tích PCR các gen ipt, hpt và gen gusA<br /> Các dòng cẩm chướng kháng hygromycin sinh<br /> trưởng bình thường trên môi trường có<br /> hygromycin 10 mg/l được tách chiết DNA và<br /> kiểm tra PCR. Kết quả PCR cho thấy, các gen<br /> ipt, hpt và gen gusA với các cặp mồi đặc hiệu<br /> cho thấy sự hiện diện của các băng DNA được<br /> khuếch đại tương ứng là 615 bp, 508 bp và 365<br /> bp (hình 3a, 3b, 3c).<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Nghiên cứu chuyển nạp gen vào mẫu mô lá<br /> 230<br /> <br /> cẩm chướng bằng phương pháp gián tiếp nhờ vi<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404<br /> chứa plasmid pVDH1396 mang gen, hpt, ipt và<br /> gen gusA, chúng tôi đã nhận được một số dòng<br /> cây chuyển nạp gen. Qua phân tích các dòng<br /> cây này sinh trưởng in vitro bình thường trên<br /> môi trường có hygromycin 10mg/l, nhuộm xanh<br /> với thuốc thử GUS. Phân tích PCR các gen hpt,<br /> ipt và gen gusA đã cho thấy, các băng DNA<br /> dương tính lần lượt 508 bp, 615 bp và 365 bp.<br /> Các dòng chuyển nạp gen này tiếp tục được<br /> giữ giống để phục vụ các bước nghiên cứu tiếp<br /> theo, như phân tích sự có mặt của gen chuyển<br /> trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng kỹ thuật<br /> Southern bot và trồng thử nghiệm trong nhà<br /> lưới, theo dõi và đánh giá khả năng tăng tuổi thọ<br /> của hoa và lá các dòng đã được chuyển gen.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> Hình 3. Phân tích PCR và thử GUS các dòng cẩm chướng<br /> chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens<br /> (a). gen ipt dương tính với băng DNA 615 bp; M. Thang chuẩn 1,0 kb (BioLabs, Mỹ); 1. Đối chứng âm (cây<br /> không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen ipt),<br /> 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen.<br /> (b). gen hpt dương tính với băng DNA 508 bp; M. Thang chẩn DNA 100 bp (Sigma, Mỹ); 1. Đối chứng âm<br /> (cây không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen<br /> hpt); 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen.<br /> (c). gen gusA dương tính với băng DNA 365 bp; M. Thang chuẩn 1 kb (BioLabs, Mỹ); 1, 2 và 3. Các dòng<br /> cây cẩm chướng chuyển gen; 4. Đối chứng âm (cây không chuyển gen).<br /> (d). Biểu hiện của gen gusA sau khi nhuộm với thuốc thử GUS; -ve. đối chứng không chuyển nạp gen; 1, 2 và<br /> 3. các dòng cẩm chướng chuyển nạp gen.<br /> <br /> Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm<br /> ơn Đại học quốc gia tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ<br /> về kinh phí; Phòng Thí nghiệm trọng điểm về<br /> Công nghệ Tế bào thực vật phía Nam, Viện<br /> Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công<br /> nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho<br /> nghiên cứu này.<br /> <br /> microprojectile bombardment. Sci Hortic,<br /> 64:177-185.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 2. Amir Zucker, Ahroni A., Tzfira T., BenMeir H., Vainstein A. 1999. Wounding by<br /> bombardment yields highly efficient<br /> Agrobacterium - mediated transformation of<br /> carnation (Dianthus caryophyllus L.). Mol<br /> Breed, 5: 367-375.<br /> <br /> 1. Amir Zucker A., Chang R. F. L., Ahroni A.,<br /> Cheah K., Woodson W. R., Bressan R. A.,<br /> Watad A. A., Hasegawa P. M., Vainstein<br /> A., 2010. Transformation of carnation by<br /> <br /> 3. Chalermsri Nontaswatsri., Seiichi F.,<br /> Masanori G. 2003. Revised cocultivation<br /> conditions produce effective Agrobacterium<br /> - mediated genetic transformation of<br /> <br /> 231<br /> <br />
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2