Nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT TẠO CYTOKININ NHẰM LÀM TĂNG<br /> TUỔI THỌ HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.)<br /> NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens<br /> Nguyễn Thị Thanh1*, Lê Thị Phương Quyên2, Nguyễn Phương Thảo2<br /> (1*)<br /> <br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thanh.nguyen.itb@gmail.com<br /> 2<br /> Trường đại học Quốc tế, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5  0,5cm và đặt trên môi<br /> trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày. Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá<br /> với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12<br /> mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng<br /> hygromycin và gen gusA. Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi<br /> trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua<br /> 3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen. Các dòng chuyển gen được tách và<br /> cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l. Một số ít dòng chuyển<br /> gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính. Sự hiện hiện của gen ipt, hpt<br /> và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615<br /> bp; 508 bp; 365bp. Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển<br /> bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot.<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dianthus caryophyllu, hoa cẩm chướng, gen hpt, gen ipt, gen gusA,<br /> GUS, PCR, promoter SAG12, TDZ.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus<br /> L.) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có<br /> nguồn gốc từ châu Âu. Hoa cẩm chướng có<br /> nhiều màu sắc đa dạng, hình dạng phong phú,<br /> nhiều chủng loại, màu sắc và mùi hương hấp<br /> dẫn. Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã<br /> trở thành một trong bốn loại hoa cắt cành phổ<br /> biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt<br /> cành. Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm<br /> chướng lớn nhất thế giới với sản lượng 2.500<br /> triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đứng thứ hai<br /> với sản lượng 1.800 triệu cành, Ba Lan đứng<br /> thứ ba với sản lượng 400 triệu cành... Colombia<br /> được xem là thiên đường hoa cẩm chướng với<br /> chất lượng hoa tốt nhất thế giới. Các nước khác<br /> cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng<br /> đáng kể, đó là Israel, Trung Quốc... [24].<br /> Hiện nay, cẩm chướng được trồng làm hoa<br /> cảnh trong nước và xuất khẩu có khoảng trên 20<br /> giống, chủ yếu được trồng nhiếu ở Đà Lạt.<br /> Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,5 triệu<br /> cành cẩm chướng các loại và xuất khẩu qua các<br /> nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Ôxtrâylia, Đài<br /> Loan, Pháp, Đức, Nga...[23].<br /> <br /> Trên thế giới cũng như Việt Nam, ngoài<br /> nhân giống cẩm chướng phục vụ sản xuất bằng<br /> phương pháp nuôi cấy mô, việc nghiên cứu tạo<br /> ra giống mới như giống kháng nấm, virus... có<br /> hoa màu sắc mới lạ, tươi lâu là vấn đề đang<br /> được quan tâm. Nghiên cứu tạo giống mới bằng<br /> công nghệ gen đã và đang được thực hiện và đã<br /> có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên<br /> cứu trên thế giới về chuyển một số gen có ý<br /> nghĩa khoa học và thực tiễn trên đối tượng cây<br /> cẩm chướng như gen ACC, bar, gusA, nptII,<br /> LEACO1, PttKN1, rolC, [1, 2, 3, 6, 7, 13, 22].<br /> Trong các chất điều hoà sinh trưởng như<br /> auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và<br /> ethylen có vai trò nhất định trong điều hoà sự<br /> lão hoá. Trong đó, cytokinin đóng vai trò quan<br /> trọng trong hạn chế quá trình lão hóa. Trong<br /> nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật,<br /> cytokinin có vai trò rõ rệt trong quá trình giữ<br /> cho mô lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố,<br /> được xanh tươi lâu. Ví dụ, như cytokinin liên<br /> quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu<br /> hoạch và kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành,<br /> mang ý nghĩa kinh tế rất cao. Các nghiên cứu đã<br /> được công bố trên thế giới của các nhà khoa học<br /> về nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme<br /> 227<br /> <br /> Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao<br /> <br /> isopentenyl transferase (ipt) tạo sinh tổng hợp<br /> cytokinin isopentenyl adenin, zeatin và<br /> dihydrozeatin vào cây trồng với mục đích làm<br /> mô tế bào của cây tự sản xuất cytokinin: cây<br /> hoa giả yên (Petunia), cải bông, hoa cúc, hoa<br /> hướng dương, cây rau cải xà lách, khoai tây,<br /> thuốc lá... [4, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 20]. Tác<br /> dụng của cytokinin nội sinh còn làm tăng hoạt<br /> chất artemisinin của cây thanh hao chuyển nạp<br /> gen ipt lên 70% so với cây đối chứng không<br /> chuyển gen [8]. Ngoài ra, các nghiên cứu<br /> chuyển nạp gen ipt tạo cây chuyển gen có khả<br /> năng chống lại được những điều kiện bất lợi của<br /> thời tiết như khô hạn, như trường hợp của cây<br /> thuốc lá [18, 21]. Kế thừa những nghiên cứu<br /> trên thế giới chuyển gen ipt vào thực vật, chúng<br /> tôi nghiên cứu chuyển gen ipt vào cây hoa cẩm<br /> chướng với hy vọng biểu hiện của gen chuyển<br /> sẽ có tác dụng làm tăng tuổi thọ của hoa và lá<br /> của giống cẩm chướng.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro<br /> Hạt giống cẩm chướng CCF của công ty<br /> Trang Nông (tp. Hồ Chí Minh) được khử trùng<br /> với cồn 70% trong 1 phút, sau đó với sodium<br /> hypochloride 30% [5,0 g/l (w/v), Công ty CP<br /> hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo, tp. Hồ Chí Minh] trong<br /> 10 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng.<br /> Sau cùng, các hạt đã khử trùng được gieo trên<br /> môi trường 1/2 MS, để trong tối khoảng 1 tuần,<br /> ở nhiệt độ 27-28 oC. Khi hạt bắt đầu nảy mầm,<br /> <br /> cây con được cấy chuyển 1 tháng một lần trên<br /> môi trường MS không chất điều hoà sinh trưởng<br /> (ĐHST).<br /> Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô<br /> Môi trường 1, môi trường nuôi và nhân<br /> giống cẩm chướng. MS (Murashige-Skoog,<br /> 1962), vitamin B5 (Gamborg B5 vitamin)<br /> [MSB5] không chất (ĐHST);<br /> Môi trường 2, môi trường tái sinh. MSB5 có<br /> TDZ 1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (v/v);<br /> Môi trường 3, môi trường tạo sự vươn chồi<br /> và ra rễ. MSB5 + IBA 0,5 mg/l.<br /> Điều kiện nuôi cấy với 9 giờ chiếu<br /> sáng/ngày, nhiệt độ 25-27oC.<br /> Chủng vi khuẩn, môi trường và điều kiện<br /> nuôi cấy<br /> Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens<br /> LBA4404<br /> chứa<br /> plasmid<br /> pVDH1396 (kích thước 15,9 kb) mang các gen<br /> ipt tạo enzyme isopentenyl transferase dưới sự<br /> điều khiển của promoter SAG12 (senescence<br /> associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana),<br /> gen gusA (có intron, promoter CaMV 35S), gen<br /> kháng hygromycin hpt dưới sự điều khiển của<br /> promoter CaMV35S (hình 1) do chúng tôi thiết<br /> kế. Môi trường nhân và giữ chủng vi khuẩn là<br /> môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin.<br /> Nhân giống vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu<br /> chuyển gen, được nuôi lắc 200 vòng/phút qua<br /> đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung<br /> kanamycin 50 mg/l, ở nhiệt độ 28oC.<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ plasmid VDH1396 kích thước 15,890 kb<br /> RB và LB. bờ phải và bờ trái; hpt. gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S);<br /> ipt. gen ipt (pSAG12/ipt/Tnos) và gen gusA (T35S/gus/p35S).<br /> <br /> Chuyển gen vào cây cẩm chướng nhờ khuẩn<br /> Agrobacterium tumefaciens<br /> Lá khoảng 4-6 tuần tuổi được cắt thành<br /> những mảnh có kích thước khoảng 0,5  05 cm<br /> <br /> 228<br /> <br /> được sử dụng làm vật liệu chuyển nạp gen. Các<br /> bước thí nghiệm được tiến hành như sau: 1.<br /> Nuôi cấy các mẫu mô lá trên môi trường số 2<br /> trong thời gian 5 ngày; 2. Gây nhiễm các mẫu<br /> mô lá với vi khuẩn tỉ lệ 1:10 (v/v) trong vòng 30<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> phút; 3. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn<br /> thừa bằng giấy lọc vô trùng; 4. Nuôi chung các<br /> mô lá với vi khuẩn trong 2-3 ngày. Sử dụng môi<br /> trường số 2 lỏng có bổ sung acetosyringone 100<br /> µM. Sau 3 ngày nuôi cấy chung, rửa sạch vi<br /> khuẩn bằng nước cất có bổ sung dung dịch<br /> cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ. Vớt mẫu ra, thấm<br /> khô nước và cấy các mẫu mô lá trên môi trường<br /> chọn lọc (số 2) có bổ sung hygromycin 4 mg/l,<br /> cefotaxime 500 mg/l. Sau 3 tuần, chuyển qua<br /> môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin 510 mg/l, cefotaxime 500 mg/l. Tiếp tục chu kỳ 3<br /> tăng nồng độ hygromyicn từ 5-10 mg/l, tiếp tục<br /> chọn lọc thêm 2 chu kỳ (3 tuần/chu kỳ). Cấy<br /> truyền các mẫu mô kháng hygromycin qua môi<br /> trường số 2 chứa hygromycin 10 mg/l, đến khi<br /> vươn chồi, thời gian khoảng 2 tháng.<br /> Kiểm tra phát triển cá thể chuyển gen trên<br /> môi trường có hygromycin<br /> Tách các dòng cây chuyển gen kháng<br /> hygromycin và cấy chuyển qua môi trường số 3<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l, theo dõi sự<br /> sinh trưởng của cây.<br /> Thử GUS [20]: Ngâm mẫu mô vào dung dịch<br /> thuốc thử GUS, hút thấm chân không, ở 37oC<br /> trong 16 giờ.<br /> Phân tích PCR<br /> Tách chiết và tinh sạch DNA dòng cẩm<br /> chướng không chuyển gen và các dòng chuyển<br /> gen bằng DNesasy plant Mini kit (QIAGEN,<br /> Đức). Kiểm tra sự có mặt của các gen ipt hpt,<br /> gusA trong các dòng cẩm chướng chuyển gen<br /> giả định bằng các cặp mồi đặc hiệu của gen như<br /> sau: hpt-1: 5’-AGCTGCGCCGATGGTTT<br /> CTACAA-3’ hpt-2: 5’-ATCGCCTCGCTCCA<br /> GTCAATG-3’. Sản phẩm PCR được khuếch đại<br /> có kích thước đoạn DNA 508 bp; gusA-1:5’CCTGTAGAAACCCCAACCCGG-3.’<br /> và<br /> gusA-2: 5’-CCCGGCAATAACATACGGCG<br /> TG-3’. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA<br /> có kích thước 365 bp; ipt-1: 5’-TCGGTCCAAC<br /> TTGCACAGGAA-3’ và ipt-2: 5’-TACTCCTG<br /> AGCGATCCCAT-3’. Sản phẩm PCR khuếch<br /> đại đoạn DNA có kích thước 615 bp. Chương<br /> trình luân nhiệt: 95 oC: 2 phút; 30 chu kỳ (95oC:<br /> 1 phút, 52 -55oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72 oC: 5<br /> phút, sau cùng bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mô<br /> lá đối với kháng sinh hygromycin<br /> Kết quả nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên<br /> của mẫu mô lá giống cẩm chướng CCF có khả<br /> năng kháng hygromycin tự nhiên 4 mg/l. Vì<br /> vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ hygromycin<br /> chọn lọc các dòng chuyển nạp gen, nồng độ từ<br /> thấp lên cao từ 5-10 mg/l (đối chứng<br /> hygromycin 4 mg/l, gây chết mẫu mô lá sau 3<br /> tuần nuôi cấy). Ở thí nghiệm của chúng tôi, nếu<br /> chọn ngay lúc đầu nồng độ hygromycin 10 mg/l<br /> thì không thu nhận được kết quả.<br /> Giai đoạn nuôi chung mẫu mô lá với<br /> vi khuẩn<br /> Nhiều nghiên cứu công bố trên thế giới đã<br /> dùng phương pháp chuyển nạp gen vào cây<br /> trồng, thời gian nuôi cấy chung khoảng 2-3<br /> ngày [8, 10, 15]. Nhưng ở đối tượng cẩm<br /> chướng, thời gian nuôi chung với vi khuẩn sau<br /> 2-3 ngày nuôi cấy mọc rất yếu [3, 5]. Vì vậy,<br /> chúng tôi đã tăng thời gian nuôi ủ chung với vi<br /> khuẩn lên 5 ngày. Có nhiều khả năng, trong quá<br /> trình nuôi cấy chung với vi khuẩn một số giống<br /> cẩm chướng tiết ra phenol gây cản trở sự phát<br /> triển của vi khuẩn. Chính vì lý do này,<br /> thí nghiệm của chúng tôi nuôi chung mẫu mô lá<br /> với vi khuẩn tốt nhất thời gian là 5 ngày và<br /> nồng độ kháng sinh hygromycin bước đầu cho<br /> chọn lọc các các thể chuyển nạp gen giả định là<br /> 5 mg/l.<br /> Chọn lọc cá thể chuyển nạp gen<br /> Sau giai đoạn nuôi chung với vi khuẩn, nếu<br /> cấy chuyển các mẫu mô trên môi trường tái sinh<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l, các mẫu mô<br /> này bị chết (số liệu chưa công bố). Vì vậy, chế<br /> độ chọn lọc các tế bào chuyển nạp gen lần lượt<br /> từ thấp đến cao (hygromycin 5-10 mg/l). Sau<br /> khoảng một tháng chọn lọc, có nhiều mẫu mô bị<br /> chết, và có sự hình thành một số cụm callus mới<br /> tăng sinh trên môi trường có hygromycin 5mg/l.<br /> Tiếp theo, cấy chuyển callus qua môi trường có<br /> hygromycin 6-10 mg/l và tăng dần của lần chọn<br /> lọc thứ 3 là 10 mg/l (hình 2). Sau 3 chu kỳ chọn<br /> lọc triệt để, chúng tôi đã thu nhận được 5 dòng<br /> chuyển gen giả định từ 135 mẫu mô lá. Tần số<br /> chuyển gen 3,7%.<br /> 229<br /> <br /> Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao<br /> <br /> Kiểm tra khả năng phát triển rễ trên môi<br /> trường có hygromycin<br /> Năm dòng chuyển gen giả định thu nhận<br /> <br /> được trên môi trường chọn lọc có hygromycin<br /> 10 mg/l được cấy chuyển qua môi trường số 3<br /> có bổ sung hygromycin 10 mg/l. Kết quả các<br /> chồi phát triển và ra rễ tốt (hình 2).<br /> <br /> Hình 2. Chọn lọc và tái sinh các dòng cẩm chướng chuyển gen<br /> và kiểm tra tính kháng hygromycin của cá thể chuyển gen<br /> a. (DC. đối chứng không chuyển gen; CG. Callus phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l);<br /> b: Callus kháng hygromycin; c. Chồi phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l; d, e. cây con<br /> chuyển gen trên môi trường 3 có hygromycin 10 mg/l; g. Cẩm chướng đối chứng không được chuyển gen.<br /> <br /> Thử GUS: Lấy ngẫu nhiên 3 dòng cẩm chướng<br /> chuyển gen giả định (CCF-T1; CCF-T3 và CCFT5) thử với X-GUC. Kết quả, hầu hết các mô của<br /> cẩm chướng kháng hygromycin đều có kết quả<br /> dương tính với thuốc thử GUS (hình 3d).<br /> Phân tích PCR các gen ipt, hpt và gen gusA<br /> Các dòng cẩm chướng kháng hygromycin sinh<br /> trưởng bình thường trên môi trường có<br /> hygromycin 10 mg/l được tách chiết DNA và<br /> kiểm tra PCR. Kết quả PCR cho thấy, các gen<br /> ipt, hpt và gen gusA với các cặp mồi đặc hiệu<br /> cho thấy sự hiện diện của các băng DNA được<br /> khuếch đại tương ứng là 615 bp, 508 bp và 365<br /> bp (hình 3a, 3b, 3c).<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Nghiên cứu chuyển nạp gen vào mẫu mô lá<br /> 230<br /> <br /> cẩm chướng bằng phương pháp gián tiếp nhờ vi<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404<br /> chứa plasmid pVDH1396 mang gen, hpt, ipt và<br /> gen gusA, chúng tôi đã nhận được một số dòng<br /> cây chuyển nạp gen. Qua phân tích các dòng<br /> cây này sinh trưởng in vitro bình thường trên<br /> môi trường có hygromycin 10mg/l, nhuộm xanh<br /> với thuốc thử GUS. Phân tích PCR các gen hpt,<br /> ipt và gen gusA đã cho thấy, các băng DNA<br /> dương tính lần lượt 508 bp, 615 bp và 365 bp.<br /> Các dòng chuyển nạp gen này tiếp tục được<br /> giữ giống để phục vụ các bước nghiên cứu tiếp<br /> theo, như phân tích sự có mặt của gen chuyển<br /> trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng kỹ thuật<br /> Southern bot và trồng thử nghiệm trong nhà<br /> lưới, theo dõi và đánh giá khả năng tăng tuổi thọ<br /> của hoa và lá các dòng đã được chuyển gen.<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233<br /> <br /> Hình 3. Phân tích PCR và thử GUS các dòng cẩm chướng<br /> chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens<br /> (a). gen ipt dương tính với băng DNA 615 bp; M. Thang chuẩn 1,0 kb (BioLabs, Mỹ); 1. Đối chứng âm (cây<br /> không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen ipt),<br /> 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen.<br /> (b). gen hpt dương tính với băng DNA 508 bp; M. Thang chẩn DNA 100 bp (Sigma, Mỹ); 1. Đối chứng âm<br /> (cây không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen<br /> hpt); 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen.<br /> (c). gen gusA dương tính với băng DNA 365 bp; M. Thang chuẩn 1 kb (BioLabs, Mỹ); 1, 2 và 3. Các dòng<br /> cây cẩm chướng chuyển gen; 4. Đối chứng âm (cây không chuyển gen).<br /> (d). Biểu hiện của gen gusA sau khi nhuộm với thuốc thử GUS; -ve. đối chứng không chuyển nạp gen; 1, 2 và<br /> 3. các dòng cẩm chướng chuyển nạp gen.<br /> <br /> Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm<br /> ơn Đại học quốc gia tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ<br /> về kinh phí; Phòng Thí nghiệm trọng điểm về<br /> Công nghệ Tế bào thực vật phía Nam, Viện<br /> Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công<br /> nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho<br /> nghiên cứu này.<br /> <br /> microprojectile bombardment. Sci Hortic,<br /> 64:177-185.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 2. Amir Zucker, Ahroni A., Tzfira T., BenMeir H., Vainstein A. 1999. Wounding by<br /> bombardment yields highly efficient<br /> Agrobacterium - mediated transformation of<br /> carnation (Dianthus caryophyllus L.). Mol<br /> Breed, 5: 367-375.<br /> <br /> 1. Amir Zucker A., Chang R. F. L., Ahroni A.,<br /> Cheah K., Woodson W. R., Bressan R. A.,<br /> Watad A. A., Hasegawa P. M., Vainstein<br /> A., 2010. Transformation of carnation by<br /> <br /> 3. Chalermsri Nontaswatsri., Seiichi F.,<br /> Masanori G. 2003. Revised cocultivation<br /> conditions produce effective Agrobacterium<br /> - mediated genetic transformation of<br /> <br /> 231<br /> <br />