Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin và tannic acid lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường

Hóa học và Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ GẮN THROMBIN VÀ TANIC ACID<br /> LÊN BĂNG GẠC Ở ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ THƯỜNG<br /> <br /> Lê Minh Trí1, Đoàn Thanh Huyền1,<br /> Ngô Thị Thúy Phương1, Đỗ Thị Tuyên2, Lê Thị Vui3.<br /> <br /> Tóm tắt: Sau khi tinh sạch được thrombin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỷ<br /> lệ phối trộn bổ sung giữa tannic acid và thrombin để tăng khả năng tạo thành<br /> fibrin từ fibrinogen. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã nghiên cứu công nghệ gắn<br /> thrombin lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường với mong muốn thay thế băng<br /> gạc truyền thống vì có tác dụng chậm, giảm được giá thành, phục vụ cho sức khỏe<br /> cộng đồng. Kết quả cho thấy, thrombin gắn tannic acid ở nồng độ 0,025% tới<br /> 0,05% lên băng gạc có khả năng chuyển hóa fibrinogen và khả năng cầm máu tốt,<br /> hiệu quả so với băng gạc truyền thống.<br /> Từ khoá: Băng gạc, Thrombin,Tannic acid.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Thrombin là một serine proteinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông<br /> máu bằng cách chuyển fibrinogen thành fibrin và hoạt hóa yếu tố XIII giúp ổn định<br /> sợi huyết. Ở người, thrombin tồn tại dưới 3 dạng -, - và -thrombin. Trong đó,<br /> -thrombin đóng vai trò chính của quá trình đông máu. -Thrombin gồm hai chuỗi<br /> polypedtide A và B được liên kết bởi cầu disulfide với khối lượng phân tử khoảng<br /> 36kDa. Trong huyết tương người, thrombin tồn tại ở dạng prothrombin không hoạt<br /> động (với khối lượng khoảng 72 kDa) và khi bị tổn thương, prothrombin được hoạt<br /> hóa thành thrombin ở dạng hoạt động bởi prothrombinase.Trong y học, thrombin<br /> được ứng dụng như một chất cầm máu nhanh.<br /> Tannic acid là một dạng cấu trúc đặc biệt của tanin, một loại polyphenol, có độ<br /> acid yếu. Công thức hoá học của tannic acid là: C76H52O46. Hàm lượng tannic acid<br /> khác nhau trong mỗi loài thực vật khác nhau, ngay cả trong các bộ phận khác nhau<br /> của thực vật cũng có hàm lượng tannic acid khác nhau.<br /> Dựa trên các cơ sở khoa học của thrombin chúng tôi tiến hành nghiên cứu<br /> công nghệ gắn thrombin và tannic acid lên băng gạc với mong muốn thay thế<br /> băng gạc truyền thống có tác dụng chậm và giảm được giá thành sản phẩm,<br /> phục vụ cho sức khỏe cộng đồng.<br /> <br /> 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Các loại băng gạc Urgo Durable, Urgo Washproof và băng gạc thường có kích<br /> thước tương ứng 2x6 cm, 4x6 cm và 10x10 cm có gắn 0,05% tannic acid trong<br /> nước muối 0,9%.<br /> 2.2. Hóa chất<br /> <br /> <br /> 190 L.M. Trí, Đ.T. Huyền, …,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin … nhiệt độ thường.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Một số hóa chất và dung dịch được sử dụng như: dung môi ethanol tuyệt đối<br /> (Trung Quốc), NaCl, CaCl2 (Merk), fibrinogen (Sigma). Các cột sắc ký trao đổi<br /> ion, cột sắc ký lọc gel (Pharmacy), ….<br /> 2.3. Đánh giá khả năng chuyển hóa fibrinogen của dung dịch tannic acid 0,5%<br /> Dung dịch tannic acid 0,5% được khảo sát hoạt tính có trong mẫu với phản ứng<br /> 20 l fibrinogen trong 200 l NaCl 0,9%; sau đó bổ sung 50 l 0,05% tannic acid;<br /> với mẫu đối chứng không sử dụng tannic acid. Quan sát thời gian chuyển hóa<br /> fibrinogen thành fibrin.<br /> 2.4. Điện di SDS-PAGE<br /> Khối lượng phân tử tương đối của protein tinh sạch và độ sạch của các dịch<br /> protein được đánh giá bằng điện di trên gel polyacrylamide [6].<br /> 2.5. Xác định hàm lượng protein<br /> Hàm lượng protein được xác định theo Bradford [3].<br /> 2.6. Nghiên cứu các điều kiện gắn thrombin và acid tannic lên gạc<br /> Thrombin sau khi tinh sạch được kiểm tra điện di và hoạt tính chuyển hóa<br /> fibrinogen thành fibrin của thrombin. Dịch thrombin được phun lên băng gạc Urgo<br /> Durable, Urgo Washproof và băng gạc thường có kích thước tương ứng 2x6 cm,<br /> 4x6 cm và 10x10 cm có gắn dung dịch tannic acid 0,5% trong nước muối 0,9%.<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 3.1. Tách chiết tinh sạch thrombin từ phổi bò<br /> Thrombin thô được tinh sạch từ phổi bò qua một số bước như: nghiền đồng thể<br /> trong lạnh, tủa bằng Mg(OH)2 và dung môi ethanol, chuyển sang dạng hoạt động<br /> khi có mặt của ion Ca2+. Dịch thrombin thô tiếp tục được qua hai cột phenyl<br /> sepharose 6 FF (HIC) và cột Ni2+- probond. Kết quả điện di đồ SDS_PAGE cho<br /> thấy đã thu được một băng protein sạch có khối lượng phân tử khoảng 37 kDa<br /> (hình 1).<br /> Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu trên thế giới<br /> [3,4,5]. Theo các nghiên cứu công bố đã tinh sạch được thrombin có khối lượng<br /> phân tử khoảng 36 kDa với độ sạch đạt 75% [1].<br /> kDa<br /> <br /> <br /> <br /> 35 <br /> <br /> 25 <br /> <br /> 1 M 2<br /> Hình 1. (A) Điện di đồ SDS-PAGE protein tinh sạch (M: Marker; 1-2: các phân đoạn tinh<br /> sạch thu thrombin); (B): hoạt tính thrombin chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 191<br />  Hóa học và Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Năm 1971, các nhà khoa học đã tách được thrombin từ rắn Crotalus<br /> adamanteus với khối lượng phân tử 32,7 kDa và xác định thrombin hoạt động với<br /> pH tối ưu gần pH = 8, ổn định ở pH trung tính và kiềm nhưng mất hoạt tính với pH<br /> acid [7].<br /> 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tannic acid tới hoạt tính thrombin<br /> Sau khi tinh sạch được thrombin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỷ lệ phối trộn<br /> bổ sung giữa tannic acid và thrombin để tăng khả năng tạo thành fibrin từ<br /> fibrinogen. Tannic acid là một loại polyphenol có tính acid yếu, có công thức hóa<br /> học là C76H52O46, khối lượng phân tử là 1701,2 g/mol. Đã có nhiều nghiên cứu<br /> chứng minh hàm lượng tannic acid cao trong lá trắc bách diệp, lá tơ mành, lá cây<br /> quyển bá, cỏ nhọ nồi và đã được chứng minh có tác dụng làm co thành mạch máu,<br /> làm tăng hàm lượng protrompin toàn phần của máu rõ rệt và mạnh, làm tăng khả<br /> năng đông máu, rút ngắn thời gian chảy máu<br /> Tannic acid tham gia gián tiếp vào nhiều quá trình sinh lý như: tăng hiệu quả<br /> cầm máu, giảm huyết áp, giảm lipit huyết thanh và điều hòa đáp ứng miễn dịch.<br /> Trong chiến tranh, băng có tẩm tannic acid đã được điều trị bỏng do bom, khí độc<br /> và các chất gây bỏng trong chiến tranh. Tham khảo các nghiên cứu trên chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu tannic acid bổ sung với thrombin ở nồng độ phần trăm khác<br /> nhau. Sau đó mẫu được đánh giá bằng việc xác định thời gian chuyển hóa<br /> fibrinogen trước khi phun lên băng gạc.<br /> Bảng 2. Đánh giá sự ảnh hưởng của tannic acid<br /> đến thời gian chuyển hóa fibrinogen.<br /> ĐC (-) ĐC (+) Tỷ lệ phần trăm tannic acid<br /> 0,025% 0,05% 0,1% 0,25% 0,5% 1% 5% 10%<br /> NG 10s 10s 30s 1 phút 5 phút NG NG NG NG<br /> <br /> Kết quả cho thấy ở nồng độ tối đa 0,05% tannic acid đã không ảnh hưởng đáng<br /> kể so với hoạt tính ban đầu của thrombin. Trong khi đó, hoạt tính thrombin giảm<br /> đáng kể khi nồng độ tannic acid đạt 0,1% trở lên. Điều đó cho thấy, tannic acid ở<br /> nồng độ cao đã ảnh hưởng mạnh tới hoạt tính thrombin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự chuyển hóa fibrinogen của thrombin với nồng độ tannic acid khác nhau<br /> (ĐC: không có thrombin; ĐC (+): có thrombin;1: thrombin với 0,025% tannic acid;<br /> 2: thrombin với 0,05% tannic acid; 3: thrombin với 0,1% tannic acid; 4: thrombin với<br /> 0,25% tannic acid; 5: thrombin với 0,5% tannic acid; 6: thrombin với 1% tannic acid;<br /> 7: thrombin với 5% tannic acid; 8: thrombin với 10% tannic acid).<br /> <br /> <br /> 192 L.M. Trí, Đ.T. Huyền, …,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin … nhiệt độ thường.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> So sánh kết quả đánh giá thrombin của Sigma tại nồng độ 0,1% tannic acid cho<br /> thấy tannic acid ở nồng độ cao ảnh hưởng tới hoạt tính thrombin.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Sự chuyển hóa fibrinogen của thrombin của sigma<br /> (ĐC: không có thrombin; ĐC (+): thrombin tách từ phổi bò; 1: thrombin của<br /> sigma; 2: thrombin của sigma với 0,1% tannic acid).<br /> Từ những số liệu thu được cho thấy nồng độ tannic acid càng cao càng làm<br /> giảm hoạt tính thrombin. Nồng độ tannic acid có thể được sử dụng để bổ sung với<br /> thrombin tối đa đạt 0,05% đến 0,1%.<br /> 3.3. Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin lên băng gạc ở điều kiện nhiệt độ thường<br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành gắn thrombin lên 3 loại băng gạc<br /> (hình 3). Đối với loại băng cá nhân Urgo Durable: có kích thước 2x6 cm với đặc<br /> tính: nền vải đàn hồi, thông thoáng tốt giúp vết thương mau lành; tính chất co giãn<br /> của nền vải phù hợp với mọi vị trí khác nhau của vết thương, giúp tạo cảm giác<br /> thoải mái cho người sử dụng. Urgo Durable với chất keo oxit kẽm không dùng<br /> dung môi nên không có mùi, giúp giảm nguy cơ dị ứng, có độ dính cao, đáp ứng<br /> các yêu cầu về y tế. Màng polyethylene trong suốt ngăn cách giữa vết thương và<br /> lớp gạc giúp người sử dụng vẫn có thể làm việc bình thường nhưng vẫn đảm bảo<br /> thay băng dễ dàng và không đau. Dựa trên những đặc tính có sẵn của loại băng này<br /> chúng tôi bổ sung trực tiếp 200 l dung dịch 0,05% tannic acid lên miếng gạc urgon,<br /> để ở nhiệt độ thường, cho dịch tannic acid khô một cách tự nhiên. Bảo quản băng<br /> urgon ở nhiệt độ thường để sử dụng.<br /> Cách sử dụng: Băng cá nhân vải co giãn, thông thoáng, keo oxit kẽm màu trắng<br /> đục. Băng có gạc nằm gọn trong băng và phủ lưới chống dính kết hợp với<br /> thrombin một chất chống đông máu nên băng Urgo Durable giúp cầm máu tức thì.<br /> Lưu ý: vệ sinh da và lau khô trước khi dán băng.<br /> Đối với loại băng gạc Urgo Washproof có kích thước 4x6cm: Băng cá nhân với<br /> nền polyethylene hợp màu da, lỗ thông lớn, thông thoáng tốt giúp vết thương mau<br /> lành, keo Acrylic không dùng dung môi, dung nạp tốt, độ dính cao. Urgo<br /> Washproof với lớp màng trên cùng bằng polyethylene trong suốt ngăn cách giữa<br /> vết thương và lớp gạc giúp người sử dụng vẫn có thể làm việc bình thường nhưng<br /> vẫn đảm bảo thay băng dễ dàng và không đau. Đối với loại băng này chúng tôi tiến<br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 193<br />  Hóa học và Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> hành bổ sung 300 l dung dịch 0,05% tannic acid lên miếng gạc urgon, để ở nhiệt<br /> độ thường, cho dịch tannic acid khô một cách tự nhiên. Bảo quản băng urgon ở nhiệt<br /> độ thường để sử dụng.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A B C<br /> Hình 4. (A) Băng cá nhân Urgo Durable có kích thước nhỏ 2x6cm có gắn tannic<br /> acid; (B) Băng gạc urgo có kích thước nhỏ 4x6cm có gắn tannic acid (C) Băng gạc<br /> thường có kích thước 10x10cm có gắn 0,05% tannic acid.<br /> Đối với băng gạc thường: Băng thường dùng trong cấp cứu và ngoại khoa nhằm<br /> mục đích cầm máu: băng ép trong vết thương phần mềm có chảy máu; bảo vệ, che chở<br /> vết thương tránh cọ xát va chạm; chống nhiễm khuẩn thứ phát, thấm hút dịch, máu<br /> mủ; phối hợp với nẹp để cố định xương gãy tạm thời. Trong nghiên cứu này chúng tôi<br /> cũng tiến hành gắn tannic acid trên băng gạc thường với mục đích so sánh hiệu quả sử<br /> dụng giữa băng gạc urgo và băng gạc thường sau khi gắn 0,05% tannic acid.<br /> Cách gắn: Bổ sung 400 l dung dịch 0,05% tannic acid trực tiếp lên miếng gạc<br /> thường, để ở nhiệt độ thường, cho dịch 0,05% tannic acid khô một cách tự nhiên.<br /> Bảo quản băng urgon ở nhiệt độ thường để sử dụng.<br /> <br /> 4. KẾT LUẬN<br /> <br /> Từ những số liệu thu được cho thấy chúng tôi đã tìm được các điều kiện phương<br /> pháp gắn 0,05% tannic acid lên các loại gạc khác nhau. Băng gạc có kích thước<br /> 2x6cm và 4x6cm có thể bao trùm được các vết thương trên da và tận dụng được<br /> những đặc tính sẵn có của băng gạc Urgo Washproof và băng gạc Urgo Durable.<br /> Với việc bổ sung 200l và 300l 0,05% tannic acid. Chúng tôi đã tạo ra băng có<br /> khả năng cầm máu tức thì dựa vào hoạt tính sinh học của 0,05% tannic acid có khả<br /> năng chuyển hóa fibrinogen dạng hòa tan thành dạng không hòa tan fibrin. Bên<br /> cạnh đó chúng tôi cũng tiến hành bổ sung 400 l 0,05% tannic acid vào băng gạc<br /> thường để so sánh hiệu quả giữa các loại băng gạc khác nhau, nhằm tìm ra loại<br /> băng phù hợp nhất khi sử dụng trong việc tạo các băng gạc cầm máu tức thì. Tuy<br /> nhiên cần phải nghiên cứu các điều kiện bảo quản băng gạc tránh hiện tượng<br /> nhiễm khuẩn và đánh giá hiệu quả sau thời gian bảo quản khác nhau.<br /> <br /> <br /> 194 L.M. Trí, Đ.T. Huyền, …,“Nghiên cứu công nghệ gắn thrombin … nhiệt độ thường.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> [1]. Aizawa P, Winge S, Karlsson G "Large-scale preparation of thrombin from<br /> human plasma". In. Elsevier 2008, pp 560-567.<br /> [2]. Bajzar L, Manuel R, Nesheim ME (1995) "Purification and characterization<br /> of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor". In. ASBMB 1995, pp<br /> 14477-14484.<br /> [3]. Bradford MN "A rapid and sensitive method for the quantitation of<br /> microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye<br /> binding". Anal. Biochem. No72, 1976, pp248- 254.<br /> [4]. Dahlback Br "Purification of human vitamin K-dependent protein S and its<br /> limited proteolysis by thrombin". In Elsevier 1983, pp 837-846.<br /> [5]. Fenton JW, Fasco MJ, Stackrow AB "Human thrombins. Production,<br /> evaluation, and properties of alpha-thrombin". In. ASBMB 1977, pp 3587-<br /> 3598.<br /> [6]. Laemmli UK "Cleavage of structure proteins during the assembly of the head<br /> of bacteriophage T4". Nature No 227,1970, pp 680- 685.<br /> [7]. Markland FS, Damus PS "Purification and properties of a thrombin-like<br /> enzyme from the venom of Crotalus adamanteus (Eastern diamondback<br /> rattlesnake)". In. ASBMB 1971, pp 6460-6473.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDUDYING IN SPRAY TECHNOLOGY THROBIN<br /> AND TANIC ACID IN GAUZE AT ROOM TEMPERATURE CONDITION<br /> Purification of thrombin from bovine lung by sepharose 6 FF (HIC) and Ni-<br /> NTA sepharose chromatography. Then, prothrombin was activated to thrombin<br /> (Mr = 36 kDa), which plays an important role in the blood coagulation system,<br /> activated by Ca2+. We studied on making additional mixing ratio between<br /> tannic acid and thrombin to make convert fibrinogen into fibrin. In this study,<br /> we had studied pray technology thrombin in dressings at room temperature<br /> condition for replacement of traditional dressings with slow effect, reduce<br /> costs and serve public health. Results showed that thrombin with tannic acid<br /> concentrations from 0.025% to 0.05% able to convert fibrinogen into fibrin and<br /> hemostasis well, efficiency compared to traditional gauze.<br /> Keywords: Gauze, Thrombin, Tannic acid.<br /> Nhận bài ngày 09 tháng 07 năm 2015<br /> Hoàn thiện ngày 30 tháng 07 năm 2015<br /> Chấp nhận đăng ngày 07 tháng 09 năm 2015<br /> <br /> 1<br /> Địa chỉ: Viện Hoá học - Vật liệu/ Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự.<br /> 2<br /> Viện Công nghệ sinh học/ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;<br /> 3<br /> Học viên cao học Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.<br /> *Email: leminhtri1975@yahoo.com.vn<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học – Vật liệu, 10 - 2015 195<br />