Nghiên cứu đa hình rs671 trên gen ALDH2 liên quan chuyển hóa rượu ở nam giới người Việt

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình phát hiện đa hình rs671 trên ALDH2 liên quan đến chuyển hóa rượu bằng kĩ thuật sinh học phân tử dễ áp dụng tại Việt Nam. Mẫu máu tĩnh mạch của 70 nam giới bình thường; áp dụng phương pháp ARMS-PCR xác định đa hình rs671 trên gen ALDH2 và xác định tần suất alen, tần suất kiểu gen ở nam giới người Việt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu đa hình rs671 trên gen ALDH2 liên quan chuyển hóa rượu ở nam giới người Việt

CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH rs671 TRÊN GEN ALDH2 LIÊN QUAN CHUYỂN HÓA RƯỢU Ở NAM GIỚI NGƯỜI VIỆT Trần Văn Khoa1, Nguyễn Hà Hương Ly1, Đinh Nam Đạt1, Nguyễn Minh Đức1, Chu Đức Anh1, Lê Mậu Nghĩa1, Trần Văn Tuấn1 TÓM TẮT 15 methods: Venous blood samples from 70 normal Mục tiêu: Hoàn thiện được quy trình ARMS- males; ARMS-PCR was applied to identify rs671 PCR phân tích đa hình rs671 trên gen ALDH2 và polymorphism in ALDH2 gene and to determine khảo sát tần suất đa hình rs671 ở nam giới người allele and genotype frequencies in Vietnamese Việt. Đối tượng và phương pháp: Mẫu máu men. Results and conclusion: Completed the ARMS-PCR protocol and successfully applied tĩnh mạch của 70 nam giới bình thường; áp dụng the technique in determining the polymorphic phương pháp ARMS-PCR xác định đa hình analysis rs671 on the ALDH2 gene; The rs671 trên gen ALDH2 và xác định tần suất alen, frequency of allele G and A was found to be tần suất kiểu gen ở nam giới người Việt. Kết quả 67.51% and 32.86%, respectively. The và kết luận: Đã hoàn thiện được quy trình prevalence of GG and GA genotypes was ARMS-PCR và ứng dụng thành công kỹ thuật 34.29% and 65.71%, respectively, and AA trong xác định phân tích đa hình rs671 trên gen genotypes were not recorded. ALDH2; Phát hiện thấy tần suất alen G và A Key words: ethanol, ARMS-PCR, tương ứng là 67,51% và 32,86%. Tần suất người ALDH2rs671 polymorphism mang kiểu gen GG và GA tương ứng là 34,29% và 65,71%, chưa ghi nhận được kiểu gen AA. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khóa: rượu ethanol, ARMS-PCR, đa hình Rượu ethanol là một trong những đồ uống ALDH2rs671 có cồn phổ biến. Nếu dùng một lượng thích hợp có thể có tác dụng có lợi hoặc ít nhất là SUMMARY không gây độc hại cho cơ thể. Song, nếu STUDY ON ALDH2 rs671 dùng quá liều có thể gây ra các hậu quả khôn POLYMORPHISM RELATES TO lường. Ethanol khi được uống vào cơ thể sẽ ALCOHOL METABOLISM IN được chuyển hóa chủ yếu tại gan và thải trừ VIETNAMESE MAN bằng một số con đường. Gen ALDH2, là một Objectives: To complete the ARMS-PCR trong các các gen chính mã hóa các enzym protocol to identify rs671 polymorphic on tham gia chuyển hóa thải trừ ethanol. Một số ALDH2 gene and frequency of rs671 đa hình gen có tính cá thể của các gen này polymorphism in Vietnamese men. Subjects and ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa, khử độc, thải trừ ethanol. Mỗi người nên kiểm *Học viện Quân Y soát liều lượng rượu trên cơ sở khả năng Chịu trách nhiệm chính: Trần Văn Khoa chuyển hóa, khử độc, thải trừ ethanol của Email: tvkhoabio@gmail.com chính bản thân mình. Xét nghiệm đa hình Ngày nhận bài: 10.9.2020 gen là một công cụ mang lại thông tin về Ngày phản biện khoa học: 13.10.2020 điều đó. Ngày duyệt bài: 19.11.2020 112
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 Nhiều cảnh báo cũng cho thấy, Việt Nam - Khảo sát tần suất đa hình gen rs671ở là một trong số các nước có lượng tiêu thụ nam giới người Việt. rượu bia cao nhất. Trong khi đó, nhiều tài liệu cho thấy người châu Á có khiếm khuyết II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU di truyền liên quan đến gen chuyển hóa 2.1. Đối tượng nghiên cứu. ethanol với tần suất cao hơn nhiều người Mẫu bệnh: 3ml mẫu máu tĩnh mạch, chống châu Âu da trắng và một số chủng tộc khác đông bằng ETDA của 70 nam giới người Việt. trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay còn rất Lấy mẫu ngẫu nhiên, kiểu thuận tiện. ít các nghiên cứu về tần suất đa hình các gen Địa điểm nghiên cứu tại Bộ môn Sinh học liên quan chuyển hóa ethanol trên đối tượng và Di truyền Y học, Học viện quân y. nam giới người Việt- đối tượng thường hay Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2019 uống rượu, bia và có thể bị nghiện rượu cao đến tháng 5/2020. hơn so với nữ giới; cũng là đối tượng đễ bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu. các tổn thương ảnh hưởng đến sức khỏe do * Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu rượu bia gây ra. (mẫu chứng và mẫu bệnh) thu thập được: Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành tách chiết bằng kít tách chiết DNA từ máu nghiên cứu này với mục đích: toàn phần của Favorgen. - Xây dựng quy trình phát hiện đa hình * Khuếch đại đoạn gen bằng phương pháp rs671 trên ALDH2 liên quan đến chuyển hóa ARMS-PCR với các trình tự mồi được tham rượu bằng kĩ thuật sinh học phân tử dễ áp khảo theo Shupeng Jiangvà cộng sự, 2017, dụng tại Việt Nam. có một số thay đổi [6]. Bảng 1: Trình tự các mồi sử dụng cho đa hình gen ALDH2 Kích Mồi Trình tự mồi (5’-3’) thước sản phẩm (bp) Mồi xuôi trong (alen A, hoạt 5’-GAGTACGGGCTGCAGGCATACAATA-3’ (1+4) 290 tính enzym giảm) (1) Mồi ngược trong (alen G, hoạt tính 5’-GGTCCCACACTCACAGTTTTCACGTC-3’ (2+3) 221 enzym bình thường) (2) Mồi xuôi ngoài 5’-AAAATAAAGACTTTGGGGCAATACAGGGTGT-3’ (3) (3+4) 463 Mồi ngược 5’-ATTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCCAG-3’ ngoài (4) 113
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của băng tương ứng với từng alen thuộc đa hình PCR cơ bản: các mồi liên kết bổ sung đặc phân tích. hiệu với mạch gốc ở đầu 5’ và 3’ và khuếch đại tạo thành nhiều nhân bản gen mong muốn. Sự khác biệt, đó là trong kỹ thuật ARMS 2 cặp mồi được sử dụng: 1 cặp mồi cho gen bình thường và một cặp mồi cho gen bị đột biến. Các cặp mồi này sẽ cho các sản Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau và đơn mồi với cặp mồi ngoài (3+4). từ đó có thể xác định được kiểu gen của đối (-): Chứng âm; M: Marker ladder 100bp; 1- tượng nghiên cứu. Trường hợp nếu sản phẩm 7: mẫu. xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng với kích thước khuếch đại của cặp mồi bình thường, đồng nghĩa với việc mẫu nghiên cứu âm tính với đột biến; tương tự như vậy, nếu xuất hiện 1 băng có kích thước bằng kích thước sản phẩm khuếch đại của cặp mồi đột Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR biến, đồng nghĩa với việc mẫu nghiên cứu đơn mồi với cặp mồi cho kiểu dại (2+3). dương tính với đột biến và 2 băng bằng kích (-): Chứng âm; M: Marker ladder 100bp; 1- thước của cả 2 cặp mồi thì có thể kết luận 7: mẫu. tương ứng mẫu đó bị đồng hợp và mang gen đột biến [2]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3%, phân tích kết quả. Kết quả được kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger sản phẩm PCR đơn mồi từ cặp mồi chung. *Xử lý số liệu thống kê: Sử dụng phần mềm MedCalc, xác định tần suất alen, kiểu Hình 3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen. đơn mồi với cặp mồi cho đột biến (1+4). (-): Chứng âm; M: Marker ladder 100bp; 1- III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 7: mẫu. 3.1. Hoàn thiện quy trình ARMS-PCR phát hiện đa hình gen rs671 Quá trình được chuẩn hóa theo thứ tự: 1) Chạy gradient nhiệt cho từng cặp mồi riêng - chạy PCR đơn mồi để chọn ra nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng cặp mồi. 2) Chạy PCR đa mồi dựa trên nhiệt độ Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm AMS- gắn mồi thỏa mãn cho các cặp mồi. PCR một số mẫu khi chưa chuẩn hóa. 3) Điều chỉnh tỉ lệ thành phần, chu trình (-): Chứng âm; M: Marker ladder 100bp; nhiệt phản ứng PCR để thu được tất cả các 1-10: mẫu. 114
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 Theo kết quả điện di ban đầu, nhận thấy DNA mẫu và chu trình nhiệt để cho các băng đối với đa hình rs671, các băng lên mờ, diện di rõ. không rõ kích thước. Vì vậy, chúng tôi đã Kỹ thuật ARMS-PCR đã được chuẩn hóa tiến hành điều chỉnh nồng độ mồi, nồng độ với các thành phần như bảng 3.1: Bảng 2: Thành phần phản ứng ARMS-PCR Thành phần Thể tích (µl) Mồi xuôi trong (alen A) 0,5 Mồi ngược trong (alen G) 0,5 Mồi xuôi ngoài (3) 0,75 Mồi ngược ngoài (4) 0,75 H2O 2,5µl DNA mẫu 5µl Tổng 20µl Chu trình nhiệt sau khi đã được tối ưu được trình bày ở bảng 3.2: Bảng 3: Chu trình nhiệt phản ứng ARMS-PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95ºC 5 phút 1 chu kỳ 94ºC 40 giây 64ºC 40 giây 40 chu kỳ 72ºC 40 giây Kết quả điện di sản phẩm ARMS – PCR Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm ARMS- PCR của đa hình rs671ở một số mẫu. (-): Chứng âm; M: Marker 100 bp; 1-14: 2 băng có kích thước 221bp và 290bp;người Sản phẩm PCR của nhóm nam giới không mang đột biến (GG), sẽ xuất hiện Kiểu gen GG: mẫu 399, 402, 420 và 445; băng có kích thước 221bp; người mang đột Kiểu gen AG: mẫu 380, 400, 404, 406, 422, biến (AA), sẽ xuất hiện băng có kích thước 430, 447, 455, 466 và 517. 290bp và đối chứng âm (H2O) không xuất Ở người mang đa hình rs671 ở dạng dị hiện băng nào (Hình 5). Sau khi thực hiện tối hợp tử (AG), kết quả điện di sẽ có xuất hiện ưu nồng độ mồi và chu trình nhiệt, sản phẩm 115
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN khuếch đại gen có các băng sản phẩm lên rõ ARMS-PCR và các phương pháp giải ràng, kích thước của sản phẩm khuếch đại trình tự gen. của đa hình rs671 phù hợp với dự kiến theo Khi kiểm chứng quy trình bằng giải trình thiết kế; tất cả các mẫu tách DNA đều lên tự Sanger ngẫu nhiên 10% trong số mẫu của băng sản phẩm khuếch đại của gen nội chứng nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả hoàn có kích thước 463bp. Kết quả cho thấy băng toàn đồng nhất giữa phương pháp ARMS- xuất hiện khi điện di sản phẩm PCR đều rõ PCR và giải trình tự Sanger. Trong đó, ràng, đúng kích thước thiết kế và không xuất phương pháp giải trình tự Sanger được coi là hiện băng phụ. Như vậy, đã tối ưu hóa được tiêu chuẩn vàng với độ tin cậy cao. Điều đó phản ứng ARMS-PCR đối với đa hình rs671. chứng tỏ kết quả phương pháp chạy ARMS – So sánh kết quả giữa phương pháp PCR hoàn toàn đáng tin cậy. Hình 6: Kết quả giải trình tự phân tích đa hình gen ALDH2 (mẫu 505, kiểu gen GG). Hình 7: Kết quả giải trình tự phân tích đa hình gen ALDH2 (mẫu 416, kiểu gen GA). Kết quả ARMS-PCR và giản trình tự Sanger phù hợp với nhau. 3.2. Xác định tần suất đa hình RS671 trên gen ALDH2 Sau khi chuẩn hóa được quy trình, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu còn lại. Bảng 4: Kết quả phân tích tần suất alen thuộc đa hình s671 Alen Số lượng Tân suất (%) p Alen G 94 67,14 3,84, cho thấy kiểu gen chưa ở trạng thái cận bằng, có thể do chưa đại diện cho quần thể lớn cả nam, nữ. 116
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 IV. BÀN LUẬN khác cũng cho kết quả tương tự như Shupeng 4.1. Về hoàn thiện quy trình kỹ thuật Jiang và cộng sự, 2017 [6], Lili Zhang, ARMS-PCR. Limei Dong, Qian Ma, Guocai Yang [4]. Kỹ ARMS-PCR là một kỹ thuật có nhiều ưu thuật này có đặc điểm tiện lợi, chỉ cần một điểm. Nguyên liệu, vật tư tương tự như PCR phản ứng multiplex PCR có thể phát hiện chuẩn thông thường nên mang tính phổ đồng thời hai loại alen, chi phí thấp hơn so thông có thể áp dụng được tại nhiều cơ với các kỹ thuật khác như PCR-RFLP, phòng thí nghiệm sinh học phân tử thông Realtime-PCR, giải trình tự gen…[5]. thường. Khó khăn nahats của kỹ thuật là phải 4.2. Về tần suất alen và tần suất kiểu chuẩn hóa được tỷ lệ, thành phần phản ứng, gen đa hình rs671. nhiệt độ gắn mồi, chu trình nhiệt để đảm bảo So sánh kết quả tần số alen và tần suất khuyeechs đại được tất cả các sản phẩm theo kiểu gen đa hình rs671 với một số nghiên thiết kế trong một phản ứng. Kết quả này của cứu khác, chúng tôi thấy như sau: chúng tôi cũng cho thấy, kỹ thuật ARMS- PCR có độ tin cậy cao. Một số nghiên cứu Bảng 6: Một số kết quả phân tích đa hình rs671. Tần kiểu gen và alen Tác giả Nước GG GA AA G A Chao, và cộng sự, 2003 [1] Trung quốc 50,00 40,00 10,00 70,0 30,00 Kim và cộng sự, 2004 [3] Hàn quốc 53,19 30,85 15,96 68,61 31,39 Yokoyama và cộng sự, 2013 Nhật Bản 50,00 41,74 8,26 70,86 29,14 [7] Nghiên cứu này Việt nam 34,29 65,71 0,00 67,14 32,86 Số liệu ở Bảng 6 cho thấy: về tần số alen, kết quả của chúng tôi cũng tương đương với kết quả của một số tác giả khác ở châu Á. Tuy nhiên tần suất kiểu gen lại có sự khác biệt. Kiểu gen GA ở nam giới người Việt lại có tần suất cao hơn kiểu gen GG. Đây cũng có thể là một điểm khác biệt cần có nghiên cứu quy mô lớn hơn để khẳng định V. KẾT LUẬN - Kết quả khảo sát bước đầu về tần suất đa Nghiên cứu tiến hành phân tích đa hình hình rs671 trên 70 nam giới người Việt Nam: rs671 gen ALDH2 bằng kỹ thuật ARMS- alen G có tần số cao (67,14%), alen A PCR trên 70 nam giới Việt Nam, chúng tôi (32,86); kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao thu được một số kết quả sau: (65,71%), kiểu gen GG chiếm 34,29, chưa - Đã hoàn thiện được quy trình ARMS- phát hiện thấy kiểu gen AA. PCR để phân tích đa hình rs671 trên gen ALDH2. KIẾN NGHỊ - Tiếp tục ứng dụng quy trình ARMS – 117
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN PCR trong phân tích đa hình gen ALDH2với 4. Lili Zhang, Limei Dong, Qian Ma, et al. cỡ mẫu lớn hơn cùng với phát hiện nguy cơ (2018). “Association of ALDH2 rs671 một số bệnh lý khác trên thực tế lâm sàng: polymorphism with essential hypertension: a ung thư vảy thực quản, tăng huyết áp… case-control study in non-drinking Han - Áp dụngARMS – PCR phân tích đa hình Chinese”. Int J Clin Exp Med; 11(6):6222- 6227. ALDH2 với cỡ mẫu lớn hơn và một số đa 5. Lina Zhang, Jinzhao Zhao, Guanglin hình gen khácADH1B, ANKK1liên quanvới Cui, et al. (2015). “Genotyping on ALDH2: chuyển hóa đào thải rượu trong cơ thể người Comparison of Four Different Technologies”. để dự phòng và điều trị các bệnh lý liên quan PLoS One; 10(3): e0122745. đến rượu một cách có hiệu quả. 6. Shupeng Jiang, Yongqing Tong, Bin Qiao, et al. (2017). “Simple and reliable genotyping TÀI LIỆU THAM KHẢO of ALDH2 rs671 in the patients with acute 1. Chao YC, Wang SJ, Chu HC. et al. (2003). alcoholism intoxication using Tetra-Primer “Investigation of alcohol metabolizing ARMS PCR”, Int J Clin Exp enzyme genes in Chinese alcoholics with Med;10(3):5649-5655. avascular necrosis of hip joint, pancreatitis 7. Yokoyama A, Mizukami T, Matsui T, et al. and cirrhosis of the liver”. Alcohol Alcohol; (2013). “Genetic polymorphisms of alcohol 38: 431-6. dehydrogenase-1B and aldehyde 2. Hamzeh Mesrian Tanha et al. (2015). dehydrogenase-2 and liver cirrhosis, chronic “Modified Tetra-Primer ARMS PCR as a calcific pancreatitis, diabetes mellitus, and Single-Nucleotide Polymorphism Genotyping hypertension among Japanese alcoholic men. Tool”. Genet Test Mol Biomarkers. Mar;19 Alcohol Clin Exp Res; 37:1391-401. (3):156-61. 3. Kim MS, Lee DH, Kang HS, et al. (2004). (Xuất xứ công trình: Đề tài cấp cơ sở “Genetic polymorphisms of alcohol- HVQY, 2020; Tiến hành tại Bộ môn Sinh học metabolizing enzymes and cytokines in và Di truyền Y học, thời gian từ 5/2019 đến patients with alcohol induced pancreatitis and tháng 5/2020; Chịu trách nhiệm chính: Trần alcoholic liver cirrhosis”. Korean J Văn Khoa; tel. 0384552737; email: Gastroenterol; 43:355-63. tvkhoabiomed@gmail.com) 118