Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản sinh men Betalactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình và Sóc Sơn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN XUÂN BÁCH

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản sinh men Beta- lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại

Thái Bình và Sóc Sơn

2016

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến TS. Đặng Thị

Thanh Sơn đã tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học –

Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, toàn thể cán bộ Phòng Công

nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Phòng Công nghệ sinh học tái

tạo môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập,

thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Bộ môn Vệ sinh Thú y- Viện Thú y

đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo,

các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học.

Luận văn này là một phần kết quả của đề tài có mã số 106-YS thuộc Quỹ

phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED). Tôi xin chân thành

cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài.

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình,

bạn bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được

cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4

1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 4

1.1.1. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli ...................................................... 6

1.1.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli ................................................. 6

1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E. coli ................................................ 7

1.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli ..................................... 7

1.2.1. Hiểu biết về thuốc kháng sinh ............................................................... 7

1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn ........................................... 12

1.2.3. Enzyme beta-lactamase........................................................................ 16

1.3. Một số nghiên về tính kháng thuốc của vi khuẩn trong và ngoài nước ..... 20

1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 20

1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước ............................................................. 22

CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 24

2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 24

2.1.2. Hóa chất sử dụng ................................................................................. 25

2.1.3. Thiết bị sử dụng ................................................................................... 25

2.1.4. Phần mềm tin sinh học ......................................................................... 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 27

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E. coli ..................................... 27

2.2.2. Nhân đoạn gen kháng kháng sinh của E. coli bằng phản ứng PCR .... 28

2.2.3. Phương pháp điện di kiểm tra kết quả ................................................. 33

2.2.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger ...................... 33

2.2.5. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide ......................................... 34

iii

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 36

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

3.1. Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin của các chủng E. coli kháng cefotaxime phân lập từ Thái Bình và Sóc Sơn ................ 36

3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của một số gen kháng kháng sinh .................. 40

3.2.1. Giải trình tự các gen kháng kháng sinh thu được ................................ 40

3.2.2. Đặc điểm sinh học phân tử gen CTX -M ............................................. 43

3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử gen TEM .................................................. 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 54

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

E. coli Escherichia coli

ESBL Extended Spectrum beta-lactamase

ADN Deoxyribonucleic acid

ARNt ARN de transport

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase Chain Reaction

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

UV Ultraviolet

Bla Beta-lactamase

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CDS Coding DNA sequence

cs Cộng sự

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin ................................... 12

Bảng 2.1. Số lượng chủng E. coli nghiên cứu…………………………………………..24

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ................................................... 26

Bảng 2.3. Phần mềm sử dụng ............................................................................... 27

Bảng 2.4. Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM, SHV

and CTX-M (Hasman et al. 2005) ....................................................................... 32

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ............................................................ 32

Bảng 3.1. Tỷ lệ phát hiện gen CTX-M và gen TEM ở các chủng E. coli kháng

cefotaxime………………………………………………………………………37

Bảng 3.2. Nguồn gốc các chủng E. coli được giải trình tự gen kháng kháng sinh

.............................................................................................................................. 41

Bảng 3.3. Bảng kí hiệu gen CTX-M .................................................................... 43

Bảng 3.4.Vị trí đột biến nucleotit gen CTX-M .................................................... 44

Bảng 3.5. Vị trí đột biến axit amin ....................................................................... 46

Bảng 3.6. Nhóm các gen có trình tự nucleotit giống nhau .................................. 48

Bảng 3.7. Bảng kí hiệu gen TEM……..……………………………………….. 49

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình mô tả vi khuẩn E. coli ........................................................................ 5

Hình 1.2. Cấu trúc của vòng beta-lactam .................................................................. 10

Hình 1.3. Cấu trúc chung của cephalosporin ............................................................ 11

Hình 1.4. Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các R-plasmid

(ảnh nguồn internet) .................................................................................................. 15

Hình 1.5. Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron ......................... 16

Hình 1.6. Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse ................................................ 20

Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli trên môi trường thạch………………………………25

Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR ................................................................ 29

Hình 2.3. Các bước của một chu kì PCR .................................................................. 31

Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger .......................... 33

Hình 2.5. Kiểm tra chất lượng tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự .............................. 34

Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông ......... 35

Hình 3.1. Kết quả phát hiện gen TEM của một số chủng E. coli bằng phản ứng

PCR……………………………………………………………………………..36

Hình 3.2. Kết quả phát hiện gen CTX-M của một số chủng E. coli bằng phản ứng

PCR ........................................................................................................................... 36

Hình 3.3.Tỉ lệ chủng E. coli ở người mang gen kháng kháng sinh .......................... 38

Hình 3.4. Tỉ lệ chủng E. coli ở lợn mang gen kháng kháng sinh .............................. 38

Hình 3.5. Kết quả phát hiện gen SHV của một số chủng E. coli bằng phản ứng PCR

................................................................................................................................... 40

Hình 3.6. Hình ảnh quá trình xử lý trình tự nucleotit của gen CTX-M .................... 42

Hình 3.7. So sánh mức độ tương đồng của các gen CTX-M với các gen trên ngân

hàng gen thế giới ....................................................................................................... 42

Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotit gen CTX-M ...................................................... 44

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotit gen TEM .......................................................... 50

vii

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách MỞ ĐẦU

Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chưa được quản lý chặt chẽ (về

liều lượng kháng sinh, cách pha trộn,và dùng kháng sinh theo thói quen) sẽ

dẫn đến hiện tượng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm và các sản phẩm từ

chăn nuôi gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người [52]. Nguy

hiểm hơn cả là tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh. Vấn

đề vi khuẩn kháng thuốc trong những năm gần đây trở thành vấn đề toàn cầu

khi ngành chăn nuôi, và đặc biệt là khi chăn nuôi lợn đang phát triển mạnh

mẽ. Với đặc điểm thời tiết nóng ẩm mưa nhiều ở nước ta, dịch bệnh ở đàn lợn

nuôi thường xuyên xảy ra. Một trong những biện pháp chính để phòng trị

bệnh xảy ra trong chăn nuôi lợn là sử dụng thuốc kháng sinh, không chỉ riêng

ở Việt Nam mà ở nhiều nước trên thế giới [26]

Vi khuẩn kháng kháng sinh luôn là vấn đề quan tâm của các nước trên

thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. Theo Son và cs (2011), vi khuẩn

kháng lại kháng sinh đang tiếp tục gây nên những tổn thất nặng nề về kinh tế

trong chăn nuôi và gây nguy hiểm đến tính mạng của người bệnh và vật nuôi

[48]. Vi khuẩn và gen kháng thuốc của vi khuẩn có thể nhanh chóng lan

truyền ra môi trường, kể cả trong bệnh viện, cộng đồng và trong chăn nuôi.

Trong khi tốc độ đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng thì việc nghiên cứu

tìm ra các loại kháng sinh mới để điều trị thì gặp khó khăn. Như vậy trong

cuộc chạy đua dành ưu thế thì vi khuẩn đang vươn lên dẫn trước. Khoảng

cách giữa khả năng vi khuẩn biến đổi để trở thành chủng kháng kháng sinh và

khả năng con người kiểm soát được vi khuẩn đang được nới rộng. Vì vậy, nếu

chúng ta không có biện pháp làm giảm tốc độ kháng thuốc kịp thời thì sẽ đẫn

đến hậu quả không có thuốc kháng sinh để điều trị.

Kháng sinh nhóm beta-lactam được biết đến sớm nhất trong lịch sử

kháng sinh và có vai trò đặc biệt trong điều trị nhiễm khuẩn. Hiện nay nhóm

beta-lactam có số lượng kháng sinh lớn nhất, chiếm ba phần tư tổng số lượng

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách kháng sinh đang lưu hành. Trong những năm gần đây, các kháng sinh

Cephalosporin được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng nói chung và

trong điều trị thú y nói riêng. Do được sử dụng rộng rãi nên tỷ lệ vi khuẩn đề

kháng các kháng sinh này là rất cao, nhất là ở các vi khuẩn Gram âm. Hiện

nay đã xuất hện nhiều chủng vi khuẩn Gram âm sinh men beta-lactamase và

beta-lactamase phổ rộng (ESBL: Extended Spectrum beta-lactamase) đề

kháng các kháng sinh nhóm beta-lactam, bao gồm các kháng sinh phổ rộng

như Cephalosporin. Sinh ESBL vẫn là nguyên nhân chủ yếu gây gia tăng đề

kháng kháng sinh nhóm beta-lactam ở những vi khuẩn Gram âm như:

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa đặc biệt là Escherichia coli.

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện sự tương đồng kiểu

hình và kiểu gen của các chủng E. coli sản sinh enzyme beta-lactamse được

phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân, sản phẩm chăn nuôi, và môi trường.

Vi khuẩn E. coli dễ dàng được phát hiện trong chất thải chăn nuôi (Son et

al., 2011) [47]. Đây là vi khuẩn chính gây bệnh đường tiêu hóa ở lợn và

người. Việc quản lý chất thải trong ngành chăn nuôi chưa được thực hiện một

cách triệt để nên một lượng lớn chất thải lợn được xả thẳng ra môi trường.

Đặc biệt đối với các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ thì việc sử dụng đồ bảo hộ, các công

cụ hỗ trợ việc ngăn chặn vi khuẩn từ vật nuôi sang người trực tiếp chăn nuôi

gần như chưa có. Đây là nguy cơ làm cho các vi khuẩn, trong đó có các vi

khuẩn kháng kháng sinh có trong chất thải chăn nuôi lây nhiễm sang người.

Đây phải chăng là những nguyên nhân cơ bản làm tăng khả năng kháng kháng

sinh của E. coli ở đàn lợn và làm lây nhiễm E. coli kháng thuốc cho người

chăn nuôi lợn (do thường xuyên tiếp xúc với chất thải chăn nuôi).

Để làm sáng tỏ hiện tượng lây truyền gen kháng thuốc của vi khuẩn E.

coli từ vật nuôi sang người, tôi thực hiện đề tài khoa học“Nghiên cứu đặc

điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách sinh men Beta-lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình

và Sóc Sơn”

Kết quả sử dụng trong luận văn được trích từ kết quả của đề tài

NAFOSTED có mã số 106-YS.

Mục tiêu của đề tài.

- Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh nhóm

Cephalosporin (sản sinh enzyme beta-lactamase) phân lập từ chất thải của

người chăn nuôi, chất thải của lợn và môi trường.

- Xác định trình tự gen kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sản sinh

enzyme beta-lactamase

- Đánh giá sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh của E. coli

được phân lập từ người chăn nuôi và lợn

Ý nghĩa của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu khoa học cung cấp thông tin

về thực trạng nhiễm vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin

ở lợn và người chăn nuôi

- Làm cơ sở khoa học cho việc khẳng định có hay không hiện tượng

truyền lây gen kháng thuốc beta-lactam qua plasmid giữa người và lợn để

từng bước kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc, ngăn chặn nguy cơ kháng kháng

sinh của vi khuẩn ở Việt Nam.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)

Vi khuẩn Escherichia do nhà khoa học Escherich phát hiện lần đầu tiên năm

1885. Giống Escherichia được chọn là đại diện điển hình của họ vi khuẩn

đường ruột. Giống này gồm nhiều loại như E. coli, E.adecarboxylase,

E.blattae, E.fergusonii, E.hermanii và E.vulneris. Trong đó E. coli có vai trò

quan trọng nhất và được chọn là loài điển hình của giống Escherichia, chiếm

80% các vi khuẩn hiếu khí kí sinh ở đường ruột của người

Trước đây vi khuẩn Escherichia coli được gọi là Bacterium coli commune hay

Bacilus coli commnis, lần đâu tiên được phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy

năm 1885 và được đặt theo tên của người bác sĩ nhi khoa Đức Theodor

Escherich [5]. Vi khuẩn E. coli tổng hợp một số sinh tố B, E, K và tạo quần

thể vi khuẩn cân bằng ở ruột. Đồng thời E. coli cũng là nguyên nhân gây nên

một số bệnh.

Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn Gram (-) có kích thước trung bình là 2-3 µm x

0,3-0,6 µm, trong môi trường nuôi cấy như canh khuẩn già xuất hiện những

trực khuẩn dài 4-8µm hoặc vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.

coli có vỏ nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động, chúng không sinh

nha bào và có thể có giáp mô. Vi khuẩn E. coli sống ở nhiều nơi trong môi

trường, đặc biệt có cả trong cơ thể người và động vật. Trong ruột, E. coli sống

hòa bình và giúp cơ thể tổng hợp các loại vitamin K, B. Hiện nay, đã tìm ra

hàng trăm chủng vi khuẩn E. coli. Hầu hết các chủng E. coli là vô hại và sống

trong đường ruột của người và động vật khỏe mạnh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 1.1. Hình mô tả vi khuẩn E. coli

(ảnh nguồn internet)

Theo phân lọai vi khuẩn E. coli là vi khuẩn thuộc:

Bộ: Eubacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Tộc: Escherichiae

Giống: Escherichia

Loài: Escherichia coli

Nơi cư trú chính của Escherichia coli thường ở phần sau của ruột, ít khi

ở dạ dày hay ở phần trước ruột các loài động vật như: ngựa, bò, dê, cừu, lợn,

chó, mèo, gia cầm và người. Chúng theo phân của người hay gia súc đào thải

ra ngoài, loài ăn thịt bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. E. coli xuất hiện và

sinh sống rất sớm trong đường ruột người và động vật, chỉ vài giờ sau sinh

(sau khi đẻ 2 giờ) và tồn tại đến khi con vật chết.

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001). Các chủng E. coli không gây

bệnh mà chỉ khi các điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và

trên cơ sở mắc kế phát sau các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, … dẫn tới sức

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli mới trở nên cường độc và

có khả năng gây bệnh [6].

1.1.1. Sức đề kháng của vi khuẩn E. coli

Vi khuẩn E. coli không sinh nha bào nên có sức đề kháng yếu, bị diệt ở

nhiệt độ 55oC trong 1 giờ hoặc 60oC trong vòng 30 phút, đun sôi 100oC thì

chết ngay. Những chủng vi khuẩn E. coli trong phân có xu hướng đề kháng

cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. Ở môi trường

bên ngoài, các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng [6]

Các chất sát trùng thông thường như axit Phenic 3%, Hydroperoxit 1%,

Focmon 1%... có thể diệt vi khuẩn trong 5 phút.

1.1.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli

E. coli là thành viên thuộc nhóm vi khuẩn thông thường sống trong

đường tiêu hóa của người và vật nuôi, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi

khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, E. coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng , nó

đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm

đường mật. E. coli gây bệnh bởi nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố

không phải là độc tố bao gồm:

- Khả năng bám dính: yếu tố bám dính giúp vi khuẩn thực hiện bước

đầu tiên của quá trình gây bệnh là bám dính lên niêm mạc ruột nhờ một hay

nhiều yếu tố bám dính. Chúng có 4 yếu tố bám dính quan trọng là F4, F5, F6,

F41.

- Khả năng xâm nhập: là khả năng vi khuẩn qua được hàng rào bảo vệ

lớp musoca trên bề mặt ruột non và tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát

triển trong lớp tế bào này, tránh sự đại thực bào.

- Khả năng gây dung huyết: khả năng sản sinh ra Heamolysin của E.

coli có thể được coi như một yếu tố độc lực quan trọng. Kiểu dung huyết quan

trọng nhất là kiểu α và β.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

- Tính kháng kháng sinh: Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh

của E. coli nằm trong plasmid. Các plasmid nằm trong tế bào vi khuẩn thuộc

họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E. coli nói riêng có khả năng tồn tại,

nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan

trọng có thể gây nên hiện tượng kháng thuốc và có thể truyền ngang (lây

truyền giữa các loài vi khuẩn khác nhau) hoặc truyền dọc (lây truyền tính

kháng thuốc giữa các vi khuẩn cùng loài). Sử dụng một thuốc hóa học điều trị

nào điều trị E. coli trong một thời gian dài dẫn đến khả năng kháng không chỉ

thuốc đó mà còn kháng cả thuốc khác [4], [7]

1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn E. coli

Vật liệu di truyền của vi khuẩn E. coli là ADN. Có hai loại ADN là

ADN nhiễm sắc thể và ADN ngoài nhiễm sắc thể. ADN nhiễm sắc thể là một

phân tử ADN xoắn kép dạng vòng tạo nên nhiễm sắc thể duy nhất. ADN

ngoài nhiễm sắc thể hay còn gọi là plasmid.

Plasmid cũng là ADN hai sợi xoắn kép dạng vòng, chúng chứa nhiều

gen mã hóa cho nhiều đặc tính không thiết yếu cho sự sống của tế bào nhưng

có thể giúp cho E. coli tồn tại dưới áp lực của chọn lọc. Nhờ plasmid mà

chúng có thể vận chuyển yếu tố di truyền cho tế bào khác qua các cơ chế: biến

nạp, tải nạp và tiếp hợp.

1.2. Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli

1.2.1. Hiểu biết về thuốc kháng sinh

1.2.1.1. Định nghĩa [3], [8]

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của

nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh.

Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị.

Năm 1942, Waksman (là người phát hiện ra streptomycin và được giải

Nobel) đã định nghĩa:

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

“Một chất kháng sinh hay một hợp chất có tính kháng sinh là một chất

do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc thậm chí

tiêu diệt các vi khuẩn khác”.

Năm 1950, Baron bổ sung và giới hạn định nghĩa như sau: “Kháng

sinh là những chất được tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự

phát triển hay sự tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”.

Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà

còn được tạo ra bằng quá tình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó

định nghĩa về kháng sinh cũng được thay đổi, hiện nay kháng sinh được định

nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán

tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều lượng thấp có tác dụng kìm hãm

hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh”.

2.2.1.2. Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh

 Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn

Chất kháng sinh ức chế tổng hợp mucopeptid ở vách thế bào vi khuẩn.

Thuộc nhóm này gồm có các beta-lactam, Cephalosporin… Penicillin

và các dẫn xuất beta-lactam có cấu trúc giống như chuỗi peptid do vi khuẩn

tổng hợp nên để tạo màng tế bào. Do vậy, khi tổng hợp màng tế bào, vi khuẩn

tạo phức nhầm với các chất đó, phức hợp này bền vững và không hồi phục.

Phản ứng xuyên mạch tạo màng bị cản trở.

Một số kháng sinh lại có tác dụng vào việc vận chuyển, trùng hợp

mucopeptid. Chúng có tác dụng phá hoại chức năng màng nguyên sinh của tế

bào vi khuẩn. Thuộc nhóm này có 30 chất, trong đó có: Polymicin B, Colistin,

Bacitracin, Anbomycin, Vancomycin, Ristomycin.

 Kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

Kháng sinh làm tổng hợp protein bất thường: Đại diện nhóm này là

Streptomycin, tác dụng gây ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức

ribosome. Thuốc gắn vào tiểu phần 30S của ribosom. Qua đó làm đọc sai mã

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách di truyền, dẫn đến việc tổng hợp tích lũy những polypeptide sai lạc. Thuốc có

tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn.

Kháng sinh phong bế tổng hợp protein: Đại diện nhóm này là

Chloramphenicol, thuốc gắn với tiểu phần 50S, 70S của ribosom trong tế bào,

ngăn cản mạch peptid kéo dài. Chlophenicol làm quá trình tổng protein của vi

khuẩn bị đình trệ ngay. Các thuốc thuộc nhóm Tetracycline lại gây ức chế quá

trình tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào phần 30S của ribosom

nên ức chế gắn aminoacyl – ARNt mới vào vị trí tiếp nhận trên phức hợp

ARNm-ribosom gây gián đoạn quá trình tỏng hợp chuỗi peptid.

 Thay đổi tính thấm của màng tế bào

Màng có tính thấm chọn lọc đối với các ion để duy trì sự ổn định cho

các thành phần bên trong màng. Các kháng sinh tác động lên màng, làm thay

đổi tính thấm của màng, gây rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào vi

khuẩn với môi trường làm vi khuẩn bị tiêu diệt.

 Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp axit folic)

Axit folic cần cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn.Các kháng sinh

kháng chuyển hóa có khả năng ức cạnh tranh với enzyme làm nhiệm vụ tổng

hợp và chuyển hóa axit folic. Kết quả là quá trình tổng hợp và chuyển hóa

axit folic bị ngưng làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt

1.2.1.3. Phân loại thuốc kháng sinh

Có nhiều cách phân loại thuốc kháng sinh như: Phân loại theo nguồn

gốc, phân loại theo hoạt phổ kháng sinh, phân loại theo mức độ tác dụng,

phân loại theo cơ chế tác dụng, phân loại theo cấu trúc hóa học,…Tuy nhiên

phân loại theo cấu trúc hóa học là cách phân loại thông dụng nhất vì hoạt phổ

kháng sinh, mức độ tác dụng, cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học luôn liên

quan chặt chẽ với nhau [2]. Với cơ sở này, người ta phân loại thuốc kháng

sinh thành các nhóm sau:

1. Kháng sinh Beta-lactam

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

2. Kháng sinh Aminoglycosid

3. Kháng sinh Tetracyclin

4. Cloramphenicol và dẫn chất

5. Kháng sinh Macrolid

6. Kháng sinh Lincosamid

7. Các kháng sinh khác: Rifamycin

+ Kháng sinh nhóm beta-lactam [8]

 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta - lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm beta-lactam đều có vòng beta-lactam trong

cấu trúc phân tử. Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hoá học 4 cạnh

gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N

Hình 1.2. Cấu trúc của vòng beta-lactam

 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta-lactam

Vi khuẩn tổng hợp vách tế bào cần enzyme transpeptidase, xúc tác tạo các

liên kết chéo trong hệ thống peptidoglycans cấu tạo vách tế bào. Kháng sinh

nhóm beta-lactam gắn được vào vị trí hoạt động của transpetidase này nên ức

chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, từ đó vi khuẩn dễ dàng bị tiêu

diệt.

 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Gồm 2 phân nhóm chính: penicillins và cephalosporins [8]

+ Cephalosporin

Lịch sử, cấu tạo

Năm 1948, Abraham và cộng sự phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporinum aeremonium thu được cephalosporin có hoạt tính kháng

khuẩn yếu nên không được dùng trong điều trị. Các cephalosporin hiện đang

dùng là các chất bán tổng hợp từ 7-amino-cephalosporin. Cấu trúc vòng

7ACA cũng dễ bị cephalosporinase phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.

Cấu trúc chung của kháng sinh cephalosporin gồm 2 vòng: vòng beta-

lactam 4 cạnh gắn với một dị vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Hình 1.3. Cấu trúc chung của cephalosporin

- Tính chất hóa học

Vòng beta-lactam trong các cephalosporin kém bền do cộng hưởng en-

amin không tồn tại. So với penicillin thì các cephalosporin bền với axit hơn.

-Tính kháng thuốc

Do vi khuẩn sinh ra enzyme beta-lactamase có tác dụng mở vòng beta-

lactam làm kháng sinh mất tác dụng

Còn các cách kháng không sinh ra enzyme beta-lactamase để thực hiện

gọi là cách kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin)

Hiện nay có 5 thế hệ cephalosporin

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Bảng 1.1. Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin

Cefazolin, Cephalothin, Cephalexin, Cefadroxil,

Thế hệ 1 Cefaloridine, Cefalotin, Cefapirin, Cefazedone,

Ceftezole…

Thế hệ 2 Cefuroxime, Cefaclor, Cefamandole, Cefamycins

Cefoxime, Ceftriaxone, Cefpodoxime, cefodizime,

Thế hệ 3 Ceftizoxime, Ceftazidime…

Thế hệ 4 Cefepime, Cefpirome, Cefquinome, Cefozopran

Thế hệ 5 Cefbiprole, Ceftaroline fosamil

Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, nhóm nghiên cứu tập trung

nghiên cứu phát hiện gen và phân tích mức độ tương đồng gen kháng

Cephalosporin là nhóm kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh do vi khuẩn

E. coli gây ra

1.2.2. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.2.2.1. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

Kháng thuốc kháng sinh là nói đến khả năng của vi khuẩn chống lại

hiệu quả của thuốc kháng sinh. Kháng thuốc xảy ra khi vi khuẩn thay đổi theo

một cách mới để làm giảm hoặc loại bỏ hiệu quả của thuốc chữa bệnh. Một

khi kháng thuốc, vi khuẩn không chết mà vẫn tồn tại và tiếp tục nhân lên, gây

ra nhiều tác hại khác.

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), một vi khuẩn của một loài nhất định

được gọi là đề kháng với thuốc nếu nó có thể sống tồn tại và phát triển được

trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sinh trưởng

và phát triển của phần lớn những cá thể khác hoặc những loài khác trong cùng

một canh khuẩn [5]

1.2.2.2. Phân loại hiện tượng kháng thuốc

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

 Đề kháng tự nhiên

Các gen đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn. Đề kháng tự

nhiên là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài và được biết ngay

từ lúc đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh, xác định phổ tác

dụng của thuốc kháng sinh.

Nguyên nhân do kháng sinh không thể tiếp cận được đích hoặc có ái

lực yếu với đích. Ví dụ: các Pseudomonas kháng kháng sinh nhóm

Macrolides, hoặc vi khuẩn Gram âm kháng Vancomycine đều là tự nhiên.

Đây là sự đề kháng thường xuyên và có nguồn gốc nhiễm sắc thể, ổn định và

di truyền lại cho các thế hệ con cháu (truyền dọc) khi phân chia tế bào, nhưng

không truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (truyền ngang).

 Đề kháng thu được

Đề kháng thu được là khả năng đề kháng một hay nhiều kháng sinh do

biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng.

Những đề kháng thu được có thể là do:

- Đột biến trên NST: qua các thử nghiệm sao chép đĩa của Lederberg

(1952) có thể giải thích được vi khuẩn đề kháng thuốc là do đột biến.

- Nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền như:

tiếp hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị

ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phage hoặc do một thành

phần di truyền di động (transposons).

- Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương

- Làm thay đổi đích tác động

- Làm cho kháng sinh thoát ra ngoài màng tế bào vi khuẩn quá mức

- Tạo ra các enzyme ức chế tác động của kháng sinh:

Cơ chế sinh hóa của sự đề kháng thu được

Cơ sở di truyền học của đề kháng thu được

 Đề kháng thu được do đột biến trên NST

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Đột biến thường xảy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và

pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ

không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước

 Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức

vận chuyển di truyền

Biến nạp

Là hiện tượng một phần nhỏ ADN tự do của vi khuẩn cho vào được tế

bào vi khuẩn nhận, gắn vào bộ gen của vi khuẩn nhận, quyết định tính chất

mới của vi khuẩn này và tính chất này có thể di truyền

Tải nạp

Là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua một

phage ôn hòa làm trung gian, phage này gọi là phage tải nạp

Tiếp hợp

Là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác khi có sự

tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn cho (được gọi là vi khuẩn đực) và vi khuẩn

nhận (được gọi là vi khuẩn cái). Để có thể tiếp hợp được vi khuẩn cho phải có

pili giới tính và toàn bộ hay một phần vật liệu di truyền sẽ được chuyển từ vi

khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua cầu nối pili đó

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 1.4. Sự lan truyền gen kháng thuốc bằng hình thức thông qua các

R-plasmid (ảnh nguồn internet)

Thành phần di truyền động

Là một thành phần của một đơn vị sao chép hoặc là plasmid, nhiễm

sắc thể hoặc là phage nhờ hai chuỗi tận cùng ở hai đầu để chuyển vị trí từ

một phân tử ADN này sang một phân tử ADN khác không cần có sự đồng

dạng của hai phân tử ADN (nó có thể chuyển từ plasmid này sang plasmid

khác, hay từ plasmid vào NST hoặc genome của một phage tải nạp)

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 1.5. Đề kháng thu được do nhận được gen nằm trên Integron

(ảnh nguồn internet)

1.2.3. Enzyme beta-lactamase

Năm 1929 chất kháng kháng sinh đầu tiên được phát hiện là penicillin

từ loài nấm Penicillium bởi Alexander Fleming, đây cũng chính là kháng sinh

đầu tiên của nhóm beta-lactam. Tuy vậy đến năm 1944 lần đầu tiên xuất hiện

S. aureus kháng penicillin do sinh enzyme penicilinase. Sau đó vào những

năm 1948 đến năm 1956 các cephalosporin thế hệ đầu tiên được nghiên cứu

và đưa vào sử dụng gọi là cephalosporin thế hệ 1. [11]

Năm 1961 thế hệ penicillin phổ rộng đầu tiên là ampicillin được ra đời

có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cầu khuẩn Gram dương.

Chỉ vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy lạp từ máu một bệnh nhân tên

là Temoneria người ta phân lập được chủng E. coli kháng ampicillin có sinh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách loại enzyme beta-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này

là TEM-1 [24], [42]

Năm 1965, người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1 biến đổi một axit

amin. Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn Gram âm kháng lại các

penicillins, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 trong một thời gian dài sau

đó, như các thông báo về N. gonorrhoeae kháng pencicllin, H. influenzae và

Shigella spp đề kháng kháng sinh vào những năm 1971 – 1973 ở Châu Á và

nhiêu nơi trên thế giới. [24], [42]

Cho đến năm 1974 chủng K. pneumoniae có gen mã hóa enzyme

lactamase trên plasmid được phát hiện, enzyme này có nhiều thay đổi về axit

amin so với TEM-1 và TEM-2 nên đặt là SHV-1 (Sulphyrul Variable). Như

vậy vi khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV1 nên các penicillins,

cephalosporins thế hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều [42]

Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh bate-lactam phổ rộng như

cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactams được đưa vào điều trị các vi

khuẩn kháng thuốc. Sự ra đời các kháng sinh beta-lactam mới này đặc biệt là

cephalosporins thế hệ 3 đã là thành công của các nhà khoa học trong cuộc

chiến đấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2, SHV-1. Nhưng

rồi có một loại enzyme beta-lactamase có khả năng phân hủy cephalosporins

thế hệ 2, cephalosporins thế hệ 3 và monobactams có nguồn gốc do TEM-1,

TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổi một số axit amin gọi là ESBL đã xuất hiện

[42].

Năm 1983, ở Đức đã phát hiện chủng K. ozaenae sinh enzyme beta-

lactamase phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh

ESBL đầu tiên được ghi nhận. Năm 1984 đến 1987 tại Pháp đã phát hiện

chủng K. pneumoniae có gen mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime

đặt tên là CTX-1. Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và năm

1989 ở Đức, Bauernfein phát hiện E. coli sinh ESBL kháng cefotaxime không

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách phải TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1. Đáng ngai là CTX-M có khả

năng phân hủy hầu hết cephalosporins thế hệ 3 và cả cephalosporins thế hệ 4

[34], [42]

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm beta-lactam ngày càng

nhiều đặc biệt là các cephalosporin thế hệ 3 (oxyimino-beta-lactam) và có

nhiều ESBL được mã hóa qua R-plasmid nên ngày càng làm gia tăng tỉ lệ lẫn

chủng loại ESBL trong đó có các ESBL ngoài TEM, SHV, CTX-M như

OXA-, PER-, VEB…Đến nay các ESBL mới vẫn tiếp tục được tìm thấy. Điều

này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh và hết kháng

sinh điều trị trong một tương lai gần.

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đã biết đến hơn 200 loại ESBL.

Những enzyme này được nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác

nhau và phức tạp. Tuy vậy có hai hệ thống phân loại chính được sử dụng rộng

rãi trên toàn thế giới là hệ thống phân loại của Ambler R. P và hệ thống phân

loại của nhóm tác giả Bush Karen , Jacoby G A và Medeiros A. A. Ambler

chia các beta-lactamase thành 4 lớp: A, B, C và D, một số beta-lactamase lớp

A và D được gọi là ESBL [33], [43], [46]

Type TEM – (ESBL) lớp A

Từ các TEM ban đầu do đột biến thay đổi vị trí các axit amin tạo thành

các enzyme mới, ESBL mới có cấu trúc thay đổi kể cả có sự thay đổi các mức

độ ảnh hưởng đối với chất ức chế. Hiện nay có trên 100 TEM (ESBL) đã tìm

thấy [Boyd 2004 [46]

 Type SHV – (ESBL) lớp A

SHV-1 có sự tương đồng 68% các axit amin so với TEM-1 và có cấu

trúc tương tự. Cũng như nhóm TEM, SHV – (ESBL) cũng có sự thay thế 1

hay nhiều axit amin quanh vị trí hoạt hóa. Có trên 50 SHV đã được biết đến.

Các nhóm SHV – (ESBL) thường gặp là SHV-5 và SHV-12 [42]

 Type CTX – (ESBL) lớp A

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Đặc điểm nổi bật là khả năng phân hủy cefotaxime mạnh hơn khả năng

phân hủy ceftazidime, các thành viên CTX-M hay gặp là CTX-M-14, CTX-

M-3, CTX-M-2 [15], [42]

1.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli Một số chủng thuộc

họ vi khuẩn đường ruột có khả năng đề kháng tự nhiên với với kháng sinh

nhóm beta-lactam , nó mang đặc tính di truyền bình thường của loài. Nghiên

cứu trên những chủng vi khuẩn họ đường ruột với các kháng sinh khác nhau

trong nhóm beta-lactam cho phép ngươi ta xác định được các kiểu cách đề

kháng tự nhiên khác nhau của chúng. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

E. coli sản sinh enzyme beta-lactamase là do loại enzyme này có khả năng

thủy phân các kháng sinh nhóm cephalosporin (Paterson, 2006). Theo các tác

giả Howard et al., (1996) bản chất hóa học của hiện tượng kháng thuốc là các

enzyme beta-lactam làm bất hoạt các kháng sinh nhóm beta-lactam bằng cách

phá hủy mạch nối amide của vòng beta-lactam của cephalosporin. Sinh

enzyme cephalosporinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST thường gặp ở E. coli

[23], [43]

Tăng cường sản xuất enzyme cephalosporinase thường gặp ở những

nhóm kháng kháng sinh theo cơ chế đề kháng tự nhiên, do sinh ra enzyme

cephalosporinase cảm ứng và khi có sự đột biến ở gen điều hoà trong quá

trình sinh tổng hợp enzyme, nên đã tăng cường sản xuất enzyme này.

Tăng cường sản xuất enzyme cephalosporinase ở loài E. coli là do hậu

quả của sự khuếch đại gen hoặc do có sự thiết lập những gen điều hòa mới

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 1.6. Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse

1.3. Một số nghiên về tính kháng thuốc của vi khuẩn trong và ngoài nước

1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới

Trực khuẩn Gram âm đường ruột sản sinh ESBL bắt đầu xuất hiện ở

Tây Âu cho đến nay đã phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Châu Á

với những tỉ lệ khác nhau. Nghiên cứu về sự ô nhiễm vi khuẩn E. coli sản sinh

men ESBL có nguồn gốc động vật và sản phẩm động vật cũng đã được nhiều

nhà khoa học trên thế giới thực hiện (Li et al., 2007; Hansen et al, 2013).

Ở Mỹ, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sản sinh ESBL thay đổi từ 0 – 25%.

Theo kết quả nghiên cứu của chương trình giám sát kháng khuẩn SENTRY

năm 1997 – 1998, tỷ lệ E. coli sinh ESBL là 3.3% ở Mỹ và 4.2% ở Canada.

Nghiên cứu của Moland và cs vào năm (2001 – 2002) trên khắp nước Mỹ cho

biết tỷ lệ sinh ESBL ở E. coli là 2.6%. Ở châu Âu, vi khuẩn đường ruột sinh

ESBL cũng đã được phát hiện tại nhiều quốc gia. Tại Hà Lan, một nghiên cứu

trên 11 phòng thí nghiệm vào năm 1999 cho thấy tỷ lệ E. coli có sinh ESBL ở

mức độ thấp (1%) (Bradford, 2001). Tại châu Á, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột

sinh ESBL ở mức <0,1% đối với E. coli trong các nghiên cứu tại Nhật Bản

(Yangi và cs., 2006), nhưng tỷ lệ E. coli sinh ESBL ở một số nước khác đã ở

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách mức cao cùng thời điểm, tỷ lệ phát hiện tại Trung Quốc là 24.5%, Hồng Kong

là 14.3%, và Singapore là 11.3% (Yoichi và cs., 2005), tại Thái Lan (2006)

có tỷ lệ phát hiện E. coli sinh ESBL là 26.3% (Aprisarnthanarak và cs.,

2006).

Việc sử dụng kháng sinh nói chung và cephalosporin chưa được quản

lý chặt chẽ trong chăn nuôi thú y là yếu tố nguy cơ chủ yếu, ảnh hưởng tới

mức độ ô nhiễm vi khuẩn E. coli sản sinh ESBL ở vật nuôi (Damborg et al.,

2012), và lây sang người (Paterson, 2005). Việc sử dụng kháng sinh nhóm

cephalosporin thế hệ mới như Cefiofur và Cefquinome được cho là nguyên

nhân quan trọng cho hiện tượng lây nhiễm vi khuẩn sản sinh ESBL trong thức

ăn gia súc và sản phẩm chăn nuôi (Agerso et al., 2012). Chính vì vậy, tại Đan

Mạch, các trang trại chăn nuôi lợn đã dừng sử dụng kháng sinh nhóm

cephalosporin điều trị bệnh cho lợn từ năm 2010 [23]

Hiện nay những nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe của người và vật nuôi

của vi khuẩn E. coli sản sinh enzyme beta-lactam phổ rộng (ESBL) đang

được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm [34] và đã có rất nhiều nghiên

cứu về tỷ lệ nhiễm E. coli sản sinh beta-lactam trên người (Tzelepi et al.,

2000). Kết quả nghiên cứu của tác giả Ben-Ami et al. (2009) trên người mắc

bệnh tiêu hóa cho thấy có tới 339 ca (chiếm 34.5%) nhiễm chủng E. coli sản

sinh ESBLs trong tổng số 983 ca mắc. Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ của

Doi et al., (2013) thực hiện tại Mỹ, có tới 107 người (chiếm 81.5%) bệnh

nhiễm trùng đường tiêu hóa bị nhiễm E. coli ESBLs và hiện tượng lây nhiễm

vi khuẩn E. coli sản sinh ESBL hiện nay đã lan rộng sang cộng đồng dân cư

chưa từng có biểu hiện lâm sàng.. Tại Ấn Độ, xét nghiệm trên bệnh nhân cho

thấy enzyme ESBL được phát hiện ở 63.6% tổng số chủng E. coli và 66.7%

tổng số chủng K.Pneumoniae phân lập được ( Goyal et al., 2009). Tỷ lệ bệnh

nhân chết do mắc vi khuẩn E. coli sản sinh ESBL kháng thuốc là rất cao,

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách chiếm 60.8% so với 23.7% ở nhóm bệnh nhân nhiễm các chủng E. coli thông

thường (Melzer and Petersen, 2007).

1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước

Mặc dù Việt Nam là một nước Nông nghiệp và nằm trong khu vực có

nguy cơ lây lan rộng rãi của ESBLs (Hawkey, 2008) nhưng số lượng những

nghiên cứu về nguồn lưu cữu vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh men

ESBL có nguồn gốc từ vật nuôi và sản phẩm chăn nuôi (thịt, trứng, sữa), và

chất thải chăn nuôi còn rất hạn chế [32], chủ yếu là các nghiên cứu bên nhân

Năm 1999, các tác giả Nguyễn Việt Lan, Võ Thị Chi Mai và Trần Thị

Thanh Nga đã khảo sát 1228 mẫu vi khuẩn đường ruột tại bệnh viện Chợ Rẫy,

kết quả có 4.3% E. coli sinh ESBL. Năm 2005, tác giả Hoàng Kim Tuyến và

cộng sự khảo sát các vi khuẩn sinh ESBL, kết quả cho thấy có 17.8% vi

khuẩn sinh ESBL, trong đó tỷ lệ sinh ESBL ở E. coli là 17.7%. Khi nghiên

cứu từ tháng 10 cho đến tháng 12 năm 2006 tại bệnh viện trung ương Huế, tác

giả Mai Văn Tuấn cho kết quả: tỷ lệ sản sinh ESBL là 30.4% (65/214 chủng)

và 27 chủng E. coli phân lập sinh ESBL [9]. Tác giả Hoàng Thị Phương Dung

thực hiện nghiên cứu từ tháng 7 – 12/2008 tại bệnh viện Đại học Y Dược

Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sinh ESBL là 42.4% (66/204 chủng), trong đó

tỷ lệ sinh ESBL cao nhất là E. coli với 71.2% (47/66 chủng).

Theo số liệu giám sát trong năm 2012 của bệnh viện Nhiệt đới Trung

ương, tỉ lệ kháng Ampicilin của E. coli lên tới 81,4%, kháng

Amoxicillin/Clavunanic và Ampicillin/Sulbactam khoảng 40%. Các kháng

sinh nhóm cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm

Fluoro-quinolon cũng bị kháng khoảng 45%. Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của

60 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm là Ampicillin (55%);

Amoxicillin/clavulanic acid (11,7%); Nitrofurantoin (10%); CS: Colistin

(3,3%); Cephalexine (12,5%); Mecillinam (10%); Ceftazidime (1,7%);

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Cotrimoxazole

(58,63%); Gentamicin (30%); Piperacillin (13,3%);

Ciprofloxacin (8,3%); Tetracyline (53,3%) và 100% các chủng E. coli nhạy

cảm với Amikacin và Netrilmicin.

Ampicillin, Cotrimoxazole, và Tetracyline là 3 loại kháng sinh thường

được sử dụng nhiều trong chăn nuôi. Đây cũng có thể là nguyên nhân đưa đến

tỉ lệ kháng kháng sinh cao. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu của

các tác giả khác trong nước và trên thế giới về khả năng kháng sinh của các

chủng E. coli phân lập từ thực phẩm (Trần Thị Thùy Giang và cộng sự, 2014).

Theo tác giả Ba và cộng sự 100% E. coli O157:H7 phân lập từ mẫu

phân của trâu bò khỏe mạnh tại Miền Trung Việt Nam kháng với Oxacillin và

Erythromycin [15]. Theo tác giả Nguyễn Lan Khanh (2010), vi khuẩn E. coli

phân lập từ bệnh phẩm lợn con mắc bệnh phân trắng cũng kháng với rất nhiều

loại kháng sinh, trong đó 47.2% kháng với Enrofloxacin, 33.3% kháng với

Ciprofloxacin, 40% kháng với Norfloxacin, 86.6% kháng với Erythromycin.

Nhìn chung các kết quả nghiên cứu về nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn

kháng kháng sinh trong chăn nuôi và cộng đồng còn rất hạn chế tại nước ta.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu khoa

học, làm nền tảng cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo về gen kháng

thuốc của vi khuẩn. Bên cạnh đó đề tài nghiên cứu sẽ làm rõ bức tranh về con

đường lây truyền và bản chất của hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ở

người và vật nuôi. Tiến tới xây dựng các chiến lược sử dụng kháng sinh an

toàn và hiệu quả, từng bước ngăn chặn nguy cơ lây lan vi khuẩn kháng thuốc.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xác định tỉ lệ vi khuẩn E. coli kháng kháng sinh

cephalosporin được phân lập từ chất thải người chăn nuôi và chất thải của lợn

ở Thái Bình và Sóc Sơn

- Xác định trình tự nucleotit gen kháng kháng sinh CTX-M, TEM và

SHV

- Đánh giá sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh của E. coli

được phân lập từ chất thải người chăn nuôi và chất thải của lợn

2.2. Vật liệu nghiên cứu

Gồm 160 chủng E. coli kháng cefotaxime do Bộ môn Vệ sinh Thú y-

Viện Thú y phân lập từ chất thải của người chăn nuôi và chất thải lợn ở Sóc

Sơn và Thái Bình- Là hai địa phương còn rất nhiều hộ chăn nuôi nhỏ lẻ nằm

xen kẽ trong khu dân cư. Số liệu các chủng được kiểm tra phát hiện gen

kháng thuốc tại mỗi địa phương được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.1

Đối tượng lấy mẫu

Số lượng chủng

Địa phương lấy mẫu

Chất thải của người chăn nuôi

Thái Bình

Chất thải của lợn

Chất thải của người chăn nuôi

Sóc Sơn

Chất thải của lợn

Bảng 2.1. Số lượng chủng E. coli nghiên cứu

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 2.1. Vi khuẩn E. coli trên môi trường thạch

2.1.2. Hóa chất sử dụng

Agarose (Sigma)

Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)

Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas)

Bộ kit dùng cho phản ứng PCR (Roche)

Các mồi cho phản ứng PCR đặt của (Sigma)

Proteinase K (Fermentas)

Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)

Etanol (Fermentas)

H2O vô trùng (Fermentas)

Marker 1 kb (Fermentas)

2.1.3. Thiết bị sử dụng

Các thiết bị thí nghiệm phòng Công nghệ tế bào động vật, phòng thí

nghiệm trọng điểm Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Công nghệ Việt Nam được sử dụng để thực hiện nghiên cứu, danh mục theo

Bảng 2.2

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

Ứng dụng Thiết bị Hãng sản xuất

Ly tâm nhanh Eppendorf CHLB Đức

Ly tâm Ly tâm lạnh Avanti TM 30 centifuge Beckman

Cân Cân 10-4 Ohaus

Điện di Điện di Agarose Bio-rad

10µl, 20 µl, 100 µl, 200 Pipetman Eppendorf µl, 1ml

Khử trùng HVE-50 Hirayama, Nhật Bản

PCR 9700 (Applied, Biosystem). PCR

Vortex Rotolab, OSI

Bể ổn nhiệt Techne, OSI Ổn/gia nhiệt Lò vi sóng Samsung

Tủ lạnh sâu – 750C, Tủ Sanyo, Nhật Bản lạnh -200C Tủ lạnh

Tủ lạnh thường Sanyo, Nhật Bản

Chụp ảnh Máy soi chụp ảnh gel Phamarcia

Tủ cấy Sanyo, Nhật Bản

2.1.4. Phần mềm tin sinh học

Các phần mềm tin sinh học được sử dụng trong nghiên cứu này và chức

năng của chúng được liệt kê theo Bảng 2.3

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Bảng 2.3. Phần mềm sử dụng

Phần Chức năng Địa chỉ mềm

Kiểm tra chất lượng trình tự và http://www.mbio.ncsu.edu/bioe BioEdit so sánh trình tự dit/bioedit.html

So sánh trình tự với gen chuẩn BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ công bố trên ngân hàng gen

Dựng cây phát sinh của các gen MEGA6 http://www.megasoftware.net/ và một số ứng dụng khác

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn E. coli

ADN tổng số của mỗi chủng E. coli cần kiểm tra được tách chiết bằng

cách sử dụng phương pháp tách DNA được mô tả bởi tác giả Sambrook và cs

- Thu sinh khối vi khuẩn vào ống eppendorf bằng cách ly tâm 6000 v/p trong

1989 [35] quy trình tách được tóm tắt như sau:

- Bổ sung dH2O để rửa sinh khối, ly tâm 6000v/p trong 10 phút ở 4oC

- Bổ sung 400 µl Lysis buffer, vortex đều

- Bố sung 50 µl lysozyme 10 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30-45 phút

- Bổ sung 20 µl proteinase K ủ ở 56oC trong 1 giờ

- Bổ sung C:I (24:1) với tỷ lệ 1:1 (v:v), vortex, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút

10 phút ở 4oC

- Hút phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới

- Bổ sung isopropanol với tỉ lệ 1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm

- Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa

- Bổ sung ethanol 100% tỷ lệ 1:1 (v:v)

- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa, rửa tiếp bằng ethanol 70%

ở 4oC

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

- Làm khô chất kết tủa

- Hòa trong 30µl TE, bảo quản ở tủ lạnh 4oC

2.2.2. Nhân đoạn gen kháng kháng sinh của E. coli bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phản ứng sinh hoá

phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự

tham gia của một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn

ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng

hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN

cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài từ 6 – 30 nucleotit). Đoạn

này gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và được enzyme

DNA polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù. Các sợi

ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ

lên trên 900C (92 – 980C) mà thường là 940C cho chuỗi xoắn kép ADN bung

Cả 2 sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các

đoạn mồi (gọi là oligonucleotit hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí

tương ứng cho cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở

2 đầu đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt

đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản

phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ

vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy,

sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi

ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích

hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó

được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng

hợp ADN và tách rời các đoạn.

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính

theo lý thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa 2

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách đoạn mồi (Hình 2.2). Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được

“nhân lên” với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN

của PCR sẽ là 230 = 1.073.741.824.

Hình 2.2. Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR

PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm đa năng và phổ ứng dụng hết sức

rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi

là khuôn ADN. Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần

nhân lên vì việc đó đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy

nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc

hiệu. Hàm lượng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí

nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1 – 100 ng DNA tổng số của

hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có

thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:

- ADN làm khuôn

- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN (primer)

- Enzyme chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến nhất là

Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus)

- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP)

- Môi trường đệm cung cấp ion Magie (Mg++)

- Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v...)

- Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l

- Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ.

Bung liên kết của ADN (Denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90C

- 98C trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch

kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi

bám vào và enzyme RNA Polymerase xúc tác tổng hợp

Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – Annealing). Sau bước 1, ngay lập

tức, nhiệt độ được hạ xuống 37 – 68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình

tự bổ sung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn

Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài – Extension): Nhiệt độ ngay lập tức

được nâng lên 68°C – 72°C (thông thường 72C) trong vài chục giây đến vài

chục phút để các sợi ADN vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN

sợi kép, chính là sản phẩm PCR.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 2.3. Các bước của một chu kì PCR

Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 – 40 chu kỳ và tiếp tục cho đến

chu kỳ cuối cùng. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong 5 –10

phút sao cho tất cả các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản

phẩm PCR. Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm.

PCR các mẫu đã tách được DNA

Lấy 1 µl ADN tổng số của từng chủng được sử dụng cho phản ứng

PCR

Phương pháp PCR đa mồi phát hiện genTEM và SHV

Các cặp gen mồi dùng cho nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4

Phản ứng PCR thực hiện với nguyên lý cơ bản trên hệ thống luân nhiệt với

thành phần các chất có trong phản ứng PCR bảng 2.5 và chu trình nhiệt bảng

2.6

Kiểm tra hiệu quả quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR

trên gel agarose 1% và nhuộm bằng Ethidium bromide

Phương pháp PCR đơn mồi phát hiện gen CTX-M

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Các bước tiến hành tương tự quy trình phía trên, chí có một chi tiết thay

đổi là 30 chu kỳ (940C/ 1 phút - 580C/1 phút - 720C/1 phút).

Bảng 2.4. Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM,

SHV and CTX-M (Hasman et al. 2005)

Nhiệt độ ở Sảnphẩ Gen mồi chukỳbiến m PCR tính

TEM-757: 5'-GCGGAACCCCTATTTG- 3'

TEM-821: 964bp 50 ºC 5'-TCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGAC-

SHV-1436: 5'- TTCGCCTGTGTATTATCTCCCTG- 3 854 bp 50 ºC SHV-1437: 5'- TTAGCGTTGCCAGTGYTCG- 3'

CTX-1354:5'-

ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC- 3' 593bp 60ºC CTX-1355:

5'TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG -3'

Các bước của phản ứng PCR Nhiệt độ

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Thời gian Chu kỳ

94oC 5 phút 1

Biến tính ban đầu

94oC 60 giây

Biến tính

50oC 45 giây 30 Gắn mồi (60oC)

72oC 1 phút

Tổng hợp

Hoàn thiện chu trình 8 phút 1

72oC 32

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 2.2.3. Phương pháp điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1

%. Thành phần gel agarose 1%: Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris pH=8,

20mM acetic axit, 1 mM EDTA): 100 ml và Agarose: 1g

Chạy điện di ở 100V/ 250mA/ 30-40p trong bể điện di có dung dịch TAE

1X, nhuộm gel bằng Ethidium Bromide trong 5 phút. Đọc kết quả trên máy

soi UV, chụp ảnh lưu kết quả.

2.2.4. Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F. Sanger

Vào năm 1975, Sanger và Coulson lần đầu tiên giới thiệu phương pháp

giải trình tự ADN, công trình hữu ích này đã giúp cho sinh học phân tử có

những bước đi mới. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những

nucleotide thông thường còn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotit (mất nhóm

- 3’OH). Điều này khiến các dideoxynucleotit không còn khả năng hình thành

các cầu nối photphodieste với các nucleotit tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá

trình tổng hợp ADN (Hình 2.4)

Hình 2.4. Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger

(esciencecentral.org)

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Sản phẩm PCR đặc hiệuđược tinh sạch và gửi đọc trình tự gen trên máy

đọc tự động, sử dụng một mồi đọc trình tự là mồi CTX-1354 đối với gen

CTXvà mồi TEM-757 đối với gen TEM.Trình tự các đoạn gen đặc hiệu được

xác định theo phương pháp của Sanger bằng máy giải trình tự gen trên máy

ABI Prism 3100 Avant của hãng First Base tại Singapore (tốc độ 2,5 giờ/4

mẫu ~ 4000 nucleotit).

2.2.5. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide

Các thông số và dữ liệu thu nhận sau khi đọc trình tự (Hình 2.5) được

kiểm tra bằng phần mềm BioEdit. Phần mềm này cho phép xem xét độ phân

Mẫu đọc trình tự chấtlượng tốt

Mẫu đọc trình tự có nhiễu tín hiệu nhưng ở mức chấp nhận được

Mẫu đọc trình tự có nhiều nhiễu tín hiệu, chất lượngkhông tốt

tách các đỉnh tín hiệu và các phần nhiễu tín hiệu (background noise).

Hình 2.5. Kiểm tra chất lượng tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

(hình ảnh minh họa của Trung tâm giám định ADN – Viện Công nghệ sinh

học)

Mặc dù là một phương pháp tiên tiến xong việc đọc trình tự bằng máy

vẫn có những lỗi mà các phần mềm không thể tự động sửa, vì vậy dựa trên

các biểu đồ hiển thị tín hiệu, chúng tôi thực hiện kiểm tra thủ công độ phân

định của tín hiệu một lần nữa bằng mắt thường và thay thế các nucleotit mà

Lỗi nhận biết tínhiệu sai

máy đọc không thể xác định hoặc gọi nhầm (Hình 2.6).

Hình 2.6. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ

thông

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin của

các chủng E. coli kháng cefotaxime phân lập từ Thái Bình và Sóc Sơn

Nhóm nghiên cứu tiến hành phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm

cephalosporin bằng phản ứng PCR đối với tất cả 160 chủng E. coli kháng

cefotaxime với 3 cặp mồi CTX-M, mồi TEM, và mồi SHV. Ảnh điện di trên

1000bp

964bp

gel agaros thể hiện tại hình 3.1, 3.2 và 3.3

(Mẫu 44, 45,47, 48, 50 là các chủng E. coli phân lập ở lợn tại Thái

Bình. Mẫu 46, 49 là các chủng E. coli phân lập ở người tại Thái Bình.

Mẫu 52, 53, 55, 57 là các chủng E. coli phân lập ở lợn tại Sóc Sơn

Mẫu 51, 54, 56, 58 là các chủng E. coli phân lập tại Sóc Sơn)

Hình 3.1. Kết quả phát hiện gen TEM của một số chủng E. coli bằng

593bp bp

500bp

phản ứng PCR

(Các mẫu 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,

158 là các chủng E. coli phân lập ở lợn tại Sóc Sơn)

Hình 3.2. Kết quả phát hiện gen CTX-M của một số chủng E. coli bằng

phản ứng PCR

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Kết quả kiểm tra tỉ lệ các chủng E. coli mang gen CTX-M và gen TEM

được trình bày ở bảng 3.1, hình 3.4 và 3.5

Bảng 3.1. Tỷ lệ phát hiện gen CTX-M và gen TEM ở các chủng E. coli

kháng cefotaxime

Số chủng mang Số chủng Số chủng mang Địa điểm Nguồn gốc gen CTX- mang gen cả 2 gen CTX-M lấy mẫu chủng E. coli M/n(%) TEM/n(%) và TEM/n(%)

Chất thải người 26/29 16/29 10/29

chăn nuôi Thái Bình (89,6%) 31/59 (55%) 41/59 (34,5%) 19/59 Chất thải lợn

Chất thải người (52,5%) 9/13 (69,5%) 8/13 (32%) 5/13

Sóc Sơn chăn nuôi (69%) 20/59 (61,5%) 38/59 (38,5%) 13/59

Chất thải lợn

(34%) 35/42 (64,5%) 24/42 (22%) 15/42 Chất thải người

Tổng số chăn nuôi

chủng (%) (83,5%) 51/118 (57%) 79/118 (35,5%) 22/118 Chất thải lợn

(43%) (67%) (19%)

(n: Tổng số chủng E. coli được kiểm tra)

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy tại Thái Bình, trong tổng số 29 chủng E.

coli kháng cefotaxime được phân lập từ chất thải của người chăn nuôi tại

Thái Bình, có 89,6% số chủng E. coli mang gen CTX-M, 55% số chủng E.

coli mang gen TEM và 34,5% số chủng E. coli mang cả 2 gen CTX-M và

TEM. Trong tổng số 59 chủng E. coli được phân lập từ chất thải của lợn, có

52,5% số chủng E. coli kháng cefotaxime mang gen CTX-M, 70% chủng E.

coli mang gen TEM và 32% số chủng E. coli mang cả 2 gen CTX-M và TEM.

Tương tự với các chủng E. coli có nguồn gốc từ Sóc Sơn, kết quả PCR

cho thấy trong tổng số 13 chủng E. coli kháng cefotaxime phân lập từ chất

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách thải của người chăn nuôi có 69% số chủng E. coli mang gen CTX-M, 57% số

chủng E. coli mang gen TEM và 35,7% số chủng E. coli mang cả 2 gen CTX-

M và TEM. Trong tổng số 59 chủng E. coli được phân lập từ chất thải của

lợn, có 34,% số chủng E. coli mang gen CTX-M và 64,5% số chủng E. coli

mang gen TEM và 22% số chủng mang cả 2 gen CTX-M và TEM . Từ số

liệu bảng 3.1 cho thấy tỉ lệ chủng E. coli ở chất thải của người mang gen

CTX-M, TEM và mang cả hai gen trong nghiên cứu này lần lượt là 83,3%,

57,1% và 35,7%. Ở chất thải của lợn là 43,25%, 66,9% và 27,1% (hình 3.4,

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Gen CTX

Gen TEM

Gen CTX và TEM

3.5)

Gen CTX

Gen TEM

Gen CTX và TEM

Hình 3.3.Tỉ lệ chủng E. coli ở người mang gen kháng kháng sinh

Hình 3.4. Tỉ lệ chủng E. coli ở lợn mang gen kháng kháng sinh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Từ kết quả thu được nhóm nghiên cứu thấy ở người, tỉ lệ chủng E. coli

mang gen CTX-M cao hơn gen TEM. So sánh với kết quả nghiên cứu của

Lautenbach et al, (1998) kiểm tra trên 61 chủng E. coli phân lập từ bệnh nhân

ở Hoa Kỳ thì tỷ lệ E. coli mang gen CTX cao hơn gen TEM, lần lượt là

37,7% và 5% [36]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu phát hiện gen kháng thuốc

cephalosporin phần lớn mới chỉ thực hiện tại các cơ sở y tế. Theo tác giả

Nguyễn Đắc Trung (2013), kết quả nghiên cứu ở bệnh nhân tại bệnh viện TW

Thái Nguyên và bệnh viện trường ĐH Thái Nguyên cho thấy 39,53% chủng

E. coli sinh ESBL. Theo nghiên cứu của Trung 2013; Cao et al., (2002) các

gen kháng kháng sinh của E. coli phân lập từ bệnh nhân là blaCTX (25.5%)

và blaTEM là 76.3%[22]. Do đặc điểm của các chủng E. coli được kiểm tra ở

nghiên cứu này đã được sàng lọc là các chủng kháng với cefotaxime nên tỷ lệ

phát hiện gen TEM, CTX-M của chúng tôi cao hơn so với tỷ lệ phát hiện các

gen này ở các nghiên cứu trước đây. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi,

vi khuẩn E. coli mang gen blaCTX-M và blaTEM kháng cephalosporin

(Cephalosporin resistant E. coli- CRE) ở lợn và người chăn nuôi tại Thái Bình

và Sóc Sơn là khá cao, lần lượt là 54% và 66%. Hiện trạng này báo động tỷ lệ

vi khuẩn kháng kháng sinh hiện nay rất phổ biến và đây có thể là hậu quả của

việc sử dụng thuốc khánh sinh không đúng theo quy định trong chăn nuôi của

các hộ nuôi lợn dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Thực trạng

kháng thuốc của vi khuẩn ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh và gây thiệt

hại kinh tế cho người chăn nuôi. Ngoài ra, cần thiết phải từng bước ngăn chặn

việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh bổ sung thức ăn với mục đích kích

thích tăng trưởng vì đây cũng là nguyên nhân dẫn đến việc lây lan vi khuẩn

E. coli kháng kháng sinh nói chung, và vi khuẩn kháng Cefotaxime nói riêng.

Tỷ lệ xuất hiện vi khuẩn E. coli trong chất thải lợn ở mức cao cũng có thể dẫn

đến nguy cơ lây lan loài vi khuẩn này ra môi trường xung quanh và lây nhiễm

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách sang người chăn nuôi, cộng đồng nếu điều kiện chăn nuôi, vệ sinh chuồng

trại, máng ăn, nước uống, xử lý chất thải trong chăn nuôi không đảm bảo vệ

sinh

- Không phát hiện gen SHV từ tất cả các chủng E. coli của nghiên cứu này

1000bp

(theo hình 3.5)

Hình 3.5. Kết quả phát hiện gen SHV của một số chủng E. coli bằng phản

ứng PCR

3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của một số gen kháng kháng sinh

3.2.1. Giải trình tự các gen kháng kháng sinh thu được

Giải trình tự nucleotit gen kháng kháng sinh của 34 chủng E. coli

mang gen CTX-M và 24 chủng mang gen TEM, số lượng và nguồn gốc các

chủng E. coli từ từng địa phương được trình bày trong Bảng 3.2

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Bảng 3.2. Nguồn gốc các chủng E. coli được giải trình tự gen kháng

Địa phương

lấy

Nguồn gốc phân lập

Loại mẫu

mẫu

E. coli

Số mẫu

Chất thải người chăn nuôi 15

Thái Bình

Mẫu mang gen

Chất thải lợn

CTX-M

Chất thải người chăn nuôi 5

Sóc Sơn

Chất thải lợn

Chất thải người chăn nuôi 4

Thái Bình

Chất thải lợn

Mẫu mang gen TEM

Chất thải người chăn nuôi 2

Sóc Sơn

Chất thải lợn

kháng sinh

Từ kết quả giải trình tự thu được, nhóm nghiên cứu tiếp tục phân tích

bằng chương trình phần mềm BioEdit (Hình 3.6). Các trình tự có tín hiệu

nhiễu được kiểm tra lại, các nucleotit được thêm vào hoặc loại bỏ (do lỗi của

máy giải trình tự trong quá trình chạy) ta được 34 trình tự gen kháng kháng

sinh CTX-M và 23 trình tự gen kháng kháng sinh TEM.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 3.6. Hình ảnh quá trình xử lý trình tự nucleotit của gen CTX-M

Thông qua công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để

tìm các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen thế giới (Hình 3.7). Kết quả là

toàn bộ các gen thu được của nghiên cứu này có mức độ tương đồng 99 đến

100% với các nhóm gen kháng kháng sinh CTX-M hay gen TEM của vi

khuẩn E. coli đã được công bố. Như vậy, cả ở Thái Bình và Sóc Sơn, một số

chủ hộ chăn nuôi và lợn được lấy mẫu kiểm tra đều đã nhiễm vi khuẩn E. coli

mang gen kháng kháng sinh CTX-M và TEM.

Hình 3.7. So sánh mức độ tương đồng của các gen CTX-M với các gen

trên ngân hàng gen thế giới

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 3.2.2. Đặc điểm sinh học phân tử gen CTX -M

Kí hiệu các gen CTX-M và nguồn gốc được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3. Bảng kí hiệu gen CTX-M

Kí hiệu nguồn gốc Địa phương Kí hiệu Nguồn Địa phương

gen chủng lấy mẫu gen gốc chủng lấy mẫu

2CTX Lợn Thái Bình 19CTX Người Thái Bình

3CTX Lợn Thái Bình 22CTX Lợn Thái Bình

4CTX Lợn Thái Bình 23CTX Lợn Thái Bình

5CTX Người Thái Bình 24CTX Lợn Thái Bình

6CTX Người Thái Bình 25CTX Lợn Thái Bình

7CTX Người Thái Bình 26CTX Lợn Thái Bình

8CTX Người Thái Bình 28CTX Lợn Thái Bình

9CTX Người Thái Bình 188CTX Lợn Sóc Sơn

10CTX Người Thái Bình 189CTX Người Sóc Sơn

11CTX Người Thái Bình 190CTX Lợn Sóc Sơn

12CTX Người Thái Bình 191CTX Lợn Sóc Sơn

13CTX Người Thái Bình 192CTX Người Sóc Sơn

14CTX Người Thái Bình 194CTX Lợn Sóc Sơn

15CTX Người Thái Bình 198CTX Người Sóc Sơn

16CTX Người Thái Bình 199CTX Người Sóc Sơn

17CTX Người Thái Bình 201CTX Người Sóc Sơn

18CTX Người Thái Bình 203CTX Lợn Sóc Sơn

Để so sánh và đánh giá được sự đa dạng của các trình tự nucleotit gen

CTX-M phân lập được, nhóm nghiên cứu tiến hành so sánh các trình tự với

nhau và so sánh với một trình tự gen kháng kháng sinh đã được công bố trên

ngân hàng gen thế giới. Trình tự được chọn để làm trình tự tham chiếu là

vùng CDS của đoạn gen có mã số trên Genbank là AB098539. Đây là một

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách trong những trình tự gen kháng kháng sinh CTX-M đầu tiên của E. coli được

xác định (Matsumoto et al, 1988) [40]. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh

các trình tự gen của nghiên cứu này với trình tự gen tham chiếu (Hình 3.8)

Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotit gen CTX-M

Từ kết quả so sánh trên phần mềm BioEdit (Hình 3.8) nhóm nghiên cứu

thấy từ vị trí số 281 cho đến vị trí 795 có tất cả 121 vị trí xảy ra sự sai khác

các nucleotit so với trình tự tham chiếu.Vị trí các điểm đột biến được thể hiện

ở bảng 3.4

Bảng 3.4.Vị trí đột biến nucleotit gen CTX-M

Vị trí Dạng % Vị trí Dạng % Vị trí Dạng %

đột đột đột đột đột đột đột đột đột

biến biến biến biến biến biến biến biến biến

281 T-C 3 446 C-G 79,4 585 T-G 79,4

282 A-T 100 447 T-A 79,4 588 G-T 79,4

283 A-T 3 448 A-G 79,4 598 A-C 79,4

290 G-C 79,4 453 C-G 79,4 600 A-T 79,4

291 A-T 79,4 456 C-G 79,4 603 A-G 79,4

294 T-C 79,4 459 G-T 79,4 604 T-C 79,4

303 A-G 79,4 462 C-T 79,4 612 C-A 79,4

304 A-C 79,4 468 A-C 79,4 614 G-A 79,4

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 305

A-G 79,4 79,4 79,4 A-C C-G 469 618

306 A-T 79,4 470 A-C 79,4 628 C-T 79,4

307 T-C 79,4 472 C-A 79,4 636 A-C 79,4

309 T-C 79,4 474 G-C 79,4 640 A-C 79,4

312 C-T 79,4 477 A-C 79,4 642 G-C 79,4

315 G-T 20,5 480 C-T 79,4 654 C-G 79,4

324 T-C 79,4 483 A-G 79,4 660 T-C 79,4

336 G-C 79,4 489 C-T 79,4 666 G-C 79,4

342 G-A 79,4 495 C-G 79,4 674 A-G 79,4

352 T-C 79,4 498 C-T 79,4 A-T 23,5 678 354 G-C 79,4 501 C-T 79,4 A-C 67,47

357 G-A 79,4 504 C-T 79,4 681 A-C 73,5

361 T-A 79,4 507 G-A 79,4 682 C-T 73,5

363 A-G 79,4 510 G-T 79,4 684 C-T 73,5

369 T-A 79,4 514 T-C 79,4 687 T-G 73,5

372 G-A 79,4 516 A-G 79,4 688 G-A 73,5

375 T-G 79,4 519 C-T 79,4 690 T-G 73,5

388 C-T 79,4 531 G-C 79,4 693 C-G 73,5

390 A-G 79,4 537 T-C 79,4 697 G-A 73,5

402 T-C 79,4 341 C-A 79,4 698 T-C 73,5

405 C-T 79,4 543 T-A 79,4 705 G-T 73,5

406 G-A 79,4 546 T-C 79,4 711 A-G 73,5

407 T-C 79,4 552 T-C 79,4 723 T-C 73,5

408 G-C 79,4 553 T-A 79,4 725 A-G 76,47

411 G-C 79,4 555 A-G 79,4 729 T-C 76,47

417 T-C 79,4 558 T-G 79,4 741 C-T 76,47

420 G-A 79,4 564 A-G 79,4 747 C-T 76,47

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 421

A-G 79,4 79,4 T-C C-T 573 756 100

T-C 79,4 576 T-G 79,4 762 A-G 76,47 429

C-G 79,4 577 C-T 79,4 763 A-C 76,47 432

T-C 79,4 582 G-T 79,4 765 A-G 76,47 435

C-T 79,4 583 A-C 79,4 767 A-G 76,47 438

792 T-C 100

Tiến hành so sánh trình tự axit amin thông qua phần mềm BioEdit

nhóm nghiên cứu phát hiện có 24 vị trí có sự sai khác các axit amin so với

trình tự tham chiếu. Vị trí đột biến trình tự axit amin được trình bày trong

bảng 3.5

Bảng 3.5. Vị trí đột biến axit amin

Đột % đột % đột % đột Đột Đột Vị trí Vị trí Vị trí biến biến biến biến biến biến

N-Y 5,8 149 79,4 205 S-T 79,4 95 A-G

R-P 79,4 150 79,4 214 M-L 79,4 97 S-G

K-P 79,4 157 79,4 225 Q-R 76,47 102 Q-A

S-A 79,4 158 79,4 230 A-T 76,47 103 L-I

S-T 79,4 185 79,4 233 V-T 76,47 121 S-T

V-T 79,4 195 79,4 242 D-G 76,47 136 N-Q

H-Q 79,4 200 79,4 255 K-Q 76,47 144 K-H

V-L 79,4 204 79,4 256 D-G 76,47 145 D-E

Kết quả thu được cho thấy sự đa dạng trình tự axit amin của gen CTX-

M tại nghiên cứu này. Theo Bauernfeind và cs (1996) sự thay đổi axit amin có

thể tạo ra các nhóm CTX-M khác nhau [16]. Theo nghiên cứu của Lartigue và

cs (2004), tác giả giải trình tự 23 trong tổng số 24 mẫu mang gen CTX-M thì

có 3 gen CTX-M-3, 15 gen CTX-M-15, 2 gen CTX-M-2 và 3 gen CTX-M-14

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách kết quả nàycũng thể hiện sự đa dạng các gen CTX-M [35]. Kết quả của

nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với công bố của Su et al.( 2008) Tác

giả cho biết, đã có hơn 60 biến thể axit amin thuộc 5 cụm khác nhau của

CTX-M [49]. Năm 2004, Bonnet và cs cho biết trên thế giới hiện nay có

khoảng 40 loại blaCTX-M đã được biết đến và đã có sự di chuyển các gen

blaCTX-M cho phép chúng chuyển từ plasmid sang nhiễm sắc thể [18]. Theo

tác giả Trang và cs (2013) khi nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi

khuẩn E. coli và Klebsiella pneumoniae ở các bệnh nhân tại bệnh viên thành

phố Hồ Chí Minh thu được 32 gen CTX-M, khi khuếch đại với cặp mồi đặc

hiệu thì xác định được có 3 nhóm CTX-M là CTX-M-1,CTX-M-2, CTX-M9

[50]

Trong khuân khổ của nghiên cứu này nhóm nghiên cứu không tìm thấy

sự tách bạch rõ ràng giữa gen kháng kháng sinh CTX-M của E. coli phân lập

từ người và và gen CTX-M của E. coli phân lập ở lợn lợn tại Thái Bình và

Sóc Sơn điều này có thể khẳng định có sự tương đồng về kiểu gen kháng

kháng sinh của E. coli giữa người chăn nuôi và lợn. Tiến hành so sánh trình tự

nucleotit và trình tự axit amin gen kháng kháng sinh của 34 chủng E. coli, thu

được kết quả có 6 nhóm có trình tự gen giống nhau. Trong đó giữa các gen

nhóm II, nhóm III, nhóm IV và nhóm VI chỉ sai khác với nhau từ 1 đến 2

nucleotit. Từ đó, nhóm nghiên cứu lập bảng thống kê số lượng các gen kháng

kháng sinh giống nhau của E. coli có nguồn gốc phân lập từ người chăn nuôi

và lợn ở Thái Bình và Sóc Sơn trong từng nhóm (Bảng 3.6)

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Bảng 3.6. Nhóm các gen có trình tự nucleotit giống nhau

Số lượng gen có nguồn gốc từ

Nhóm gen

Thái Bình

Sóc Sơn

E. coli

có trình tự Tên kí hiệu (gen) giống

ở người

ở lợn

người

ở lợn

nhau

3CTX; 4CTX, 7CTX, 12CTX, 3 1 1 Nhóm I 2 27CTX, 190CTX, 192CTX

9CTX, 11CTX, 13CTX, 16CTX,

Nhóm II 6 3 4 2 17CTX, 18CTX, 24CTX, 25CTX,

Nhóm III 6 2 0 0

189CTX, 188CTX, 28CTX, 5CTX, 6CTX, 8CTX, 10CTX, 191CTX, 199CTX, 198CTX, 14CTX, 15CTX, 22CTX, 23CTX 201CTX 19CTX, 194CTX Nhóm IV 1 0 0 1

Nhóm V 2CTX 0 1 0 0

Nhóm VI 203CTX 0 0 0 1

Từ kết quả của bảng 3.6 nhóm nghiên cứu thấy có sự giống nhau về

trình tự gen kháng kháng sinh giữa các chủng E. coli được phân lập từ chất

thải của người chăn nuôi và chất thải của lợn, giữa Thái Bình và Sóc Sơn hay

nói cách khác kết quả thu được không cho thấy sự khác biệt trình tự gen

kháng kháng sinh ở các chủng E. coli có nguồn gốc phân lập khác nhau. Hơn

nữa, một số gen kháng kháng sinh được phân lập ở cùng một hộ chăn nuôi

như gen 14CTX, 15CTX, 22CTX, 25CTX. Như vậy nhóm nghiên cứu có thể

khẳng định có sự lây nhiễm vi khuẩn E. coli mang gen kháng kháng sinh

CTX-M giữa lợn và người chăn nuôi tại hai vùng mà đề tài đang nghiên cứu.

Kết quả trên củng cố thêm nghiên cứu của Hammerum và cs (2014), tác giả

nghiên cứu gen kháng kháng sinh của E. coli ở người chăn nuôi và lợn và đã

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách khẳng định có sự lây lan vi khuẩn E. coli mang gen kháng thuốc giữa người

và lợn [29].

3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử gen TEM

Kí hiệu các gen TEM và nguồn gốc phân lập được trình bày trong bảng

3.7

Bảng 3.7. Bảng kí hiệu gen TEM

Địa Địa Kí hiệu gen nguồn gốc Kí hiệu gen Nguồn gốc phương phương chủng chủng lấy mẫu lấy mẫu

1A_TEM Lợn Thái Bình 22TEM Lợn Thái Bình

2A_TEM Lợn Thái Bình 23TEM Lợn Thái Bình

3A_TEM Lợn Thái Bình 24TEM Lợn Thái Bình

4A_TEM Lợn Thái Bình 25TEM Lợn Thái Bình

5A_TEM Lợn Thái Bình 26TEM Lợn Thái Bình

6C_TEM Người Thái Bình 27TEM Lợn Thái Bình

7A_TEM Lợn Thái Bình 28TEM Lợn Thái Bình

9A_TEM Lợn Thái Bình 59A1_TEM Lợn Sóc Sơn

10A_TEM Lợn Thái Bình 59C1_TEM Người Sóc Sơn

14TEM Người Thái Bình 85A1_TEM Lợn Sóc Sơn

15TEM Người Thái Bình 85C1_TEM Người Sóc Sơn

20TEM Người Thái Bình

Để nghiên cứu được đặc điểm sinh học phân tử của gen TEM, nhóm

nghiên cứu tiến hành so sánh các trình tự thu được với nhau và so sánh với

một trình tự gen TEM đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới. Trình tự

được chọn để làm trình tự tham chiếu là vùng CDS của đoạn gen có mã số

trên Genbank là NG_050145 có nguồn gốc ở Canada được Boyd và cs công

bố năm 2004 (Boyd et al, 2004). Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh các

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách trình mẫu với trình tự tham chiếu (Hình 3.10). Kết quả phát hiện ra 2 vị trí có

sự đột biến ở trình tự nucleotit ở vị tri 18 (T – C) và vị trí 33 (T – C) của

chủng có kí hiệu 10A_TEM so với các mẫu còn lại và mẫu tham chiếu.

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotit gen TEM

Tiến hành so sánh trình tự axit amin thì không phát hiên ra sự sai khác.

Điều này chứng tỏ sự hai sự sai khác trong trình tự nucleotit của gen

10A_TEM không có nghĩa. Cụ thể hơn, có sự tương đồng gen TEM giữa các

chủng E. coli kháng cephalosporin phân lập ở Thái Bình và Sóc Sơn.

Kết quả nghiên cứu của đề tài phù hợp với kết quả nghiên cứu của một

số tác giả trên thế giới. Theo Schmitt et al, (2007), kết quả giải trình tự gen

kháng kháng sinh của 12 chủng E. coli phân lập từ mẫu bệnh phẩm của các

bệnh nhân ở Đức kết quả là toàn bộ 12 trình tự thu được là giống nhau [38],

Theo Mroczkowska và cs (2008) các gen TEM-1 là gen phổ biến nhất trong

quần thể vi sinh vật [41]. Kết quả nghiên cứu của tác giả Martins et al.

(2013) cũng chỉ ra rằng có sự tương tương đồng kiểu hình và kiểu gen đa

kháng thuốc của E. coli phân lập từ thú cảnh, từ người, và từ bề mặt các thiết

bị gia dụng trong cùng một gia đình [38].

Như vậy, có sự tương đồng về kiểu gen kháng kháng sinh TEM của E.

coli phân lập từ chất thải người chăn nuôi và chất thải của lợn ở Thái Bình và

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Sóc Sơn. Vậy giữa người chăn nuôi và vật nuôi có sự lây truyền vi khuẩn E.

coli mang gen kháng kháng sinh .

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Tại Thái Bình và Sóc Sơn, ở người chăn nuôi và lợn đều phát hiện vi khuẩn

E. coli có mang gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin (gen CTX-M và

gen TEM) với tỷ lệ rất cao, cụ thể:

 Tại Thái Bình, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli kháng cefotaxime mang gen

CTX, TEM và cả hai gen trên ở chất thải của chủ hộ chăn nuôi lần lượt là

89,6%, 55% và 34,5%; ở chất thải của lợn lần lượt là 52,5%, 69,5% và 32%.

Tương tự, tại Sóc Sơn, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli kháng cefotaxime mang

gen CTX, TEM và cả hai gen trên ở chất thải của chủ hộ chăn nuôi lần lượt là

69%, 61,5%, và 38,5% ở chất thải lợn lần lượt là 34%, 64,5% và 22%.

 Tỉ lệ chủng E. coli ở chất thải của người mang gen CTX, TEM và mang

cả hai gen tính chung cho cả hai địa phương trong nghiên cứu này lần lượt là

83,3%, 57,1% và 35,7%. Ở chất thải của lợn là 43,25%, 66,9% và 27,1%

2. Các chủng E. coli trong nghiên cứu này mang nhiều gen kháng kháng sinh

nhóm CTX-M khác nhau và chỉ mang 1 nhóm gen TEM

3. Có sự lây truyền vi khuẩn E. coli mang gen kháng kháng sinh từ lợn sang

người chăn nuôi.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Kiến nghị

1. Cần thiết thực hiện các nghiên cứu về các nhóm CTX-M và sự di chuyển

các gen blaCTX-M và TEM từ plasmid sang nhiễm sắc thể của vi khuẩn E.

coli kháng thuốc với đặc điểm chăn nuôi ở nước ta.

2. Cần có những nghiên cứu tiếp theo ở mức độ sinh học phân tử để phát hiện

các nhóm gen kháng kháng sinh và mức độ tương đồng gen kháng thuốc của

vi khuẩn phân lập ở người và vật nuôi để thấy rõ hơn nguy cơ lây nhiễm tính

kháng thuốc trong cộng đồng, giữa người và vật nuôi tại Việt Nam.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Hoàng Thị Phương Dung, Nguyễn Thanh Bảo (2010), "Khảo sát trực khuẩn

gram âm sinh men beta lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh Viện Đại Học

Y Dược TP Hồ Chí Minh", Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 14(phụ lục số 1):

pp. 486-480.

2. Lê Thị Ngọc Diệp (2009), Các chuyên đề dược lý cao học thú y, Chuyên đề 9:

Thuốc kháng sinh dùng trong chăn nuôi thú y, Trường đại học Nông nghiệp

Hà Nội, Hà Nội.

3. Trần Đức Hậu (2007), Hóa dược, Nxb Y học, Hà Nội

4. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng thuốc kháng

sinh trong chăn nuôi, Nxb Hà Nội, Hà Nội.

5. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Vi sinh vật thú y, Nxb Đại học và Trung học

chuyên nghiệp, Hà Nội

6. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiền, Trần Thị Lan Hương, 1997. Vi sinh

vật Thú Y. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Trang 80 – 85

7. Bùi Thị Tho, Nguyễn Khắc Hiếu (1998). Nghiên cứu về tình hình kháng

thuốc của vi khuẩn gây bệnh trong thú y. NXB Hà Nội, Hà Nội.

8. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, Nxb Y học, Hà Nội.

9. Mai Văn Tuấn, Nguyễn Thanh Bảo, Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh men beta-

lactamase phổ mở rộng phân lập tại bệnh viện trung ương Huế. Y Học TP. Hồ Chí

Minh 2008. Tập 12. Phụ bản Số 1

10. Hoàng Kim Tuyến, Đặng Mỹ Hương, Thái Hữu Duyên, Nguyễn Thị Thanh

Tâm (2005), “Phát hiện sớm ESBLs và hiệu quả lâm sàng” , Báo cáo khoa

học Bệnh viện Thống Nhất, TP. Hồ Chí Minh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Tiếng Anh

11. Abraham E. P., Chain E. (1940), “An enzyme from bacteria able to destroy

penicillin”, Natural, 46, pp. 837.

12. Agersø Y., Aarestrup F. M., Pedersen K., Seyfarth A. M, Struve T., Hasman H.

(2012), “Prevalence of extended-spectrum cephalosporinase (ESC)-producing

Escherichia coli in Danish slaughter pigs and retail meat identified by selective

enrichment and association with cephalosporin usage”, J Antimicrob Chemother,

67, pp. 582–588.

13. Ambler R. P. (1980), “The structural of ß–lactamases”, Philos Trans R Soc

Lond Biol Sci, 289, pp. 321-331.

14. Ambler R. P., Coulson A. F., Frere J. M., Ghuysen J. M., Joris B., Forsman

M., Levesque R. C., Tireby G. and Waley S. G. (1991), “A Standard

numbering scheme for the class A ß–lactamases”, Biochem. J., 276, pp. 269-

270.

15. Bui Thi Ba, Dao Hoai Thu, Vo Thanh Thin, Dang Van Tuan, Do Van Tan and

Vu Khac Hung (2012), “Genetic analysis of antimicrobial resistance in

Escherichia coli O157:H7 isolated from healthy cattle and buffaloes in

Central Vietnam” Tạp Chí khoa học Thú Y

16. Bauernfeind A., Stemplinger I., Jungwirth R., Ernst S., Casellas J. M. (1996),

"Sequences of beta-lactamase genes encoding CTX-M-1 (MEN-1) and CTX-

M-2 and relationship of their amino acid sequences with those of other beta-

lactamases", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40(2), pp. 509-513.

17. Ben-Ami R., Rodríguez-Baño J., Arslan H., Pitout J. D., Quentin C., Calbo E.

S., Azap O. K., Arpin C., Pascual A., Livermore D. M., Garau J., Carmeli Y.

(2009), “A multinational survey of risk factors for infection with extended-spectrum

beta-lactamase-producing enterobacteriaceae in nonhospitalized patients”, Clin

Infect Dis, 49(5), pp. 682- 690.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

18. Bonnet R. (2004), "Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the

CTX-M enzymes", Antimicrobial agents and chemotherapy, 48(1), pp. 1-14.

19. Boyd, David A. (2004), "Complete nucleotide sequence of a 92-kilobase

plasmid harboring the CTX-M-15 extended-spectrum beta-lactamase involved

in an outbreak in long-term-care facilities in Toronto, Canada", Antimicrobial

agents and chemotherapy, 48(10), pp. 3758-3764.

20. Bradford P. A., Urban C., Jaiswal A., Mariano N., Rasmussen B. A., Projan S. J.,

Rahal J. J., Bush K., (1995), “SHV-7, a novel cefotaxime-hydrolyzing - lactamase,

identified in Escherichia coli isolates from hospitalized nursing home patients”,

Antimicrob Agents Chemother, 39, pp. 899–905.

21. Bush K. (2001), “New ß–lactamases in gram negative bacteria: diversity and

impact on the selection of antimicrobial therapy”, Clin Infect Dis, 32, pp.

1085-1089.

22. Damborg, P., Marskar, P., Baptiste, K. E., Guardabassi, L. 2012. Faecal

shedding of CTX-M-producing Escherichia coli in horses receiving broad-

spectrum antimicrobial prophylaxis after hospital admission. Vet. Microbiol. 54,

298–304.

23. DANMAP (2010), “Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial

resistance in bacteria from food animals, foods and humans in Denmark”, Danish

Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme

Copenhagen Denmark.

24. Datta N., Kontomichalou P. (1965), “Penicillinase synthesis controlled by

infectious R factors in Enterobacteriacae”, Natural, 208, pp. 239-241.

25. Doi Y., Park Y. S., Rivera J. I., Adams-Haduch J. M., Hingwe A., Sordillo E.

M., Lewis J. S., Howard W. J., Johnson L. E, Polsky B., Jorgensen J. H., Richter S.

S., Shutt K. A., Paterson D. L. (2013), “Community-associated extended-spectrum

β-lactamase-producing Escherichia coli infection in the United States”, Clin Infect

Dis, 56(5), pp. 641-648.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

26. FAO/OIE/WHO (2006), Antimicrobial use in aquaculture and antimicrobial

resistance, Seoul.

27. Phuong, N.T., and T.H. Minh. 2005. National aquaculture sector overview —

Viet Nam. In FAO Fisheries and Aquaculture Department [online]. Rome.

Updated 10 October 2005. [Cited 23 July 2008]

28. Goyal A., Prasad K. N., Prasad A., Gupta S., Ghoshal U., Ayyagari A. (2009),

“Extended spectrum β-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

and associated risk factors”, Indian J Med Res, 129, pp. 695-700.

29. Hammerum A. M., Larsen J., Andersen V. D., Lester C. H., Skovgaard Skytte

T. S., Hansen F., Olsen S. S., Mordhorst H., Skov R. L., Aarestrup F. M.,

Agersø Y. (2014), "Characterization of extended-spectrum β-lactamase

(ESBL) -producing Escherichia coli obtained from Danish pigs, pig farmers

and their families from farms with high or no consumption of third-or fourth-

generation cephalosporins", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 69(10),

pp. 2650-2657.

30. Hasman, H., Mevius, D., Veldman, K., Olesen, I., and Frank M. Aarestrup,

F.M. 2005. Beta-Lactamases among extended-spectrum b-lactamase (ESBL)-

resistant Salmonella from poultry, poultry products and human patients in The

Netherlands. J. of Antimicrob. Chemother. 56, 115–121.

31. Hansen K. H, Damborg P., Andreasen M., Nielsen S.S., Guardabassi L. (2013),

“Carriage and feacal counts of cefotaxime M-producing E. Coli in pigs: A

longitudinal study”, Applied and Environmental Microbiology, 79 (3), pp. 794–798.

32. Hawkey, P . M. 2008. Molecular epidemiology of clinically significant

antibiotic resistance genes. British J. Pharmacol. 153, 406S–413S.

33. Howard S. G., Robert C. M. (1996), “Antimicrobial drug resistance”, Engl J

Med, 335, pp. 1445-1453.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

34. Knother H., Shah P., Kremery V., Antal M., Mitsuhashi S. (1983), “Transferable

resitance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates

of Klebsiella pneumoniae and Seratia marcescen”, Infection, 11, pp. 315-317.

35. Lartigue, Marie-Frédérique, Poirel L., Nordmann P. (2004), "Diversity of

genetic environment of blaCTX-M genes", FEMS Microbiology Letters,

234(2), pp. 201-207.

36. Lautenbach E., Patel J.B., Bilker W.B., Edelstein P.H., Fishman N.O. (2001),

"Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella

pneumoniae: risk factors for infection and impact of resistance on outcomes",

Clinical Infectious Diseases, 32(8), pp. 1162-1171.

37. Li X. Z., Mehrotra M., Ghimire S., Adewoye L. (2007), “β-Lactam resistance and

β-lactamases in bacteria of animal origin”, Vet Microbiol, 121, pp. 197–214.

38. Martins L. R, Pina S. M, Simões R. L, de Matos A. J., Rodrigues P., da Costa P.

M. (2013) “Common phenotypic and genotypic antimicrobial resistance patterns

found in a case study of multiresistant E. coli from cohabitant pets, humans, and

household surfaces”, J Environ Health, 75(6), pp. 74-81.

39. Matsumoto Y., Ikeda F., Kamimura T., Yolota Y., Mine Y., (1988), “Novel

plasmid-mediated β-lactamase from Escherichia coli that inactivates

oxyimino-cephalosporins”, Antimicrob Agents Chemother, 32, pp. 1243–

1246.

40. Melzer, M. and Petersen, I. 2007. Mortality following bacteraemic infection caused

by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E. coli compared to non-

ESBL producing E. coli . J. Infect. 2007. 55, 254–259.

41. Mroczkowska, Joanna E., and Miriam Barlow. "Fitness trade-offs in blaTEM

evolution." Antimicrobial agents and chemotherapy 52.7 (2008): 2340-2345.

42. Paterson D. L, Bonomo R. A. (2005), “Extended-Spectrum ß–lactamases: a

Clinical Update”, Clin Microbio. Rev, 18, pp. 657-686.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

43. Paterson, David L. (2006), "Resistance in gram-negative bacteria:

Enterobacteriaceae", The American journal of medicine, 119(6), pp. S20-S28.

44. Pitout J. D., Laupland K. B. (2008), “Extended-spectrum beta-lactamase-producing

Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern”, Lancet Infect Dis, 8, pp.

159–166.

45. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989), “Molecular cloning old spring

harbor laboratory press” 2, pp. 14-9

46. Schmitt, Joachim, Jacobs E., Schmidt H., (2007), "Molecular characterization

of extended-spectrum beta-lactamases in Enterobacteriaceae from patients of

two hospitals in Saxony, Germany", Journal of medical microbiology 56(2),

pp. 241-249.

47. Son, T.T. D, Dung, V. T., Madsen, H., and Dalsgaard, A. 2011. Survival of fecal

indicator bacteria in treated pig manure stored in clay-covered heaps in Vietnam.

Veterinary Microbiology. 152, 374-378

48. Son, T. T. D., Petersen, A., Dung,V.T, Huong, T.T.C., and Dalsgaard, A. 2011.

Impact of medicated feed on the development of antimicrobial resistant bacteria in

integrated pig-fish farms in Vietnam. Applied Environmental Microbiology 77,

4494-4498

49. Su, Su Z., Dai X., Chen J., Kong F., Wang H., Li Y., Peng S., Wang S., Shao

Q., Lv L., Xu H. (2008), "The blaCTX-M-1 gene located in a novel complex

class I integron bearing an ISCR1 element in Escherichia coli isolates from

Zhenjiang, China" Journal of antimicrobial chemotherapy 62(5), pp. 1150-

1151.

50. Trang, Nguyen Hoang Thu, et al. "The characterization of ESBL genes in

Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae causing nosocomial infections in

Vietnam." The Journal of Infection in Developing Countries 7.12 (2013):

922-928.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

51. Tzelepi, E., Gaikkoupi, P., Sofianou, D., Loukova, V., Kemeroglou, A., Tsakris ,A.

2000. Detection of extended spectrum β-lactamases in clinical isolates of

Enterobacter Cloacae and Enterobacter aerogenes. J. Clin. Microbiol. 38(2), 542-

546.

52. WHO (2002), Use of antimicrobials outside human medicine and resultant

antimicrobial resistance in humans, Geneva.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách PHỤ LỤC

1. So sánh các trình tự nucleotid gen kháng kháng sinh CTX-M với

nhau

Alignment: C:\BioEdit\Temp\~out.tmp ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 2CTX TTAATCAGCC TGTCGAGATC AAGCCTGCCG ATCTGGTTAA CTACAATCCG ATTGCCGAAA AACACGTCAA 3CTX .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 4CTX .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7CTX .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 12CTX .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 19CTX C.T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27CTX .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 188CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 189CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190CT .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 191CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 192CT .........G A..T...... ..AAAAT.T. .C..T..... ...T...... .....G.... .G........ 194CT -.T....... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 198CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 199CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 201CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 203CT C.T....... .......... .-........ .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 80 90 100 110 120 130 140 2CTX CGGCACAATG ACGCTGGCAG AACTGAGCGC GGCCGCGTTG CAGTACAGCG ACAATACCGC CATGAACAAA 3CTX T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 4CTX T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7CTX T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 12CTX T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 19CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27CTX T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 188CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 189CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190CT T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 191CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 192CT T..G..G... T.A.....T. .G..T..... .......C.A .......... .T..CGTG.. G.....T..G 194CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 198CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 199CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 201CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 203CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 150 160 170 180 190 200 210 2CTX TTGATTGCCC AGCTCGGTGG CCCGGGAGGC GTGACGGCTT TTGCCCGCGC GATCGGCGAT GAGACGTTTC 3CTX C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 4CTX C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7CTX C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 12CTX C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 19CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27CTX C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 188CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 189CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190CT C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 191CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 192CT C.......T. .CG.T..C.. .....CTA.. ..C..C..G. .C.....ACA .C.G..A..C ..A.....C. 194CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 198CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 199CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 201CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 203CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 220 230 240 250 260 270 280 2CTX GTCTGGATCG CACTGAACCT ACGCTGAATA CCGCCATTCC CGGCGACCCG AGAGACACCA CCACGCCGCG 3CTX ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 4CTX ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7CTX ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 12CTX ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 19CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27CTX ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T..

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 188CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 189CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190CT ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 191CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 192CT ....C..C.. T..C..G..G ...T.A..C. .......... G.....T... C.T..T.... .TT.A..T.. 194CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 198CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 199CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 201CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 203CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 290 300 310 320 330 340 350 2CTX GGCGATGGCG CAGACGTTGC GTCAGCTTAC GCTGGGTCAT GCGCTGGGCG AAACCCAGCG GGCGCAGTTG 3CTX ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 4CTX ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7CTX ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 12CTX ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 19CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27CTX ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 188CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 189CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 190CT ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 191CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 192CT ...A...... ..A..TC... .GA.T..G.. .......A.A ..AT...... .C.G...A.. .......C.. 194CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 198CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 199CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 201CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 203CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 410 420 2CTX GTGACGTGGC TCAAAGGCAA TACGACCGGC GCAGCCAGCA TTCGGGCTGG ACTGCCTGCT TCCTGGGTTG 3CTX .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 4CTX .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 5CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 6CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 7CTX .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 8CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 9CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 10CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 11CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 12CTX .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 13CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 14CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 15CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 16CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 17CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 18CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 19CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 22CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 23CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 24CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 25CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC..

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 27CTX .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 28CTX .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 188CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 189CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 190CT .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 191CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 192CT .....A...A .G........ ...C.....T .....G.... ...A...... .......... .......... 194CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 198CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 199CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 201CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. 203CT .......... .......... .......... .......... .......C.. CT.A..GA.G ..G...AC.. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 430 440 450 460 470 480 490 2CTX TGGGGGATAA AACCGGCAGC GGTGGCTATG GCACCACCAA CGATATCGCG GTGATCTGGC CAAAAGATCG 3CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 6CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 7CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 8CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 9CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 10CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 11CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 12CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 13CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 14CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 15CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 16CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 17CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 18CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 19CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 22CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 23CTX ....T..... G......... ..C.A...C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 24CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 25CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 27CTX .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28CTX ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 188CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 189CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 190CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 191CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 192CT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 194CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 198CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 199CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 201CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... 203CT ....T..... G......... ..C.....C. .......... T.....T... .......... .GC.G.G... ....|....| ....|....| ....|... 500 510 2CTX TGCGCCGCTG ATTCTGGTCA CCTACTT- 3CTX .......... .......... .-.....- 4CTX .......... .......... .-.....T 5CTX .......... .......... .-.----- 6CTX .......... .......... .-..N..T 7CTX .......... .......... .-.....T 8CTX .......... .......... .-.....T 9CTX .......... .......... .-.....T 10CTX .......... .......... .-CTAC.T 11CTX .......... .......... .-.....T 12CTX .......... .......... .-.....T 13CTX .......... .......... .-..N..T 14CTX .......... .......... .-.....T 15CTX .......... .......... .-.....T 16CTX .......... .......... .......- 17CTX .......... .......... .-.....T 18CTX .......... .......... .-.....T 19CTX .......... .......... .-.....T 22CTX .......... .......... .-.....T 23CTX .......... .......... .-.....T 24CTX .......... .......... .-.....T

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 25CTX .......... .......... .-.....T 27CTX .......... .......... .-.....T 28CTX .......... .......... .-.....T 188CT .......... .......... .......- 189CT .......... .......... .......- 190CT .......... .......... .......- 191CT .......... .......... .......- 192CT .......... .......... .......- 194CT .......... .......... .......T 198CT .......... .......... .......- 199CT .......... .......... .......- 201CT .......... .......... .-.....- 203CT .......... .......... .......C

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

2. So sánh các trình tự nucleotid gen kháng kháng sinh TEM với

nhau

Alignment: C:\BioEdit\Temp\~out.tmp ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 1A_TEM ATGAGTATTC AACATTTTCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......C.. .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 80 90 100 110 120 130 140 1A_TEM ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 150 160 170 180 190 200 210 1A_TEM GGATCTCAAC AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 220 230 240 250 260 270 280 1A_TEM AAAGTTCTGC TATGTGGTGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......C.. .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 290 300 310 320 330 340 350 1A_TEM ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 410 420 1A_TEM AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCTGCCA ACTTACTTCT GACAACGATC 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 430 440 450 460 470 480 490 1A_TEM GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 500 510 520 530 540 550 560 1A_TEM AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA TGGCAACAAC 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 570 580 590 600 610 620 630 1A_TEM GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 640 650 660 670 680 690 700 1A_TEM GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 760 770 1A_TEM GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT CCCGTATCGT 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 780 790 800 810 820 830 840 1A_TEM AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| . 850 860 1A_TEM TCACTGATTA AGCATTGGTA A 2A_TEM .......... .......... . 3A_TEM .......... .......... . 4A_TEM .......... .......... . 5A_TEM .......... .......... . 6C_TEM .......... .......... . 7A_TEM .......... .......... . 9A_TEM .......... .......... . 10A_TEM .......... .......... . 14TEM .......... .......... . 15TEM .......... .......... . 20TEM .......... .......... . 21TEM .......... .......... . 22TEM .......... .......... . 23TEM .......... .......... . 24TEM .......... .......... . 25TEM .......... .......... . 26TEM .......... .......... . 27TEM .......... .......... . 28TEM .......... .......... . 59A1_TEM .......... .......... . 59C1_TEM .......... .......... . 85A1_TEM .......... .......... . 85C1_TEM .......... .......... .

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

3. So sánh trình tự axit amin gen kháng kháng sinh CTX-M với nhau

Alignment: C:\BioEdit\Temp\~out.tmp ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 2CTX LISLSRSSLP IWLTTIRLPK NTSTAQR-WQ N-ARPRCSTA TIPPTNLPSS VAREAR-LLP ARSAMRRFVW 3CTX ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 4CTX ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 5CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 6CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 7CTX ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 8CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 9CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 10CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 11CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 12CTX ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 13CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 14CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 15CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 16CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 17CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 18CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 19CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 22CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 23CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 24CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 25CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 27CTX ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 28CTX .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 188CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 189CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 190CT ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 191CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 192CT ...EL..KNL TL..I...R. S..MGRCH.L SL....Y... ITWRIS.LTL A..L.SPRS. DSWETK.S.S 194CT .SACRDQACR SG.QSDCRKT RQRHNDAGRT E--.G.VAVQ RQYRHEQIDC P..WPGRRDG FCPRD..D.S 198CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 199CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 201CT .......... .......... .......-.. .-........ .......... ......-... .......... 203CT .......ACR SG.QSDCRKT RQRHNDAGRT E--.G.VAVQ RQYRHEQIDC P..WPGRRDG FCPRD..D.S ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 80 90 100 110 120 130 140 2CTX IALNLRIPPF PATRETPPRR GRWRRRCVSL RWVMRWAKPS GRSWRGSKAI RPAQPAFGLD CLLPGLWGIK 3CTX TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 4CTX TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 5CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 6CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 7CTX TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 8CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 9CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 10CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 11CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 12CTX TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 13CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 14CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 15CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 16CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 17CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 18CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 19CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 22CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 23CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 24CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 25CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 27CTX TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 28CTX .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 188CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 189CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 190CT TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 191CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 192CT TVPSR.T... R.I.VI.LHL .Q..KL.G-I ...KH..TAN ....H.-... P.V.R..R.. .......... 194CT SGSHTYAEYR HSR.PERHHH AAGDGAD.AS AYAGSC.GRN PAGAV.DV.Q .QYDRRSQHS GR.TDVVDCG 198CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 199CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 201CT .......... .......... .......... .......... .......... ........PA YRRR...V.R 203CT SGSHTYAEYR HSR.PERHHH AAGDGAD.AS AYAGSC.GRN PAGAV.DV.Q .QYDRRSQHS GR.TDVVDCG ....|....| ....|....| ....|.... 150 160 2CTX PAAVAMAPPT IS--RSGQKI VRRFWSPTX 3CTX .......... ..--...... ......LL- 4CTX .......... ..--...... ......LL. 5CTX ...ATT...M .L--...RRV ......X-- 6CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LX. 7CTX .......... ..--...... ......LL. 8CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LL. 9CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 10CTX ...ATT...M .L--...RRV ......... 11CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 12CTX .......... ..--...... ......LL. 13CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LX. 14CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LL. 15CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LL. 16CTX ...A.T...M .L--...RRV ......... 17CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 18CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 19CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 22CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LL. 23CTX ...ATT...M .L--...RRV ......LL. 24CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 25CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 27CTX .......... ..--...... ......LL. 28CTX ...A.T...M .L--...RRV ......LL. 188CT ...A.T...M .L--...RRV ......... 189CT ...A.T...M .L--...RRV ......... 190CT .......... ..--...... ......... 191CT ...A.T...M .L--...RRV ......... 192CT .......... ..--...... ......... 194CT DRQRRLRHHQ YCGDLAAGSC AADSGHLL. 198CT ...A.T...M .L--...RRV ......... 199CT ...A.T...M .L--...RRV ......... 201CT ...A.T...M .L--...RRV ......LL- 203CT DRQRRLRHHQ YCGDLAAGSC AADSGHLL.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

4. So sánh trình tự axit amin gen kháng kháng sinh TEM với nhau

Alignment: C:\BioEdit\Temp\~out.tmp ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 60 70 1A_TEM MSIQHFRVAL IPFFAAFCLP VFAHPETLVK VKDAEDQLGA RVGYIELDLN SGKILESFRP EERFPMMSTF 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 80 90 100 110 120 130 140 1A_TEM KVLLCGAVLS RVDAGQEQLG RRIHYSQNDL VEYSPVTEKH LTDGMTVREL CSAAITMSDN TAANLLLTTI 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 150 160 170 180 190 200 210 1A_TEM GGPKELTAFL HNMGDHVTRL DRWEPELNEA IPNDERDTTM PAAMATTLRK LLTGELLTLA SRQQLIDWME 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 220 230 240 250 260 270 280 1A_TEM ADKVAGPLLR SALPAGWFIA DKSGAGERGS RGIIAALGPD GKPSRIVVIY TTGSQATMDE RNRQIAEIGA 2A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 3A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 4A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 5A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 6C_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 7A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 9A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 10A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 14TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 15TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 20TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 21TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 22TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 23TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 24TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 25TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 26TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 27TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 28TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 59C1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 85A1_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 1A_TEM .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....|. 1A_TEM SLIKHW 2A_TEM ...... 3A_TEM ...... 4A_TEM ...... 5A_TEM ...... 6C_TEM ...... 7A_TEM ...... 9A_TEM ...... 10A_TEM ...... 14TEM ...... 15TEM ...... 20TEM ...... 21TEM ...... 22TEM ...... 23TEM ...... 24TEM ...... 25TEM ...... 26TEM ...... 27TEM ...... 28TEM ...... 59A1_TEM ...... 59C1_TEM ...... 85A1_TEM ...... 1A_TEM ......

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản sinh men Betalactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình và Sóc Sơn

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử gen kháng Cephalosporin của vi khuẩn E. coli sản sinh men Beta- lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại

Thái Bình và Sóc Sơn

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách MỤC LỤC

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách DANH MỤC CÁC BẢNG

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách DANH MỤC CÁC HÌNH

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách MỞ ĐẦU

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách kháng sinh đang lưu hành. Trong những năm gần đây, các kháng sinh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách sinh men Beta-lactamase phân lập từ người chăn nuôi và lợn tại Thái Bình

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli mới trở nên cường độc và

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách di truyền, dẫn đến việc tổng hợp tích lũy những polypeptide sai lạc. Thuốc có

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Gồm 2 phân nhóm chính: penicillins và cephalosporins [8]

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách loại enzyme beta-lactamase và lấy luôn tên bệnh nhân đặt tên cho enzyme này

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách phải TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1. Đáng ngai là CTX-M có khả

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Hình 1.6. Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách mức cao cùng thời điểm, tỷ lệ phát hiện tại Trung Quốc là 24.5%, Hồng Kong

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách chiếm 60.8% so với 23.7% ở nhóm bệnh nhân nhiễm các chủng E. coli thông

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Cotrimoxazole

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG II: NỘI DUNG, VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Công nghệ Việt Nam được sử dụng để thực hiện nghiên cứu, danh mục theo

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách đoạn mồi (Hình 2.2). Như vậy, kết quả là một đoạn ADN định trước được

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 2.2.3. Phương pháp điện di kiểm tra kết quả

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách thải của người chăn nuôi có 69% số chủng E. coli mang gen CTX-M, 57% số

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách sang người chăn nuôi, cộng đồng nếu điều kiện chăn nuôi, vệ sinh chuồng

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 3.2.2. Đặc điểm sinh học phân tử gen CTX -M

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách trong những trình tự gen kháng kháng sinh CTX-M đầu tiên của E. coli được

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 305

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách 421

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách kết quả nàycũng thể hiện sự đa dạng các gen CTX-M [35]. Kết quả của

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách khẳng định có sự lây lan vi khuẩn E. coli mang gen kháng thuốc giữa người

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách trình mẫu với trình tự tham chiếu (Hình 3.10). Kết quả phát hiện ra 2 vị trí có

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Sóc Sơn. Vậy giữa người chăn nuôi và vật nuôi có sự lây truyền vi khuẩn E.

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Kiến nghị

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách TÀI LIỆU THAM KHẢO

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách Tiếng Anh

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách PHỤ LỤC

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Luận văn thạc sĩ sinh học Trần Xuân Bách

Có thể bạn quan tâm

Đề án Thạc sĩ: Năng suất sinh sản của lợn nái giống Landrace, Yorkshire, CP40 và CP51 phối với lợn đực Duroc nuôi tại trại giống Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai

Sổ tay Hướng dẫn giải pháp xử lý mùi hôi trong chăn nuôi lợn - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Sổ tay Hướng dẫn áp dụng VietGAHP/GMPs: Chuỗi sản xuất kinh doanh thịt lợn

Quy phạm Thực hành chuẩn VietGAHP/GMPs: Chuỗi sản xuất kinh doanh thịt lợn