Nghiên cứu định lượng Gliclazid trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Gliclazid trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụng detector TUV. Phương pháp: Định lượng Gliclazid trong các mẫu huyết tương bằng hệ thống sắc ký ACQUITY UPLC H-Class kết hợp detector TUV sử dụng cột sắc ký ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 450 mm, 1,6µm), thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu định lượng Gliclazid trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC

vietnam medical journal n01 - NOVEMBER - 2019 radiofrequency ablation for hepatocellular Criteria Applied in Multi-Phasic CT Can Predict Early carcinoma measuring 3-7 cm. Indian J Radiol Tumor Response in Patients with Hepatocellular Imaging., 29(1):47-52. Carcinoma Treated Using Conventional TACE: 2. Yeo D.M., Choi J.I., Lee Y.J., el al. (2014). RECIST, mRECIST, EASL or qEASL? Cardiovasc Comparison of RECIST, mRECIST, and choi criteria Intervent Radiol., 41(3):433-442. for early response evaluation of hepatocellular 6. Kim J.H., Sinn D.H., Shin S.W., el al. (2017). carcinoma after transarterial chemoembolization The role of scheduled second TACE in early-stage using drug-eluting beads. J Comput Assist hepatocellular carcinoma with complete response Tomogr., 38(3):391-7. to initial TACE. Clin Mol Hepatol., 23(1):42-50. 3. Gummadi S., Stanczak M., Lyshchik A., el al. 7. Tamandl D., Waneck F., Sieghart W., el al. (2018). Contrast-enhanced ultrasound identifies early (2017). Early response evaluation using CT- extrahepatic collateral contributing to residual perfusion one day after transarterial hepatocellular tumor viability after transarterial chemoembolization for HCC predicts treatment chemoembolization. Radiol Case Rep., 13(3):713-718. response and long-term disease control. Eur J 4. Kim M.Y., Kim J.W., Myung D.S., el al. Radiol., 90:73-80. (2016). Outcomes of Transarterial 8. Grosso M., Vignali C., Quaretti P., el al. Chemoembolization With or Without Additional (2008). Transarterial chemoembolization for Radiofrequency Ablation in Hepatocellular hepatocellular carcinoma with drug-eluting Carcinoma of 2 to 5 cm in Diameter. Iranian microspheres: preliminary results from an Italian Journal of Radiology, 14 (1); e13484. multicentre study. Cardiovasc Intervent Radiol., 5. Zhao Y., Duran R., Bai W., el al. (2018). Which 31(6):1141-9. NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GLICLAZID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG UPLC Chử Văn Mến*, Trần Thị Thu Huyền* TÓM TẮT 37 ULTRA PERFORMANCE LIQUID Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp CHROMATOGRAPHY phân tích Gliclazid trong huyết tương người bằng Objective: A rapid and specific method using ultra phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử performance liquid chromatography (UPLC) was dụng detector TUV. Phương pháp: Định lượng developed for determination of Gliclazide in human Gliclazid trong các mẫu huyết tương bằng hệ thống plasma. Method: Analytes were analyzed on sắc ký ACQUITY UPLC H-Class kết hợp detector TUV ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 x 450 mm, 1.6µm) sử dụng cột sắc ký ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x column with isocratic elution using TUV detector. The 450 mm, 1,6µm), thẩm định phương pháp theo hướng mobile phase consists of acetonitrile and phosphate dẫn của US-FDA và EMA . Kết quả: phương pháp có buffer solution with suitable ratio. The assay was giá trị giới hạn định lượng dưới nhỏ (0,16 µg/mL); linear over the concentration range of 0.16µg/mL – khoảng tuyến tính rộng (từ 0,16 µg/mL đến 5,4 5.4 µg/mL. The LLOQ was 0.16 µg/mL. The intra-day µg/mL); độ đúng, dao động trong khoảng 96,4 – and inter –day accuracy were within 96.4 – 110.7%. 110,7%; độ lặp lại với giá trị CV nhỏ ( CV
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 484 - THÁNG 11 - SỐ 1 - 2019 ký lỏng siêu hiệu năng UPLC có ưu điểm như tốc Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan chất chuẩn độ phân tích nhanh hơn, độ nhạy và độ phân Gliclazid (AS) trong MeOH để thu được dung dịch giải tốt hơn. Vì vậy, Chúng tôi thực hiện nghiên chuẩn gốc có nồng độ chính xác 1000µg/mL cứu này nhằm mục đích xây dựng phương pháp (WSS). Từ dung dịch chuẩn gốc WSS, chuẩn bị định lượng Gliclazid trong huyết tương người các chuẩn làm việc WS1, trong HTT để có nồng bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC có tính độ chính xác 5,4 µg/mL đặc hiệu và chọn lọc cao, phù hợp với điều kiện Phương pháp xử lý mẫu: Lấy 1mL HTT để Việt Nam để phục vụ cho việc đánh giá tương rã đông ở nhiệt độ phòng, thêm 10µL chuẩn nội. đương sinh học chế phẩm này. Lắc nhẹ bằng tay 5 giây. Thêm 5mL chloroform. Lắc cơ học ngang 10 giây. Ly tâm 3000 vòng/phút II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trong vòng 5 phút. Hút 3 mL lớp dung môi phía 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị trên. Bốc hơi dưới dòng khí Ni tơ ở 500C. Hòa tan 2.1.1. Nguyên vật liệu: Chất đối chiếu: cắn trong 0,5mL pha động. Tiêm sắc ký Gliclazid chuẩn dược điển Việt Nam, hàm Điều kiện sắc ký: Hệ thống phân tích UPLC lượng 100,6% tính theo nguyên trạng; Số kiểm Acquityvới buồng tiêm mẫu tự động có 4 kênh soát (SKS): 0105187; Glibenclamid là chất đối dung môi, detector TUV. Thực hiện phân tích Cột chiếu hóa học Quốc Gia, hàm lượng 99,7% tính sắc ký ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 450 mm, theo nguyên trạng; SKS: 0103129, được sử dụng 1,6µm) kết hợp detector TUV . Pha động bao làm chuẩn nội (IS) trong phương pháp phân tích. gồm dung môi A (ACN) và dung môi B (đệm Tất cả đều được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm phosphat pH 3,0) được sử dụng theo chương Thuốc Trung Ương. trình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải 0,3 Dung môi: Methanol (MeOH); Acetonitril mL/phút. Theo dõi sắc ký đồ ở bước sóng 229 (ACN), nước cất đạt tiêu chuẩn dung môi HPLC. nm trong toàn bộ thí nghiệm, xử lý bằng phần Dung môi Clorofom (CHCl3) đạt tiêu chuẩn tinh mềm Empower 3.0 khiết phân tích (P.A). Khảo sát điều kiện sắc để định lượng Gliclazid Huyết tương trắng: Là các mẫu không có trong các mẫu huyết tương. Lựa chọn phương Gliclazid và Glibenclamid được cung cấp bởi Khoa pháp cho phép tách, phát hiện Gliclazid với sự có Huyết Học và Truyền máu, Bệnh viện quân y mặt của Glibenclamid ở mức ng/mL 103; gồm 6 lô: 91802760; 91802680; 91802683; Phương pháp tính kết quả: Xác định nồng độ 91802812; 91802734; 91803010. Gliclazid có trong mẫu thử (chưa biết nồng độ) Mẫu trắng: là các mẫu huyết tương (HT) dựa vào tỷ lệ diện tích píc Gliclazid/IS thu được trắng không có Gliclazid và chuẩn nội từ sắc ký đồ của mẫu thử và đường chuẩn biểu Glibenclamid. Mẫu tự tạo là các mẫu huyết tương thị mối tương quan giữa nồng độ Gliclazid có trắng (HTT) thêm Gliclazid và Glibenclamid ở các trong mẫu chuẩn với tỷ lệ diện tích píc nồng độ thích hợp để xây dựng đường chuẩn Gliclazid/IS của mẫu chuẩn 2.1.2. Thiết bị 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích Hệ thống máy: Hệ thống máy phân tích sắc Phương pháp phân tích được thẩm định theo ký lòng siêu hiệu năng ACQUITY UPLC H-Class hướng dẫn chung của ICH (International (Hãng Waters, Mỹ) kết hợp với detector TUV Conference on Harmonisation) về thẩm định Acquity (Hãng Waters, Mỹ). Cột sắc ký ACQUITY phươn pháp phân tích gồm : Tính tương thích hệ UPLC BEH C18 (2,1 x 450 mm, 1,6µm). Cân thống, chọn lọc – đặc hiệu; khoảng nồng độ phân tích MS 205 DU (Mettler Toledo ,Thụy Sỹ); tuyến tính; độ chính xác; độ đúng), giới hạn định Máy đo pH (Metller toledo, Thụy Sỹ), thiết bị bốc lượng (LLOQ). (4,5) hơi dung môi có thổi khí N2 (Organomation, Mỹ), 2.2.3. Xử lý số liệu. Số liệu được phân tích Máy lắc vortex (IKAlabdancer, Đức); Máy lắc thống kê trên phần mềm Microsoft Excel Office ngang (IKA HS 260 basic, Đức). Tất cả các thiết 2010 và Origin 8.0 bị và dụng cụ phân tích được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC 17025 và GLP III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 2.2. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Kết quả lựa chọn phương pháp 2.2.1. Khảo sát phương pháp. Dung dịch Sau quá trình khảo sát, chúng tôi lựa chọn nội chuẩn (IS): Hòa tan chất chuẩn nội được phương pháp gồm các điều kiện sau: Glibenclamid trong MeOH để thu được dung dịch Phương pháp xử lý mẫu: Lấy 1mL HTT để rã nội chuẩn gốc có nồng độ chính xác 1000µg/mL đông ở nhiệt độ phòng, thêm 10µL chuẩn nội. (ISS). Lắc nhẹ bằng tay 5 giây. Thêm 5mL chloroform. Lắc cơ học ngang 10 giây. Ly tâm 3000 145
vietnam medical journal n01 - NOVEMBER - 2019 vòng/phút trong vòng 5 phút. Hút 3 mL lớp dung môi phía trên. Bốc hơi dưới dòng khí Ni tơ ở 500C. Hòa tan cắn trong 0,5mL pha động. Tiêm sắc ký Điều kiện sắc ký: Hệ thống phân tích UPLC Acquityvới buồng tiêm mẫu tự động có 4 kênh dung môi, detector TUV. Thực hiện phân tích Cột sắc ký ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 450 mm, 1,6µm) kết hợp detector TUV . Pha động bao gồm dung môi A (ACN) và dung môi B (đệm phosphat pH 3,0) được sử dụng theo chương trình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải 0,3 mL/phút. Theo dõi sắc ký đồ ở bước sóng 229 Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu HTT nm trong toàn bộ thí nghiệm, xử lý bằng phần mềm Empower 3.0 Phương pháp tính kết quả: Xác định nồng độ Gliclazid có trong mẫu thử (chưa biết nồng độ) dựa vào tỷ lệ diện tích píc Gliclazid/IS thu được từ sắc ký đồ của mẫu thử và đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ Gliclazid có trong mẫu chuẩn với tỷ lệ diện tích píc Gliclazid/IS của mẫu chuẩn 3.2. Kết quả thẩm định phương pháp 3.2.1. Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp. Phân tích các mẫu HTT và mẫu HT tự tạo chứa Gliclazid ở nồng độ (0,16 µg/mL) và chuẩn Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu HT tự tạo chứa nội với nồng độ 40 µg/mL theo phương pháp đã chuẩn Gliclazid (0.16 µg/mL ) và IS xây dựng và ghi lại sắc ký đồ 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính. Trên sắc đồ của HTT (Hình 1), tại các thời Phân tích các mẫu HT chứa chuẩn nội và chuẩn AS điểm 1,313 và 2,226 phút (trùng với thời gian có nồng độ khoảng 0,16 µg/mL đến 5,4 µg/mL lưu của Gliclazid và IS trong sắc ký đồ của mẫu theo quy trình đã xây dựng. Xác định sự tương chuẩn-Hình 2) không xuất hiện các píc. Do quan giữa nồng độ Gliclazid có trong mẫu và tỷ lệ vậy,phương pháp có độ đặc hiệu chọn lọc với diện tích píc AS/IS thu được trên SKĐ bằng Gliclazid và IS theo quy định của phương pháp phương pháp hồi qui tuyến tính, sử dụng hệ số phân tích thuốc trong dịch sinh học. weighting 1/x2. Kết quả thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: Kết quả thẩm định đường chuẩn của phương pháp Mẫu chuẩn Độ đúng (%) Nồng độ Đường Đường Đường Đường Đường (µg/mL) chuẩn 1 chuẩn 2 chuẩn 3 chuẩn 4 chuẩn 5 0,163 101,7 102,3 99,7 99,2 100,1 0,326 97,2 97,8 102,4 100,4 99,7 0,543 102,2 98,6 100,7 101,0 103,2 0,951 91,9 101,2 100,7 101,7 101,2 1,630 101,5 104,6 103,2 100,2 100,3 2,717 99,7 108,3 104,8 102,6 93,9 4,076 106,1 110,0 100,0 96,8 101,3 4,891 101,0 99,8 93,8 98,9 100,3 5,434 98,7 93,9 97,0 101,0 101,3 Phương trình hồi Y= 0,42x- Y= 0,3867x Y= 0,4240x - Y= 0,3538- Y= 0,3547x- quy (y = ax + b)* 0,0075 -0, 0029 0,0025 0,006 0,017 Hệ số r 0,999 0,999 0,996 1,000 1,000 (*) Ghi chú: x là nồng độ Gliclazid (µg/mL) độ 0,16 µg/mL đến 5,4 µg/mL có sự tương quan có trong mẫu; y là tỷ lệ diện tích píc Gliclazid/IS tuyến tính giữa nồng độ Gliclazid và tỷ lệ diện tích Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng píc AS/IS với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1. 146
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 484 - THÁNG 11 - SỐ 1 - 2019 Nồng độ Gliclazid xác định từ đường chuẩn so phương pháp. Phân tích các mẫu HTT và mẫu với nồng độ lý thuyết đều nằm trong khoảng giới HT chứa chuẩn nội và chuẩn Gliclazid có nồng độ hạn cho phép (80-120%) đối với nồng độ thấp chính xác khoảng 0,16 µg/mL (mẫu LLOQ). Xác nhất, 85-115% đối với các nồng độ còn lại theo định nồng độ Gliclazid có trong các mẫu LLOQ từ quy định của phương pháp phân tích thuốc trong các đường chuẩn tiến hành làm song song trong dịch sinh học. cùng điều kiện. Kết quả thẩm định giới hạn định 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới của dưới của phương pháp được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2: Kết quả xác định giá trị LLOQ của phương pháp Mẫu trắng Mẫu chuẩn tại nồng độ LLOQ (0,16µg/mL) STT Diện tích píc Diện tích píc AS Diện tích píc IS Nồng độ AS tìm thấy Độ đúng (%) 1 0 2126 44018 0,166 101,8 2 0 2256 43678 0,164 100,6 3 0 2127 43009 0,162 99,4 4 0 2214 42635 0,151 92,6 5 0 2359 43607 0,163 100,0 6 0 2079 42990 0,162 99,4 TB 0 2193,5 98,96 CV (%) 3,2 Đáp ứng trung bình của mẫu trắng/ LLOQ 0 Kết quả thẩm định cho thấy trong mẫu trắng độ lặp lai trên 4 lô mẫu LLOQ, LQC, MQC, HQC không xuất hiện píc có cùng thời gian lưu của chứa Gliclazid có nồng độ Gliclazid tương ứng púc Gliclazid trong các mẫu LLOQ. Tỷ lệ giữa 0,16 µg/mL; 0,49 µg/mL; 2,4 µg/mL; 4,5 µg/mL. nồng độ Gliclazid xác định từ đường chuẩn so Xác định hàm lượng Gliclazid trong các mẫu với nồng độ lý thuyết có trong các mẫu LLOQ bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều nằm trong khoảng 92,6-101,8% (trung bình kiện. Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ % giữa 98,96% và CV =3,2%), đáp ứng yêu cầu giới nồng độ xác định được so với nồng độ lý thuyết. hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng thuốc trong dịch sinh học. giá trị CV%. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại 3.2.4. Xác định độ đúng, độ lặp lại của của phương pháp được trình bày ở Bảng 3. phương pháp. Tiến hành thẩm định độ đúng, Bảng 3: Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày LLOQ LQC MQC ( HQC ( Độ đúng, độ (0,16µg/mL) (0,49µg/mL) 2,4µg/mL) 4,5µg/mL) lặp lại Độ đúng Độ đúng Độ đúng Độ đúng CV (%) CV (%) CV (%) CV (%) (%) (%) (%) (%) Trong ngày 110,6 2,96 102 1,7 96,4 4,5 101,3 2,8 Khác ngày 98,04 10,9 96,4 4,5 101,3 4,49 100,9 0,56 Kết quả thẩm định cho thấy ở các nồng độ Tiến hành nghiên cứu độ ổn định của Gliclazid thấp, trung bình và cao, phương pháp có độ đúng trong HT trên các lô mẫu LQC, HQC. Đánh giá độ trong ngày và khác ngày trong khoảng 96,4 – ổn định của Gliclazid trong HT bằng cách so sánh 110,7% là khoảng đáp ứng theo yêu cầu của nồng độ Gliclazid có trong các mẫu được bảo phân tích thuốc trong dịch sinh học. Độ lặp lại quản và các mẫu có nồng độ tương ứng được trong ngày và khác ngày với giá trị CV < 15%. phân tích ngay sau khi hòa tan chuẩn Gliclazid 3.2.5. Nghiên cứu độ ổn định của hoạt vào HTT. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chất trong huyết tương Gliclazid được trình bày trong Bảng 4 Bảng 4: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của Gliclazid trong huyết tương Nồng độ ban đầu Nồng độ sau bảo quản % Sai Độ ổn đinh Mẫu (µg/mL; n=6) (µg/mL; n=6) khác LQC 0,465 0,524 12,75 3 chu kỳ đông -rã HQC 4,517 4,880 8,04 Độ ổn định thời gian ngắn LQC 0,465 0,425 -8,61 (5,5 giờ/ nhiệt độ phòng) HQC 4,517 4,215 -6,68 Độ ổn định trong LQC 2,86 2,26 9,91 147
vietnam medical journal n01 - NOVEMBER - 2019 autosampler (25 giờ/100C) HQC 4,517 4,565 1,05 Độ ổn định dài ngày LQC 0,465 0,468 0,63 (-250C ± 50C, 69 ngày HQC 4,517 4,262 -5,66 V. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp 1. Campbell, D.B., R. Lavielle, and C. Nathan, định lượng Gliclazid trong huyết tương người The mode of action and clinical pharmacology of gliclazide: a review. Diabetes Res Clin Pract, 1991. bằng phương pháp UPLC. Kết quả thẩm định cho 14 Suppl 2: p. S21-36. thấy, phương pháp có giá trị giới hạn định lượng 2. Holmes, B., et al., Gliclazide. A preliminary dưới nhỏ (0,16 µg/mL); khoảng tuyến tính rộng review of its pharmacodynamic properties and (từ 0,16 µg/mL đến 5,4 µg/mL); độ đúng, dao therapeutic efficacy in diabetes mellitus. Drugs, 1984. 27(4): p. 301-27. động trong khoảng 96,4 – 110,7%; độ lặp lại 3. Gedawy, A., H. Al-Salami, and C.R. Dass, với giá trị CV nhỏ ( CV