Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của viên nang Giải thử khang GN16

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA<br /> VIÊN NANG GIẢI THỬ KHANG GN16<br /> Ngô Thị Tuyết Mai*; Phan Văn Minh**; Nguyễn Hoàng Ngân*<br /> Trần Quốc Bảo**; Hoàng Thị Tình***; Vũ Bình Dương*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trong 90 ngày của viên nang<br /> Giải thử khang GN16. Đối tượng và phương pháp: đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng<br /> chủng Swiss, độc tính bán trường diễn đánh giá trên chuột cống trắng chủng Wistar, theo<br /> hướng dẫn của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới. Kết quả: chuột nhắt uống Giải thử khang<br /> GN16 (liều tăng dần từ 24 g/kg/ngày đến 48 g/kg/ngày với lượng uống mỗi lần 0,2 ml/10 g cân<br /> nặng, uống 3 lần/24 giờ, uống cách nhau 3 giờ) không có biểu hiện độc tính cấp. Chuột cống<br /> uống Giải thử khang GN16 (liều 1,12 g/kg/ngày và liều 3,36 g/kg/ngày trong 90 ngày liên tục)<br /> không có thay đổi về tình trạng chung, huyết học và các chỉ số sinh hóa đánh giá chức năng<br /> gan, thận; hình ảnh mô bệnh học của gan, lách, thận bình thường. Kết luận: viên nang Giải thử<br /> khang GN16 an toàn khi đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trong 90 ngày.<br /> * Từ khóa: Giải thử khang GN16; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn.<br /> <br /> Studying the Acute and Subchronic Toxicity of Giai Thu Khang<br /> GN16 Capsules<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate the acute toxicity and 90 days subchronic toxicity of Giai Thu Khang<br /> GN16 capsules. Subject and method: The acute toxicity was evaluated in Swiss mice and<br /> 90 days subchronic toxicity was evaluated in Wistar rat, under the guidance of the Vietnamese<br /> Ministry of Health and the Word Health Organization. Results: Mice were administrated orally<br /> an ascending dose of Giai Thu Khang GN16 from 24 g/kg/day to 48 g/kg/day. The amount of<br /> 0.2 mL/10 g weight, 3 times/24 hours, every 3 hours. There was no symptom of acute toxicity.<br /> Rats were administrated orally Giai Thu Khang GN16 1.12 g/kg/day and 3.36 g/kg/day, during<br /> 90 days continuously. The rats were healthy. There were no changes in general condition,<br /> hematology and biochemical parameters used to evaluate liver and kidney functions. Histology<br /> of the liver, the spleen and the kidney was nomal. Conclusion: Giai Thu Khang GN16 capsules<br /> were safe when evaluating the oral acute toxicity and 90 days subchronic toxicity.<br /> * Keywords: Giai Thu Khang GN16; Acute toxicity; Subchronic toxicity.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> *** Viện Y học Cổ truyền Quân đội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/05/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/06/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 09/07/2018<br /> <br /> 5<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bạch hổ Nhân sâm thang gia giảm gồm<br /> các vị thuốc Thạch cao (Gypsum fibrosum),<br /> Cam thảo (Radix Glycyrrhizae), Tri mẫu<br /> (Rhizoma Anemarrhenae), Nhân sâm<br /> (Radix Ginseng), Ngạnh mễ (Semen Oryzae<br /> sativae), Đan sâm (Radix Salviae<br /> miltiorrhizae) có tác dụng thanh nhiệt giải<br /> thử, trấn kinh, sinh tân, chỉ khát dùng<br /> trong các trường hợp say nắng, say nóng.<br /> Ngoài ra còn có tác dụng hạ đường<br /> huyết, hạ lipid máu [4]. Với những tác<br /> dụng đó, Học viện Quân y đã nghiên cứu<br /> bào chế viên nang Giải thử khang (GTK)<br /> GN16 từ bài thuốc này nhằm mục đích<br /> sử dụng cho bộ đội trong phòng chống<br /> say nắng, say nóng. Để sản phẩm có thể<br /> được nghiên cứu thử nghiệm trên lâm<br /> sàng, cần có nghiên cứu đánh giá tính an<br /> toàn trên động vật thực nghiệm. Vì vậy,<br /> nghiên cứu này được tiến hành nhằm:<br /> Xác định độc tính cấp và bán trường diễn<br /> của chế phẩm.<br /> ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Chế phẩm nghiên cứu:<br /> Viên nang GTK GN16 do Trung tâm<br /> Nghiên cứu Ứng dụng Sản xuất Thuốc,<br /> Học viện Quân y bào chế đạt tiêu chuẩn<br /> cơ sở (số lô sản xuất 010917).<br /> * Động vật thí nghiệm:<br /> - Chuột nhắt trắng trưởng thành, dòng<br /> Swiss, số lượng 50 con không phân biệt<br /> giống, cân nặng 18 - 22 g đạt tiêu chuẩn<br /> thí nghiệm.<br /> - Chuột cống trắng trưởng thành, dòng<br /> Wistar, số lượng 24 con, không phân biệt<br /> giống, cân nặng 160 - 180 g.<br /> 6<br /> <br /> Động vật do Ban Chăn nuôi Động vật<br /> thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp,<br /> nuôi trong phòng nuôi động vật thí nghiệm<br /> một tuần trước khi nghiên cứu bằng thức<br /> ăn chuẩn dành cho động vật nghiên cứu,<br /> nước sạch uống tự do.<br /> * Dụng cụ máy móc:<br /> - Máy xét nghiệm sinh hoá tự động<br /> Chemix 180 (Hãng Sysmex).<br /> - Máy xét nghiệm huyết học tự động<br /> XE2100 (Hãng Sysmex).<br /> - Máy điện tim Fukuda FX 7102<br /> (Fukuda, Nhật Bản).<br /> - Cân phân tích 10-4, model CP224S<br /> (Sartorius, Đức).<br /> - Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ và<br /> các dụng cụ thí nghiệm khác.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Nghiên cứu độc tính cấp của viên<br /> nang GTK GN16:<br /> - Dựa theo phương pháp nghiên cứu<br /> xác định độc tính cấp của LitchfieldWincoxon, theo hướng dẫn của Bộ Y tế<br /> Việt Nam và Tổ chức Y tế Thế giới về<br /> nghiên cứu độc tính của thuốc [5].<br /> - Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho<br /> chuột nhịn ăn 16 giờ, nước uống tự do.<br /> Sau 16 giờ, chia ngẫu nhiên chuột thành<br /> 05 lô, mỗi lô 10 con. Các lô thử cho uống<br /> GTK với thể tích 0,2 ml/10 g/lần, 3 lần/24 giờ,<br /> mỗi lần cách nhau 3 giờ. Mức liều cho uống<br /> ở mỗi lô tăng dần: 24,0 g/kg; 30,0 g/kg<br /> 36,0 g/kg, 42,0 g/kg, 48,0 g/kg thể trọng.<br /> Uống thuốc thử trong vòng 1 ngày.<br /> - Theo dõi tình trạng chung của chuột và<br /> số lượng chuột chết ở mỗi lô trong vòng<br /> 72 giờ sau khi cho chuột uống GTK lần cuối.<br /> Xác định liều cao nhất không gây chết (0%),<br /> liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn<br /> (100%) và các liều trung gian. Từ đó<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50<br /> của viên nang GTK (nếu có). Sau đó tiếp tục<br /> theo dõi tình trạng chung của chuột (hoạt<br /> động, ăn uống, bài tiết…) ở mỗi lô cho đến<br /> hết 7 ngày sau khi uống viên nang GTK.<br /> Tiến hành phẫu tích, quan sát tình trạng<br /> các tạng ngay sau khi có chuột chết (nếu có)<br /> để xác định nguyên nhân gây độc.<br /> * Nghiên cứu độc tính bán trường diễn:<br /> Đánh giá độc tính bán trường diễn viên<br /> nang GN16 theo quy định của Bộ Y tế Việt<br /> Nam [1], hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế<br /> giới [5] đối với thuốc Y học cổ truyền.<br /> Chuột cống trắng 24 con, chia ngẫu nhiên<br /> thành 3 lô, mỗi lô 08 con.<br /> - Lô chứng: uống nước.<br /> - Lô trị 1: uống GTK liều 1,12 g/kg/ngày.<br /> - Lô trị 2: uống GTK liều 3,36 g/kg/ngày<br /> (gấp 03 lần liều 1).<br /> Chuột cho uống hàng ngày, trong<br /> 90 ngày.<br /> * Các chỉ tiêu đánh giá:<br /> - Tình trạng chung, thể trọng của chuột.<br /> - Điện tim chuột.<br /> <br /> - Đánh giá chức phận tạo máu thông<br /> qua xét nghiệm huyết học với các chỉ số:<br /> số lượng hồng cầu, thể tích trung bình<br /> hồng cầu, hàm lượng hemoglobin,<br /> hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức<br /> bạch cầu và số lượng tiểu cầu.<br /> - Đánh giá chức năng gan thông qua<br /> định lượng một số enzym và chất chuyển<br /> hoá trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn<br /> phần, albumin và cholesterol toàn phần;<br /> chức năng thận thông qua định lượng<br /> nồng độ creatinin huyết thanh [5]; mức độ<br /> tổn thương các cơ quan thông qua xét<br /> nghiệm mô bệnh học (sau 90 ngày uống<br /> thuốc nghiên cứu, 30% chuột được lựa<br /> chọn ngẫu nhiên, mổ để quan sát đại thể<br /> toàn bộ các cơ quan gan, thận, lách).<br /> * Thời điểm xét nghiệm: lấy máu xét<br /> nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học tại<br /> 3 thời điểm: trước khi uống, sau 45 ngày<br /> và 90 ngày uống.<br /> Dữ liệu được phân tích xử lý theo<br /> phương pháp thống kê y sinh học, so<br /> sánh bằng ANOVA test sử dụng phần<br /> mềm SPSS 16.0. Số liệu được biểu diễn<br /> dưới dạng ± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa<br /> thống kê khi p < 0,05.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Độc tính cấp của viên nang GTK.<br /> Bảng 1: Độc tính cấp theo đường uống của viên nang GTK trên chuột nhắt trắng.<br /> Lô chuột<br /> <br /> Số chuột<br /> thí nghiệm<br /> <br /> Liều sử dụng (g/kg<br /> trọng lượng cơ thể<br /> <br /> Thể tích cho uống<br /> <br /> Số chuột sống/chết<br /> sau 72 giờ<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 10<br /> <br /> 24,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 10<br /> <br /> 30,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 10<br /> <br /> 36,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 10<br /> <br /> 42,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 48,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 10/0<br /> <br /> Chuột nhắt trắng uống GTK với các mức liều khác nhau, từ liều thấp nhất 24,0 g/kg<br /> thể trọng đến liều cao nhất 48,0 g/kg thể trọng/24 giờ (liều cao nhất có thể đưa vào<br /> 7<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> đường uống), không có chuột nào chết, không xuất hiện triệu chứng bất thường trong<br /> 72 giờ sau uống GTK lần cuối và trong suốt 7 ngày sau uống. Như vậy, với mức liều<br /> uống cao nhất có thể cho chuột uống trong 24 giờ, chưa tìm thấy LD50 của viên nang<br /> GTK theo đường uống trên chuột nhắt trắng.<br /> 2. Độc tính bán trường diễn của viên nang GTK.<br /> * Ảnh hưởng của viên nang GTK đối với thể trạng:<br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của cao GTK tới thể trọng chuột.<br /> Thời điểm<br /> xét nghiệm<br /> <br /> Thể trọng<br /> (g)<br /> <br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> Lô nghiên cứu<br /> p<br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> n<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> x<br /> <br /> 168,34<br /> <br /> 167,59<br /> <br /> 169,25<br /> <br /> SD<br /> <br /> 2,81<br /> <br /> 4,34<br /> <br /> 3,57<br /> <br /> n<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> x<br /> <br /> 198,68<br /> <br /> 199,45<br /> <br /> 196,83<br /> <br /> SD<br /> <br /> 6,29<br /> <br /> 4,55<br /> <br /> 4,95<br /> <br /> n<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> x<br /> <br /> 223,64<br /> <br /> 224,11<br /> <br /> 223,20<br /> <br /> SD<br /> <br /> 4,54<br /> <br /> 4,27<br /> <br /> 5,01<br /> <br /> p<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> pb-a < 0,01; pc-b < 0,01; pc-a < 0,01<br /> <br /> - So sánh giữa các thời điểm sau so với trước thấy thể trọng chuột của cả ba lô nghiên<br /> cứu đều tăng, thay đổi có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.<br /> - Thể trọng của chuột ở hai lô uống viên nang GTK so với thể trọng của chuột ở lô chứng<br /> tại tất cả các thời điểm đo không thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> Như vậy, với các mức liều đã dùng chưa gây ra thay đổi đến tăng thể trọng của<br /> chuột trong quá trình nghiên cứu. Theo dõi hàng ngày tình trạng chung của chuột<br /> (ăn uống, tình trạng lông, da, niêm mạc, chất tiết) cho thấy chuột ở cả lô chứng và lô dùng<br /> thuốc đều hoạt động bình thường. Lông mượt, da và niêm mạc bình thường, ăn uống<br /> bình thường, phân thành khuôn.<br /> 8<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018<br /> * Ảnh hưởng của viên nang GTK đối với một số chỉ tiêu huyết học của chuột:<br /> Bảng 3: Ảnh hưởng của viên nang GTK lên các chỉ số huyết học của chuột (n = 8,<br /> <br /> x ± SD).<br /> Thời điểm xét nghiệm<br /> <br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> p<br /> <br /> 12<br /> <br /> Số lượng hồng cầu chuột (x10 g/l)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 5,29 ± 0,41<br /> <br /> 5,52 ± 0,95<br /> <br /> 5,35 ± 0,76<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> 5,57 ± 0,49<br /> <br /> 6,24 ± 0,20<br /> <br /> 5,72 ± 0,76<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> 6,30 ± 0,63<br /> <br /> 5,43 ± 0,54<br /> <br /> 6,07 ± 0,52<br /> <br /> p<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> -<br /> <br /> Hàm lượng hemoglobin trong máu chuột (g/dl)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 99,88 ± 4,61<br /> <br /> 103,25 ± 16,73<br /> <br /> 99,75 ± 13,25<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> 100,13 ± 6,64<br /> <br /> 113,25 ± 4,74<br /> <br /> 105,75 ± 14,35<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> 114,88 ± 7,55<br /> <br /> 102,38 ± 8,67<br /> <br /> 115,25 ± 13,40<br /> <br /> p<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> -<br /> <br /> Hematocrit (%)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 29,37 ± 1,51<br /> <br /> 29,98 ± 4,86<br /> <br /> 29,97 ± 4,25<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> 31,00 ± 2,52<br /> <br /> 34,55 ± 1,41<br /> <br /> 32,39 ± 4,69<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> 35,21 ± 2,36<br /> <br /> 30,29 ± 2,06<br /> <br /> 34,65 ± 3,94<br /> <br /> p<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> -<br /> <br /> Số lượng bạch cầu (G/l)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 6,79 ± 1,16<br /> <br /> 7,29 ± 2,55<br /> <br /> 7,10 ± 1,83<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> 5,39 ± 0,77<br /> <br /> 7,16 ± 1,68<br /> <br /> 5,92 ± 0,69<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> 7,33 ± 0,71<br /> <br /> 8,09 ± 1,62<br /> <br /> 7,48 ± 2,30<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Số lượng tiểu cầu (G/l)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 242,50 ± 67,69<br /> <br /> 293,75 ± 63,96<br /> <br /> 279,63 ± 90,14<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 45 ngày (b)<br /> <br /> 280,50 ± 98,16<br /> <br /> 353,00 ± 53,75<br /> <br /> 280,25 ± 29,67<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 90 ngày (c)<br /> <br /> 410,88 ± 93,99<br /> <br /> 366,13 ± 21,34<br /> <br /> 310,63 ± 80,86<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> ptrước sau<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> 9<br /> <br />