Nghiên cứu đột biến gen pre-S ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và ung thư gan

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN pre-S Ở BỆNH NHÂN<br /> VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ UNG THƯ GAN<br /> Nguyễn Trọng Chính*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: khảo sát đột biến gen pre-S trên bệnh nhân (BN) viêm gan B mạn tính (VGBMT)<br /> và ung thư gan (UTG). Đối tượng và phương pháp: phát hiện đột biến gen pre-S bằng giải trình<br /> tự gen trực tiếp trên hệ thống CEQ 8800 trên 148 BN được chia thành 2 nhóm: 94 BN UTG và<br /> 54 BN VGBMT. Kết quả: nồng độ HBV ADN ở nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm<br /> 9<br /> 9<br /> 8<br /> 9<br /> UTG (3,1 x 10 ± 1,05 x 10 so với 1,2 x 10 - 4,6 x 10 copies/ml, p < 0,001). 44/148 mẫu<br /> (29,7%) có đột biến gen cùng pre-S. Đột biến tại vị trí bắt đầu của đoạn pre-S2 phổ biến nhất<br /> (42%), tiếp theo là đột biến mất đoạn pre-S2 (37,2%), vùng khởi động pre-S (14,1%) và vùng<br /> khởi động pre-S2 (12,8%). Đột biến gen tại tất cả các vị trí ở nhóm UTG cao hơn có ý nghĩa so<br /> với nhóm VGBMT, trừ đột biến vùng khởi động pre-S2 (p < 0,05). Nguy cơ UTG ở BN có đột<br /> biến gen pre-S cao hơn có ý nghĩa so với BN không mang gen đột biến (trừ đột biến đoạn khởi<br /> động gen pre-S2), OR: 2,2 - 6,6. Kết luận: đột biến gen pre-S là một yếu tố nguy cơ tiến triển<br /> UTG trên BN nhiễm viêm gan virut B.<br /> * Từ khóa: Gen pre-S; Đột biến; Viêm gan B mạn tính; Ung thư gan.<br /> <br /> Investigation the pre-S Gene Mutation in Chronic Hepatitis B and<br /> Hepatocellular Carcinoma<br /> Summary<br /> Objectives: To investigate the mutations of pre-S gene in chronic hepatitis B (CHB) and<br /> hepatocellular carcinoma (HCC). Subjects and methods: Pre-S gene mutation was identified by<br /> direct sequencing in automatic system CEQ 8800 and 148 patients were divided into two<br /> groups: 94 patients with HCC and 54 patients with CHB. Result: HBV DNA level in CHB was<br /> 9<br /> 9<br /> 8<br /> 9<br /> significant higher than in HCC group (3.1 x 10 ± 1.05 x 10 vs 1.2 x 10 ± 4.6 x 10 copies/ml,<br /> p < 0.001). 44/148 patients (29.7%) carried the pre-S gene mutations. Point mutations at start<br /> codon of pre-S2 was most frequent with 42%, following by pre-S2 deletion (37.2%), pre-S1<br /> promoter (14.1%) and pre-S2 promoter (12.8%). Pre-S gene mutations in all, but pre-S2<br /> promoter were significant higher in HCC group compared to CHB group (p < 0.05). Risk of HCC<br /> in patients having pre-S gene mutations is significant higher compared to wild type with OR from<br /> 2.2 to 6.6. Conclusion: pre-S gene mutation is a risk factor for development of HCC in patients<br /> infected with HBV.<br /> * Key words: pre-S gene; Mutation; HBV; HCC.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Trọng Chính (chinhvmmu@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/02/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/03/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 23/03/2017<br /> <br /> 31<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> ĐẶT VẮN ĐỀ<br /> Nhiễm virut viêm gan B có thể gây nhiều<br /> bệnh cảnh khác nhau từ người mang virut<br /> không triệu chứng đến viêm gan cấp tự<br /> hồi phục, VGBMT, xơ gan, UTG và có thể<br /> tiến triển ngay thành viêm gan tối cấp.<br /> Nguyên nhân dẫn đến tình trạng đó cho<br /> đến nay vẫn còn nhiều tranh luận, kết quả<br /> nghiên cứu còn nhiều điểm chưa thống<br /> nhất. Nguyên nhân được quan tầm nhiều<br /> nhất trong thời gian gần đây là do chính<br /> sự khác nhau của bộ gen của viêm gan<br /> virut B.<br /> Viêm gan virut B là một virut có lõi<br /> ADN và virut nhân lên theo cơ chế sao<br /> chép ngược. Mặc dù bộ gen của viêm<br /> gan virut B không lớn, khoảng 3,2 kb,<br /> nhưng đây là một loại virut có nhiều đột<br /> biến gen. Nguyên nhân là do enzvm<br /> polymerase là một enzym đa chức năng,<br /> vừa có hoạt tính cửa ARNnase vừa có<br /> hoạt tính ADNnase, nên virut này có khả<br /> năng tái bản với tốc độ cao trong tế bào<br /> lây nhiễm. Đồng thời, enzym này không<br /> có hoạt tính đọc sửa nên trong quá trình<br /> tái bản bộ gen virut thường xảy ra các đột<br /> biến với tỷ lệ cao, ước tính từ 3,2 x 10-5<br /> đến 2,7 x 10-3 thay thế nucleotid tại mỗi vị<br /> trí trong 1 năm [2, 3]. Kết quả là quần thể<br /> HBV có thể tiến hóa nhanh hơn hầu hết<br /> các ADN virut khác trong khả năng đáp<br /> ứng với tác nhân môi trường và đột biến<br /> xuất hiện áp lực của những tác nhân này,<br /> có thể là hiện tượng xảy ra thường<br /> xuyên.<br /> Khung đọc mở (ORF) của gen - S khá<br /> dài, chứa 3 codon khởi đầu ATG, chia<br /> ORF này thành 3 vùng pre-S1, pre-S2 và<br /> S mã hóa cho 3 dạng protein bề mặt hay<br /> còn gọi là các kháng nguyên bề mặt<br /> (HBsAg) của virut: kháng nguyên S nhỏ<br /> mã hóa bởi gen S (226 amino axít-a.a),<br /> 32<br /> <br /> kháng nguyên S trung bình mã hóa bởi<br /> gen pre-S2/S (thêm 55 a.a so với kháng<br /> nguyên S nhỏ), kháng nguyên S lớn mã<br /> hóa bởi gen pre-Sl/pre-S2/S (tùy thuộc<br /> vào từng kiểu huyết thanh (serotype)<br /> thêm 108 a.a hoặc 119 a.a so với kháng<br /> nguyên S trung bình). Gene pre-S là một<br /> gen có tần suất biến đổi gen lớn nhất<br /> trong toàn bộ bộ gen của viêm gan virut<br /> B. Sự thay đổi của kiểu gen cũng như<br /> mức độ đáp ứng miễn dịch thay đổi với<br /> cơ thể phụ thuộc nhiều vào sự biến đổi<br /> gen này. Gần đâv, người ta thấv đột biến<br /> gen pre-S có liên quan chặt chẽ đến tiến<br /> triển ung thư gan trên BN nhiễm viêm gan<br /> virut B [4]. Đột biến mất đoạn pre-S sẽ<br /> gây lưu giữ một lượng lớn protein vỏ trong<br /> bào tương tế bào gan, từ đó dẫn tới kích<br /> thích các yếu tố khởi động tế bào bằng áp<br /> lực bất lợi trên hệ lưới nội sinh [5].<br /> Mối tương tác giữa đột biển mất đoạn<br /> pre-S, đột biến vùng khởi động lõi và<br /> vùng tiền lõi đã được nghiên cứu nhiều.<br /> Kết quả cho thấy đột biến mất đoạn và<br /> đột biến vùng khởi động pre-S1 là những<br /> yếu tố liên quan đến tiến triển bệnh nặng<br /> như xơ gan và UTG. Phân tích đa biến<br /> cho thấy khi kết hợp các đột biến trên<br /> 1 BN, nguy cơ tiến triển thành ung thư<br /> cao hơn rất nhiều [6].<br /> Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên<br /> cứu khảo sát đột biến gen pre-S trên<br /> nhóm bệnh do viêm gan virut B gây ra. Vì<br /> vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này<br /> nhằm: Khảo sát đội biến gen pre-S trên<br /> BN VGBMT và UTG.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> Tổng số 148 BN được chia thành 2<br /> nhóm: 94 BN UTG và 54 BN VGBMT.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn BN UTG:<br /> - Lâm sàng: BN mệt mỏi, ăn uống<br /> kém, gày sút cân nhanh. Có thể có các<br /> triệu chứng khác như gan to dưới bờ<br /> sườn, bờ sắc, mật độ chắc, có u cục lổn<br /> nhổn nổi trên bề mặt, đau khi thăm khám.<br /> - Xét nghiệm: có thể có một trong<br /> những dấu hiệu như AFP tăng cao,<br /> bilirubin trực tiếp và gián tiếp, AST, ALT<br /> có thể tăng. Siêu âm phát hiện khối tăng<br /> âm khu trú hoặc lan tỏa. Chụp CT hoặc<br /> MRI xác định có khối u. Sinh thiết gan xét<br /> nghiệm làm tế bào học hoặc/và mô bệnh<br /> học cho kết quả xác định có UTG và mức<br /> độ biệt hoá kèm theo. Xét nghiệm huyết<br /> thanh có HBsAg (+).<br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn BN VGBMT:<br /> - BN được xác định có HBsAg (+) sau<br /> thời gian > 6 tháng.<br /> - Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm<br /> sàng có biểu hiện tổn thương mô gan.<br /> Hiện tại có biểu hiện lâm sàng viêm gan<br /> như mệt mỏi, chán ăn, gan to dưới bờ sườn,<br /> mật độ chắc, có thể có vàng da. HBc - Ab<br /> - IgG (+), men ALT có thể tăng cao hơn<br /> <br /> 2 lần bình thường, bilirubin máu và nước<br /> tiểu có thể bình thường hoặc tăng.<br /> - Sinh thiết gan làm mô bệnh học cho<br /> thấy hình ảnh viêm gan mạn tính.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Các xét<br /> nghiệm về huyết học, sinh hóa, miễn dịch,<br /> chẩn đoán hình ảnh được tiến hành<br /> thường quy tại các khoa xét nghiệm,<br /> Bệnh viện TWQĐ 108. Chọc hút tế bào<br /> gan tiến hành tại Khoa Tiêu hóa, xử lý<br /> mẫu bệnh phẩm và xét nghiệm tế bào học<br /> tại Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh viện<br /> TWQĐ 108. Xét nghiệm giải trình tự gen<br /> pre-S được tiến hành tại Khoa Sinh học<br /> Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108.<br /> * Phân tích thống kê:<br /> Các số liệu được phân tích bằng thuật<br /> toán non-parametric Mann-Whitney U-test,<br /> chi bình phương (chi (2) test, so sánh<br /> không đối xứng t-test, so sánh 2 tỷ lệ, 2<br /> số trung bình bằng các phần mềm<br /> Statview, version 4.57 (www.statview.com)<br /> và chương trình STATA (www.stata.com).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu.<br /> Bảng 1: So sánh một số chỉ số cận lâm sàng thông thường giữa các nhóm.<br /> Các chỉ số<br /> <br /> VGBMT (n = 54)<br /> <br /> UTG (n = 94)<br /> <br /> p<br /> <br /> 39/15<br /> <br /> 79/15<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Tuổi (năm)<br /> <br /> 42,5 ± 12,3<br /> <br /> 55,1 ± 13,2<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> HBsAg (+/-)<br /> <br /> 54/0<br /> <br /> 94/0<br /> <br /> Không phân tích<br /> <br /> HBeAg (+/-)<br /> <br /> 33/21<br /> <br /> 56/38<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> 243 ± 34<br /> <br /> 107 ± 34<br /> <br /> < 0,01<br /> <br /> Giới (nam/nữ)<br /> <br /> TC (G/L)<br /> <br /> 33<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> AST (U/L)<br /> <br /> 251 ± 18,3<br /> <br /> 110,8 ± 107,4<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> ALT (U/L)<br /> <br /> 269,1 = 17,3<br /> <br /> 100,3 + 91,9<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> 42,1 ± 2,9<br /> <br /> 35,4 ± 15,1<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Protein toàn phần (g/l)<br /> <br /> 76 ± 10<br /> <br /> 72 ± 13<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Albumin (g/l)<br /> <br /> 39 ± 3<br /> <br /> 35 ± 3<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> Prothrombin (%)<br /> <br /> 80 ± 12<br /> <br /> 72 ± 10<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> Bilirubin (umol/l)<br /> <br /> Tổng số có 118/148 BN (79,8%) nam và 30/148 BN (20,2%) nữ. Tuy nhiên, giữa<br /> các nhóm không có sự khác biệt về tỷ lệ nam/nữ. Tuổi ở nhóm UTG cao hon so với<br /> nhóm VGBMT (p < 0,05). Không có khác biệt giữa 2 nhóm nghiên cứu về tình trạng<br /> mang kháng nguyên e và nồng độ protein toàn phần, albumin, bilirubin toàn phần. Tiểu<br /> cầu và prothrombin ở nhóm UTG thấp hơn, nhưng AST, ALT lại cao hơn có ý nghĩa so<br /> với nhóm VGBMT.<br /> 2. Nồng độ HBV ADN trên các nhóm nghiên cứu.<br /> 6E9<br /> <br /> HBV DNA (copies/ml)<br /> <br /> 5E9<br /> 4E9<br /> <br /> p< 0,001<br /> <br /> 3E9<br /> 2E9<br /> 1E9<br /> 0<br /> <br /> UTG<br /> <br /> VGBM<br /> T<br /> <br /> Hình 1: So sánh nồng độ HBV ADN trên các nhóm nghiên cứu.<br /> Nồng độ HBV ADN ở nhóm VGBMT cao hơn có ý nghĩa so với nhóm UTG (3,1 x<br /> 10 ± 1,05 x 109 so với 1,2 x 108 ± 4,6 x 109 copies/ml, p < 0,001).<br /> 9<br /> <br /> 3. Đột biến gen pre-S.<br /> * Các loại đột biến gen pre-S được tìm thấy:<br /> Để đảm bảo kết quả giải trình tự là chính xác, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng<br /> pre-S bằng cả mồi xuôi và mồi ngược, dùng phần mềm CEQ 8800 và BioEdit để xác<br /> định chính xác chuỗi trình tự giải được. Kết quả đã tìm thấy các đột biến điểm tại<br /> codon khởi động gen pre-S2 như đã được mô tả trong bài báo trước đây [1] và một số<br /> đột biến mất đoạn, được trình bày ở hình sau:<br /> 34<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> Hình 2: Kết quả phân tích gen phát hiện đột biến mất đoạn pre-S trên mẫu k13.<br /> So với trình tự không có đột biến, mẫu bệnh k13 có nhiều điểm đột biến xen lẫn đột<br /> biến mất đoạn. Hàng thứ nhất chỉ trình tự của mẫu k13 có đoạn gen bị mất so với mẫu<br /> bình thường được trình bày ở 2 hàng dưới.<br /> Từ kết quả phân tích trên máy giải trình tự gen CEQ 8800, chúng tôi tiến hành so<br /> sánh với Ngân hàng Gen (Genebank), kết quả được trình bày ở hình 3.<br /> > gb [G0355371.1] Hepatitis B virus isolate migrant 1208 large S protein (S),<br /> middle S protein (S), and small S protein (S) genes, complete cds<br /> Length = 1132.<br /> Score = 813 bits (440), Expect = 0,0.<br /> Identities = 514/547 (94%), Gaps = 16/547 (3%).<br /> Strand = plus/plus.<br /> <br /> Hình 3: Kết quả phân tích so sánh với Ngân hàng Gen<br /> phát hiện đột biến trên mẫu k13.<br /> Kết quả phân tích cho thấv so với mẫu chuẩn, mẫu nghiên cứu có đột biến mất<br /> đoạn (trong khung) phù hợp với tín hiệu trên hình 2.<br /> 35<br /> <br />