Nghiên cứu kỹ thuật multiplex RT-QPCR để kiểm tra chỉ tiêu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa trong mỹ phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu đặt mục tiêu khảo sát kỹ thuật multiplex RT-qPCR để kiểm tra đồng thời chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong mỹ phẩm và cũng có thể áp dụng cho các mẫu dược phẩm, chỉ tiêu E. coli và C. albicans sẽ được khảo sát trong nghiên cứu tiếp theo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu kỹ thuật multiplex RT-QPCR để kiểm tra chỉ tiêu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa trong mỹ phẩm

Nghiên cứu Dược học Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học;27(6):55-63 ISSN : 1859-1779 https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 Nghiên cứu kỹ thuật multiplex RT-QPCR để kiểm tra chỉ tiêu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa trong mỹ phẩm Trần Quang Ngọc Dũng1, Lê Văn Hoài Trân1, Lê Văn Thanh2, Trịnh Túy An1, Vũ Thanh Thảo1,3,* 1 Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam 2 Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam 3 Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Tóm tắt Đặt vấn đề: Theo hướng dẫn của TCVN 13634:2023, chỉ tiêu Staphylococcus aureus (S. aureus) và Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là yêu cầu bắt buộc trong kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn của mỹ phẩm. Kỹ thuật mutiplex RT-qPCR cho phép phát hiện nhanh và đồng thời các vi sinh vật chỉ thị dựa trên các gen đặc hiệu với độ nhạy và chính xác cao. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-qPCR để kiểm tra chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong mỹ phẩm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mồi và đoạn dò được đánh giá in vitro để lựa chọn nồng độ thích hợp. Quy trình định tính các vi khuẩn bằng mutiplex RT-qPCR được thẩm định độ đặc hiệu, tính tuyến tính và độ chính xác theo hướng dẫn của Broeders. Sau đó, hiệu quả pháp hiện của phương pháp multiplex RT-PCR được so sánh với phương pháp vi sinh trên 30 mẫu mỹ phẩm giả định. Kết quả: Kết quả thu được chứng minh rằng phương pháp multiplex RT-qPCR, sử dụng cặp mồi gyrB_F/gyrB_R (400 nM) với đoạn dò gyrB_P-GS (200 nM) đối với S. aureus và cặp mồi pbp-2_F/pbp-2_R (400 nM) với đoạn dò pbp-2 P- GS (200 nM) đối với P. aeruginosa, đạt được độ đặc hiệu, tính tuyến tính và độ chính xác (RSD< 25%). Phương pháp multiplex RT-qPCR phát hiện S. aureus và P. aeruginosa cho thấy có hiệu quả phát hiện tương đương với phương pháp vi sinh theo TCVN 13634:2023 trên mẫu mỹ phẩm giả định. Kết luận: Kỹ thuật mutiplex RT-qPCR có thể áp dụng để kiểm tra chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong giới hạn nhiễm vi sinh vật của mỹ phẩm. Từ khóa: mutiplex RT-qPCR; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; giới hạn nhiễm vi sinh vật Ngày nhận bài: 17-12-2024 / Ngày chấp nhận đăng bài: 24-12-2024 / Ngày đăng bài: 28-12-2024 *Tác giả liên hệ: Vũ Thanh Thảo. Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. E-mail: vuthanhthao@ump.edu.vn. © 2024 Bản quyền thuộc về Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh. https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn 55
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024 Abstract MULTIPLEX RT-QPCR TECHNIQUE FOR TESTING STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA IN COSMETICS Tran Quang Ngoc Dung, Le Van Hoai Tran, Le Van Thanh, Trinh Tuy An, Vu Thanh Thao Introduction: To ensure cosmetic products meet acceptable microbiological standards, Vietnamese standard TCVN 13634:2023 mandates testing for microorganisms such as Staphylococcus aureus (S. aureus) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Multiplex RT-qPCR offers a rapid and simultaneous detection method for these indicator microorganisms by targeting specific genes, exhibiting good analytical performance and high specificity. Objective: This research focused on the application of the multiplex RT-qPCR technique for detecting S. aureus and P. aeruginosa to assess the microbial quality of cosmetics. Methods: In this study, primers and probes were evaluated in vitro to determine optimal concentrations. The identification of indicator bacteria using multiplex RT-qPCR was validated for specificity, accuracy, and precision following Broeder's guidelines. The detection efficiency of the developed multiplex RT-qPCR method was then compared with that of the standard microbiological method using 30 simulated cosmetic samples. Results: The obtained results demonstrated the acceptable specificity, linearity, and accuracy (RSD< 25%) of the multiplex RT-qPCR method, utilizing the gyrB_F/gyrB_R primer pair (400 nM) with the gyrB_P-GS probe (200 nM) for S. aureus and the pbp-2_F/pbp-2_R primer pair (400 nM) with the pbp-2 P-GS probe (200 nM) for P. aeruginosa. The multiplex RT-qPCR method displayed comparable detection efficiency to the standard microbiological method as specified in TCVN 13634:2023 when tested on the simulated cosmetic samples. Conclusion: The developed multiplex RT-qPCR technique is a suitable method for testing for S. aureus and P. aeruginosa as indicators of microbiological quality in cosmetics. Keywords: multiplex RT-qPCR; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; microbiological limits 1. ĐẶT VẤN ĐỀ đến loài vi sinh vật. Tuy nhiên, các phương pháp trên cần thời gian thực hiện kéo dài và phải thực hiện nhiều bước tiến Để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, mỹ phẩm phải hành để định danh vi sinh vật nhiễm trong mẫu đến mức độ tuân thủ các giới hạn nhiễm vi sinh vật nghiêm ngặt trước loài [2]. Phương pháp qPCR hoặc multiplex qPCR phát hiện khi được đưa ra thị trường. Điều này giúp ngăn ngừa biến dựa trên gen đặc hiệu cho các chủng vi sinh vật vì vậy giúp đổi chất lượng sản phẩm và bảo vệ người dùng khỏi tác hại rút ngắn thời gian để phát hiện, mặt khác phương pháp có độ tiềm ẩn. Theo quy định của tiêu chuẩn quốc gia TCVN nhạy và độ đặc hiệu cao. Đối với multiplex qPCR có thể phát 13634:2023, tương đương với tiêu chuẩn ISO 17516:2014 hiện nhiều chủng vi sinh vật trong cùng một phản ứng vì vậy [1], các vi sinh vật chỉ thị như Escherichia coli (E. coli), giúp giảm chi phí cho việc kiểm nghiệm [3]. Một số nghiên Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa cứu đã áp dụng kỹ thuật qPCR hoặc multiplex qPCR để xác (P. aeruginosa), Candida albicans (C. albicans) không được định vi sinh vật chỉ thị. Lim và cộng sự (2021) đã nghiên cứu phát hiện trong 1 g (ml) với tất cả các loại mỹ phẩm. Phương kỹ thuật multiplex real-time PCR để phát hiện đồng thời pháp tăng sinh và phân lập trên môi trường chọn lọc để giúp K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus và M. catarrhalis phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật chỉ thị trong mẫu, trong mẫu đờm, phương pháp có giới hạn phát hiện 5.102 bản cũng như phải kết hợp với các phản ứng sinh hóa để xác định sao/phản ứng [4]. Nghiên cứu của Dung và cộng sự (2024) 56 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024 đã sử dụng multiplex real-time PCR để phát hiện đồng thời đủ thể tích 20 µl. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR tổ hợp 1 (E. coli, S. aurerus và S. pneumoniae) và tổ hợp 2 gồm 1 chu kỳ phiên mã ngược ở 55 ℃ trong 600 giây, 1 chu (A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa) trong mẫu kỳ biến tính ban đầu ở 95 ℃ trong 60 giây, 40 chu kỳ: biến bệnh phẩm đường hô hấp (mẫu hút dịch khí quản), kết quả tính ở 95 ℃ trong 10 giây và gắn mồi-kéo dài ở 60 ℃ trong 3 cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là 3,2.10 CFU/ml 40 giây. với mỗi vi khuẩn [5]. Bên cạnh đó, chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa cũng là chỉ tiêu cần kiểm tra đồng thời trong giới 2.4. Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng hạn nhiễm khuẩn của các mẫu dược phẩm như thuốc dùng multiplex RT-qPCR theo đường niêm mạc, thuốc dùng theo đường âm đạo, thuốc Cặp mồi phát hiện S. aureus và P. aeruginosa riêng lẻ dán, thuốc hít… Do đó, trong nghiên cứu đặt mục tiêu khảo được tham khảo từ nghiên cứu của Alvarez [7] và Savli [8], sát kỹ thuật multiplex RT-qPCR để kiểm tra đồng thời chỉ đoạn dò được thiết kế bằng công cụ PrimerQuest™ (IDT) tiêu S. aureus và P. aeruginosa trong mỹ phẩm và cũng dựa trên trình tự đoạn gen được khuếch đại của mỗi cặp mồi có thể áp dụng cho các mẫu dược phẩm, chỉ tiêu E. coli được lựa chọn, với giá trị Ct chấp nhận của chứng âm là lớn và C. albicans sẽ được khảo sát trong nghiên cứu tiếp theo. hơn 33 với P. aeruginosa và lớn hơn 35 với S. aureus. Trong phản ứng multiplex RT-qPCR, nồng độ mồi được khảo sát từ 200-400 nM và mẫu dò từ 100-200 nM [9] (Bảng 1). 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5. Thẩm định phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật 2.1. Chủng vi sinh vật multiplex RT-qPCR Chủng vi sinh vật gồm có Pseudomonas aeruginosa Độ đặc hiệu của mồi quyết định độ đặc hiệu của ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, phương pháp, do đó mồi đặc hiệu để phát hiện S. aureus Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae và P. aeruginosa cần dương tính với RNA của 2 chủng trên ATCC 13883, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans và âm tính với RNA của vi khuẩn khác cũng như vi nấm. ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404, chủng vi sinh Mẫu vi khuẩn chiết ở OD600 = 0,1 tương ứng với mật độ 108 vật được mua từ Microbiologics (Hoa Kỳ). CFU/ml được pha loãng thành dải nồng độ theo cấp số 10, trải đếm xác định mật độ và chiết RNA để thực hiện RT-qPCR. Mật độ vi khuẩn khảo sát với S. aureus là 106, 2.2. Phương pháp chiết RNA vi sinh vật 5.105, 105, 5.104, 104, 5.103 tế bào/ml; với P. aeruginosa là Phương pháp chiết RNA vi sinh vật sử dụng sodium 1,6.106, 8.105, 1,6.105, 8.104, 1,6.104, 8.103 tế bào/ml, sau đó dodecyl sulfat (SDS) để phá vỡ tế bào và TRIzol để xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa số Ct và log tinh chế RNA (SDS-TRIzol). Vi khuẩn được tăng sinh của số tế bào. Độ chính xác được đánh giá qua hai chỉ trong Tryptic Soy Broth (TSB) ở 37 ℃ trong 16 giờ. tiêu là độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Để thẩm Mật độ vi khuẩn sau khi tăng sinh được điều chỉnh về định độ lặp lại, mẫu ở các cấp pha loãng được thực hiện mật độ 108 CFU/ml tương ứng với OD600 khoảng 0,1 bằng phản ứng RT-qPCR lặp lại 3 lần trong 3 ngày. Độ chính NaCl 0,9%. Ly tâm 1,0 ml dịch vi sinh vật ở 12.000 g trong xác trung gian, mẫu ở các cấp pha loãng được thực hiện 1 phút, thu tế bào và chiết tách RNA [6]. RT-qPCR lặp lại 6 lần trong 2 ngày khác nhau. Số Ct của các mẫu phải có RSD ≤ 25% [10,11]. 2.3. Phản ứng mutiplex RT-qPCR Phản ứng RT-qPCR được thực hiện bằng bộ kit Luna® 2.6. So sánh phương pháp multiplex RT-PCR và Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (E3006) (New phương pháp vi sinh trên mẫu giả định England BioLabs® Inc). Thành phần của phản ứng bao gồm Ba mươi mẫu mỹ phẩm giả định được chuẩn bị bằng cách Luna reaction mix 2X, Luna enzym mix 20X, mồi xuôi và thêm 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và S. aureus mồi ngược và mẫu dò ở nồng độ phù hợp sẽ được khảo sát, vào mẫu. Các chủng được kỹ thuật viên (KTV) đầu tiên thêm 5 µl khuôn mẫu RNA và nước chứa DEPC được bổ sung vừa https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn| 57
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024 mẫu mỹ phẩm dạng xịt khoáng ở mật độ khoảng 1-5 tế vi sinh. Danh sách các chủng được thêm vào ở mỗi mẫu sẽ bào/ml, KTV thứ hai sẽ hút 1 ml mẫu sau khi chuẩn bị và được ghi lại bởi KTV thứ nhất nhưng không được chia sẻ tăng sinh trong 9 ml môi trường TSB trong 24 giờ. Sau 24 cho KTV thứ hai (mù đơn). So sánh chỉ số của 2 phương giờ tăng sinh, tiến hành chiết RNA, kiểm tra bằng phản ứng pháp bao gồm: độ nhạy (sensitivity), giá trị chẩn đoán dương multiplex RT-qPCR. Dịch tăng sinh đồng thời được cấy vào tính (positive predictive value, PPV), độ đặc hiệu đĩa thạch Manitol Salt Agar (MSA) để phát hiện S. aureus và (specificity), giá trị chẩn đoán âm tính (negative predictive Cetrimid Agar để phát hiện P. aeruginosa bằng phương pháp value, NPV), độ chính xác [12]. Bảng 1. Danh sách các mồi và đoạn dò sử dụng trong nghiên cứu Gen đích Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tham khảo/ thiết kế pbp-2 pbp-2_F CCGCCACTACCCGCTGAAG Savli [8] pbp-2_R TGCCGTGCAACTCGCTCTC pbp-2_P-GS HEX-CGCCCGACGTACCCGACCGA-BHQ1 Thiết kế gyrB gyrB_F GGTGCTGGGCAAATACAAGT Alvarez [7] gyrB_R TGGGATACCACGTCCGTTAT gyrB_P-GS FAM-TGGTGCAAACCTCTCTCTGAAGTCG-BHQ1 Thiết kế pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS, 3. KẾT QUẢ nồng độ mồi 400 nM và đoạn dò 200 nM được chọn để phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa (Bảng 2). 3.1. Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng multiplex RT-qPCR 3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phát hiện Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ của cặp mồi và đoạn dò phát đồng thời Staphylococcus aureus và hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa bằng kỹ thuật Ct multiplex RT-qPCR 3.1.1. Độ đặc hiệu Nồng độ mồi/đoạn S. aureus P. aeruginosa dò (nM) Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi và đoạn dò Chứng Chứng Chứng Chứng dương âm dương âm pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và gyrB_F/ gyrB_R/ 400/200 24,21 - 21,50 37,03 gyrB_P-GS cho Ct các mẫu RNA vi khuẩn K. pneumoniae, E. coli, B. subtilis và vi nấm như A. niger và C. albicans lần 300/150 24,97 - 23,00 38,83 lượt âm tính với tín hiệu FAM để phát hiện S. aureus, Ct của 200/100 27,33 - 26,09 36,98 các mẫu trên với tín hiệu huỳnh quang là HEX để phát hiện Ghi chú: “-”: âm tính P. aeruginosa dao động trong khoảng 37 đến 38 tương Cặp mồi và đoạn dò pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp-2_P-GS và đương với mẫu chứng âm. Vậy cặp mồi cặp mồi và đoạn dò gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS được khảo sát ở các nồng độ gyrB_F/ gyrB_R/ gyrB_P-GS và pbp-2_F/ pbp-2_R/ pbp- mồi 400 nM-200 nM và đoạn dò từ 200 nM-100 nM. Khi 2_P-GS bắt cặp đặc hiệu với S. aureus và P. aeruginosa, giảm nồng độ mồi và mẫu dò thì Ct các mẫu chứng dương ở phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa nồng độ mồi từ 400-200 nM có tăng dần từ 24,21-27,31 với bằng multiplex RT-qPCR đạt độ đặc hiệu (Hình 1). S. aureus và 21,50-26,09 với P. aeruginosa. Mẫu chứng âm 3.1.2. Tính tuyến tính ở nồng độ mồi 400-200 nM khi phát hiện P. aeruginosa có Ct là 36,98-38,83; các mẫu chứng âm khi phát hiện S. aureus Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp đều không ghi nhận Ct. Vì vậy cặp mồi và đoạn dò pbp-2_F/ phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa cho 58 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024 thấy đối với S. aureus các mẫu có RSD dao động từ xây dựng có phương trình: y = -3,2477x + 41,94 với 0,32-1,12% (< 25%). r2 = 0,996 (> 0,980), trong đó x là log của số tế bào và y Đường hồi quy tuyến tính được xây dựng có phương là giá trị Ct. Vậy phương pháp phát hiện đồng thời S. trình: y = -3,3529x + 44,334 với r2 = 0,998 (> 0,980). Kết aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật RT-qPCR đạt độ tuyến tính với khoảng xác định từ 5.103-1.106 tế bào. quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp phát hiện Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,52.103 tế đồng thời S. aureus và P. aeruginosa đối với bào/ml với S. aureus và 2,42.10 3 tế bào/ml với P. aeruginosa cho thấy các mẫu có RSD dao động từ P. aeruginosa (Hình 2). 0,32-0,97% (< 25%). Đường hồi quy tuyến tính được Hình 1. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang theo số chu kỳ của mẫu khảo sát độ đặc hiệu để phát hiện S. aureus và P. aeruginosa A. S. aureus, B. P. aeruginosa, 1. Mẫu RNA của S. aureus, 2. Mẫu RNA của P. aeruginosa Hình 2. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang theo số chu kỳ của mẫu khảo sát độ tuyến tính để phát hiện S. aureus và P. Aeruginosa A. S. aureus, B. P. aeruginosa, 1-6: các nồng độ khảo sát trên đường tuyến tính, 7: mẫu chứng âm. 3.1.3. Độ chính xác Bảng 3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phát hiện RT-qPCR đồng thời S. aureus và P. aeruginosa đối với S. aureus của S. aureus P. aeruginosa các mẫu có RSD dao động từ 0,87-2,13%. Kết quả khảo sát RSD Tế bào Ct SD RSD (%) Tế bào Ct SD độ lặp lại của phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và (%) P. aeruginosa đối với P. aeruginosa của các mẫu có RSD dao 106 24,28 0,31 1,27% 1,6.106 21,63 0,24 1,10% động từ 0,78-1,95% (Bảng 3). Độ chính xác trung gian 5.105 25,17 0,42 1,65% 8.105 22,86 0,32 1,41% với phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và 105 27,67 0,22 0,79% 1,6.105 25,20 0,23 0,93% P. aeruginosa đối với S. aureus của các mẫu có RSD từ 0,57-1,52% (< 25%). Độ chính xác trung gian với 5.104 28,77 0,25 0,87% 8.104 26,23 0,21 0,78% phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. 104 31,03 0,47 1,51% 1,6.104 28,44 0,38 1,35% aeruginosa đối với P. aeruginosa của các mẫu có RSD dao 5.103 31,88 0,68 2,13% 8.103 29,12 0,57 1,95% động từ 0,62-1,38% (< 25%) (Bảng 4). https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn| 59
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024 Bảng 4. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa bằng kỹ thuật multiplex RT-qPCR Tế bào Ct SD RSD (%) Tế bào Ct SD RSD (%) 106 24,29 0,20 0,83% 1,6.106 21,64 0,19 0,88% 5.105 25,18 0,29 1,16% 8.105 22,87 0,22 0,98% 105 27,69 0,16 0,57% 1,6.105 25,21 0,16 0,62% 5.104 28,79 0,17 0,60% 8.104 26,24 0,17 0,64% 104 31,05 0,34 1,08% 1,6.104 28,46 0,26 0,92% 5.103 31,89 0,48 1,52% 8.103 29,14 0,40 1,38% 3.3. Kết quả so sánh phương pháp multiplex với các mẫu đã được thêm vào trong thực tế, chiếm tỉ lệ RT-PCR và phương pháp vi sinh trên mẫu giả định 96,67%. Có 1/30 mẫu cho kết quả không tương đồng, trong Hai vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa trong 30 mẫu mỹ đó phương pháp vi sinh cho 1 kết quả âm tính giả (mẫu số 9, phẩm giả định sẽ được kiểm tra bằng mutiplex RT-qPCR và chiếm tỉ lệ 3,33%). Các kết quả thu nhận được sử dụng để phương pháp vi sinh (Bảng 5). Trong tổng số 30 mẫu, có tính toán các thông số giá trị kiểm nghiệm bao gồm độ nhạy, 29/30 mẫu được kiểm tra bằng phương pháp mutiplex RT- độ đặc hiệu, giá trị chẩn đoán âm tính, giá trị chẩn đoán qPCR cho kết quả tương đồng với phương pháp vi sinh và dương tính của phương pháp mutiplex RT-qPCR (Bảng 6). Bảng 5. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu S. aureus và P. aeruginosa của 30 mẫu giả định Vi khuẩn Kết quả mutiplex RT-qPCR Vi khuẩn Kết quả mutiplex RT-qPCR Kết quả Kết quả Mẫu cho vào cho vào phương phương pháp Mẫu thử thử mẫu giả mẫu giả pháp Ct của P Ct của S Kết quả vi sinh Ct của P Ct của S Kết quả định định vi sinh 1 P 23,86 35,75 P P 16 PS 25,54 23,31 PS PS 2 PS 22,25 31,76 PS PS 17 S 29,91 35,66 S S 3 S 33,17 20,02 S S 18 S 34,74 22,16 S S 4 P 25,63 35,00 P P 19 - 35,90 36,31 - - 5 S 35,34 19,06 S S 20 PS 20,21 28,62 PS PS 6 PS 18,53 17,22 PS PS 21 PS 20,98 29,54 PS PS 7 S 35,21 26,18 S PS 22 - 33,40 34,04 - - 8 PS 18,82 17,72 PS PS 23 - 33,56 34,88 - - 9 PS 20,51 27,18 PS S 24 P 21,04 36,69 P P 10 - 35,50 35,78 - - 25 P 20,75 36,61 P P 11 S 34,43 25,09 S S 26 P 20,52 35,26 P P 12 S 34,20 31,41 S S 27 - - - - - 13 S 33,04 24,52 S S 28 PS 21,83 23,35 PS PS 14 PS 23,35 20,98 PS PS 29 P 20,20 39,36 P P 15 P 24,81 35,66 P P 30 P 26,95 37,67 P P Chứng dương 30,04 31,46 Chứng âm 33,23 35,23 Ghi chú: S: S. aureus, P: P. aeruginosa, “-“: không phát hiện vi khuẩn 60 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024 Bảng 6. Kết quả so sánh hiệu quả của hai phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu mỹ phẩm giả định Phương pháp mutiplex Phương pháp vi sinh Giá trị RT-qPCR P. aeruginosa S. aureus P. aeruginosa S. aureus Độ nhạy (%) 100,00 100,00 94,44 100,00 Độ đặc hiệu (%) 100,00 100,00 100,00 100,00 PPV (%) 100,00 100,00 100,00 100,00 NPV (%) 100,00 100,00 92,31 100,00 Độ chính xác (%) 100,00 100,00 96,97 100,00 4. BÀN LUẬN hiện là 2,5.103 bản sao tế bào ban đầu [14]. Nghiên cứu của Dung và cộng sự (2024) sử dụng multiplex qPCR để phát hiện DNA của sáu chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng đường Phương pháp xác định S. aureus và P. aeruginosa đồng hô hấp dưới trong đó có S. aureus và P. aeruginosa, tuy nhiên thời bằng multiplex RT-qPCR với cặp mồi gyrB_F/gyrB_R hai chủng này không được phát hiện đồng thời mà phát hiện (400 nM), đoạn dò gyrB_P-GS (200 nM) (với S. aureus) và trong hai phản ứng riêng biệt theo cơ chế nhuộm xen giữa cặp mồi pbp-2_F/pbp-2_R (400 nM), đoạn dò pbp-2_P-GS với SYBR [5], và kết quả của nghiên cứu cũng chỉ đạt độ (200 nM) (với P. aeruginosa) đạt tính đặc hiệu, tính tuyến nhạy khi phát hiện S. aureus là 63,6%. Kỹ thuật mutiplex tính và độ chính xác (RSD < 25%). Giới hạn phát hiện của qPCR được áp dụng ở các nghiên cứu nêu trên đều sử dụng phương pháp là 1,52.103 tế bào/ml với S. aureus và 2,42.103 DNA làm khuôn mẫu, còn với phương pháp xác định chỉ tiêu tế bào/ml với P. aeruginosa, giới hạn này cao hơn so với giới S. aureus và P. aeruginosa đã xây dựng trong nghiên cứu này, hạn nhiễm khuẩn của mỹ phẩm quy định là không có mặt RNA được chọn làm khuôn mẫu, đó có thể là một trong của S. aureus và P. aeruginosa trong 1 g (ml) mẫu thử. Tuy những lý do dẫn đến sự chênh lệch về giới hạn phát hiện với nhiên đối với các chỉ tiêu định tính vi sinh vật gây bệnh, mẫu các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên với giới hạn nhiễm thử có thể được tăng sinh trong khoảng 16-24 giờ để đạt đến khuẩn, quy định là không có vi sinh vật sống trong mẫu, ngưỡng mà phương pháp có thể phát hiện. do đó với khuôn mẫu là RNA, chỉ tồn tại ở tế bào sống, Skof và cộng sự (2004) [13] đã nghiên cứu việc phát hiện và bị phân hủy khi tế bào chết đi, sẽ giúp xác định chính S. aureus và P. aeruginasa trong dược phẩm khác nhau bằng xác là có vi sinh vật sống hoặc không có vi sinh vật sống qPCR. Kết quả cho thấy, phương pháp qPCR có thể phát hiện trong mẫu. được 2 chủng vi khuẩn trong 34 mẫu dược phẩm khác nhau Chuyên luận 1223 trong Dược điển Mỹ quy định về việc (sau thời gian tăng sinh 24 giờ). Kết quả phát hiện bằng qPCR phù hợp với kết quả theo phương pháp quy định trong đánh giá một phương pháp thay thế phương pháp vi sinh để Dược điển Châu Âu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, tác phát hiện vi sinh vật. Một trong những phương pháp có thể giả phát hiện riêng lẻ 2 chủng vi khuẩn, không tiến hành phát sử dụng để đánh giá chỉ tiêu vi sinh là thông qua việc khuếch hiện đồng thời, điều này làm tăng chi phí cho việc kiểm đại acid nucleic. Các thông số đánh giá thường được đề nghị nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn. Nghiên cứu của Lin và cộng cho thử nghiệm vi sinh định tính gồm: độ đặc hiệu, giới hạn sự (2014) đã tiến hành chiết tách DNA, phát hiện đồng thời phát hiện, độ bền vững của phương pháp (phương pháp S. aureus và P. aeruginosa để kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn không bị ảnh hưởng bởi những thay đổi nhỏ như thể tích của trong mẫu dược phẩm. Với 2 gen sử dụng là femB cho thuốc thử, thời gian ủ hoặc nhiệt độ môi trường) và độ chính S. aureus và gen mã hóa cho tiểu đơn vị B của gyrase với xác, và tính tương đương so với phương pháp vi sinh. Nhìn P. aeruginosa cùng mẫu dò Tagman, kết quả cho thấy có thể chung, các thử nghiệm định tính không cần phải xác định phát hiện đồng thời cả hai chủng ở trên DNA với giới hạn tính tương đương của các đơn vị đo lường, chỉ cần xác định phát hiện là 50 bản của DNA/µl, tương ứng với giới hạn phát tính tương đương của kết quả [15]. Kết quả so sánh hiệu quả https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn| 61
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024 của phương pháp multiplex RT-qPCR phát hiện S. aureus và https://orcid.org/0009-0003-1565-6993 P. aeruginosa cho thấy phương pháp có hiệu quả phát hiện Trịnh Túy An tương đương với phương pháp vi sinh, trên 30 mẫu giả https://orcid.org/0000-0001-7439-6245 định thử nghiệm. Phương pháp multiplex RT-qPCR đạt Trần Quang Ngọc Dũng được giới hạn phát hiện là đối với 2 vi khuẩn thử nghiệm https://orcid.org/0009-0008-7833-7259 sau thời gian tăng sinh từ 16-24 giờ, và đạt được độ đặc hiệu cũng như độ nhạy của phương pháp là 100%. Thời Lê Văn Thanh gian để phát hiện đồng thời 2 chủng vi khuẩn bằng https://orcid.org/0009-0003-9980-1720 multiplex RT-qPCR là khoảng 27 giờ (gồm cả thời gian Đóng góp của các tác giả tăng sinh 24 giờ) là nhanh hơn so với phương pháp vi sinh Ý tưởng nghiên cứu: Vũ Thanh Thảo tốn thởi gian từ 3-5 ngày để xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong mẫu thử. Đề cương và phương pháp nghiên cứu: Vũ Thanh Thảo. Thu thập dữ liệu: Trần Quang Ngọc Dũng. 5. KẾT LUẬN Giám sát nghiên cứu: Vũ Thanh Thảo. Nhập dữ liệu: Trần Quang Ngọc Dũng. Phương pháp multiplex RT-q-PCR phát hiện đồng thời S. aureus và P. aeruginosa với nồng độ mồi 400 nM và đoạn Quản lý dữ liệu: Trịnh Túy An. dò 200 nM đạt độ đặc hiệu, độ tuyến tính và độ chính xác Phân tích dữ liệu: Lê Văn Thanh, Vũ Thanh Thảo. với giới hạn phát hiện là 1,52.103 tế bào/ml với S. aureus và Viết bản thảo đầu tiên: Trần Quang Ngọc Dũng, Vũ 2,42.103 tế bào/ml với P. aeruginosa. Kết quả so sánh hiệu Thanh Thảo. quả của phương pháp RT-qPCR cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện S. aureus và P. aeruginosa tương đương Góp ý bản thảo và đồng ý cho đăng bài: Vũ Thanh Thảo. với phương pháp vi sinh với thời gian tồng thời gian thực Cung cấp dữ liệu và thông tin nghiên cứu hiện khoảng 27 giờ. Các kết quả đạt được cho thấy tiềm Tác giả liên hệ sẽ cung cấp dữ liệu nếu có yêu cầu từ Ban năng ứng dụng của kỹ thuật RT-qPCR để kiểm tra chỉ tiêu biên tập. S. aureus và P. aeruginosa về giới hạn nhiễm vi sinh vật trong mẫu mỹ phẩm. Chấp thuận của Hội đồng Đạo đức Lời cảm ơn Nghiên cứu này miễn trừ Hội đồng Đạo đức. Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ TP.HCM đã hỗ trợ kinh phí thực TÀI LIỆU THAM KHẢO hiện đề tài 19/2023/HĐ-QKHCN ngày 17/03/2023. Nguồn tài trợ 1. Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh - Bộ Y Tế. TCVN 13634:2023. Tiêu chuẩn quốc gia về Mỹ Nghiên cứu nhận kinh phí từ Quỹ Phát triển khoa học và phẩm - Vi sinh vật - Giới hạn vi sinh vật. 2023. công nghệ TP.HCM theo hợp đồng số 19/2023/HĐ- QKHCN ngày 17/03/2023. 2. Bộ Y tế. Phụ lục 13.6. Thử giới hạn nhiễm khuẩn. Dược điển Việt Nam V. Hà Nội: Y Học; 2018; PL300-PL311. Xung đột lợi ích Không có xung đột lợi ích nào liên quan đến nghiên cứu này. 3. Hawkins SFC, Guest PC. Multiplex analyses using real-time quantitative PCR. Methods in Molecular ORCID Biology. 2017;1546:125-133. Doi: 10.1007/978-1- Vũ Thanh Thảo 4939-6730-8_8. https://orcid.org/0009-0006-9322-8355 4. Lim HJ, Kang ER, Park MY, Kim BK, Kim MJ, Jung S, Lê Văn Hoài Trân et al. Development of a multiplex Real-time PCR assay 62 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024 for the simultaneous detection of four bacterial pathogens specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. causing pneumonia. PLoS One. 2021;16(6):e0253402. 2008;56(1):45-50. Doi: 10.4103/0301-4738.37595. Doi: 10.1371/journal.pone.0253402. 13. ŠKof A, Poljak M, KrbavČIČ A. Real-time polymerase 5. Dung TTN, Phat VV, Vinh C, Lan NPH, Phuong NLN, chain reaction for detection of Staphylococcus aureus Ngan LTQ, et al. Development and validation of and Pseudomonas aeruginosa in pharmaceutical multiplex real-time PCR for simultaneous detection of products for topical use. Journal of Rapid Methods & six bacterial pathogens causing lower respiratory tract Automation in Microbiology. 2004/10/01 infections and antimicrobial resistance genes. BMC 2004;12(3):169-183. Doi: Infect Dis. 2024;24(1):164. Doi:10.1186/s12879-024- https://doi.org/10.1111/j.1745-4581.2004.tb00061.x. 09028-2. 14. Lin T, Lin L, Zeng P. Development of a duplex real- 6. Trịnh Túy An, Lưu Quốc Khánh, Lê Văn Hoài Trân, Tiệp time PCR method for the pharmaceutical rapid NK, Vũ Thanh Thảo. Nghiên cứu kỹ thuật real-time PCR microbial detection of Staphylococcus aureus and để kiểm tra chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí trong giới Pseudomonas aeruginosa. Journal of Biosciences and hạn nhiễm khuẩn của dược phẩm. Y Học Việt Nam. Medicines. 2014;2:12-19. Doi:10.4236/jbm.2014.25002. 2024;539-6(2):212-217. 15. USP 43-NF38. 1223. Validation of alternative 7. Alvarez LP, Barbagelata MS, Gordiola M, Cheung AL, microbiological methods. Rockville: USP; 2020. Sordelli DO, Buzzola FR. Salicylic acid diminishes p.8144-8157. Staphylococcus aureus capsular polysaccharide type 5 expression. Infect Immun. 2010;78(3):1339-44. Doi:10.1128/IAI.00245-09. 8. Savli H, Karadenizli A, Kolayli F, Gundes S, Ozbek U, Vahaboglu H. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. J Med Microbiol. 2003;52(Pt 5):403-408. Doi:10.1099/jmm.0.05132-0. 9. Green MR, Sambrook J. Optimizing primer and probe concentrations for use in real-time polymerase chain reaction (PCR) assays. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(10). Doi:10.1101/pdb.prot095018. 10. Broeders S, Huber I, Grohmann L, Berben G, Taverniers I, Mazzara M, et al. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends in Food Science & Technology. 2014;37(2):115-126. Doi: 10.1016/j.tifs.2014.03.008. 11. Kralik P, Ricchi M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 2017;8:108. Doi: 10.3389/fmicb.2017.00108. 12. Parikh R, Mathai A, Parikh S, Chandra Sekhar G, Thomas R. Understanding and using sensitivity, https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.07 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn| 63