Nghiên cứu kỹ thuật nhuộm BAND G để lập karyotype trong chẩn đoán các bệnh rối loạn nhiễm sắc thể

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 15, 2003<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHUỘM BAND G ĐỂ LẬP KARYOTYPE <br /> TRONG CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ<br />  Hà Thị Minh Thi<br /> Đoàn Thị Duyên Anh, Nguyễn Viết Nhân<br /> Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế<br /> <br /> <br /> <br /> 1. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bất thường nhiễm sắc thể  (NST) là một trong những nguyên nhân quan trọng <br /> gây ra các bệnh lý di truyền, được gặp với tỷ  lệ 1/150 trẻ sinh sống và trongû 50% <br /> trường hợp sẩy thai ngẫu nhiên ở ba tháng đầu thai kỳ [6].<br /> Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm  <br /> sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST [2]. Kết quả không những  <br /> phục vụ  việc chẩn đoán xác định mà còn có ý nghĩa quyết định trongû công tác tư <br /> vấn di truyền.<br /> Từ  năm 1970, người ta đã không công nhận những Karyotype được lập với kỹ <br /> thuật nhuộm Giemsa thường (không có band) vì với kỹ  thuật nhuộm này khó nhận  <br /> dạng chính xác từng NST cũng như không thể phát hiện được những bất thường cấu  <br /> trúc kiểu đảo đoạn, nhân đôi đoạn,...[6]. Từ  đó đến nay, tất cả  các karyotype thông <br /> thường được lập tại các phòng xét nghiệm di truyền trên thế giới chỉ sử dụng các kỹ <br /> thuật nhuộm band, trong đó thông dụng nhất là kỹ thuật nhuộm band G.<br /> Để   việc  nhuộm  band  G   đạt   được  kết   quả  tối   ưu  làm  cơ   sở   cho  việc   lập <br /> karyotype, cần phải hoàn thiện hai bước quan trọng đó là (1) làm được tiêu bản với  <br /> các cụm NST phân tán tốt, không bị  biến dạng (sau khi đã nuôi cấy mẫu); (2) xử lý <br /> tiêu bản và nhuộm đúng kỹ thuật với kết quả các band trên NST đạt tiêu chuẩn.<br /> Việc lập karyotype có thể  tiến hành đối với các mẫu nghiệm như  tế  bào máu  <br /> ngoại vi (tế bào lympho), tế bào nước ối, tủy xương, tế bào da... nhưng tế  bào máu  <br /> ngoại vi được sử  dụng nhiều nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn nuôi cấy tế  bào máu  <br /> ngoại vi để nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhuộm band G các cụm NST.<br /> Tuy nhiên, việc nhuộm NST bằng kỹ  thuật nhuộm band đòi hỏi phải có hoá  <br /> chất đặc biệt, thao tác kỹ thuật tinh tế cũng như điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ <br /> ẩm) thích hợp cho việc làm tiêu bản [1]. Vì vậy, hiện nay một số phòng xét nghiệm <br /> di   truyền   trong   toàn   quốc   vẫn   phải   lập   karyotype   với   kỹ   thuật   nhuộm   Giemsa  <br /> thường.<br /> 129<br />  Để  phục vụ  nhu cầu chẩn  đoán và tư  vấn di truyền tại  địa phương, nhóm <br /> nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu sau:<br />  Cải tiến và hoàn thiện việc làm tiêu bản NST tế bào máu ngoại vi.<br />  Cải tiến và hoàn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể  bằng kỹ thuật nhuộm  <br /> band G.<br /> <br /> 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu:<br />  Chúng tôi nghiên cứu lập Karyotype tế bào máu ngoại vi người. <br /> Các mẫu máu được nghiên cứu lấy từ  những người bình thường tình nguyện <br /> cũng như  những bệnh nhân với lâm sàng có chỉ  định lập Karyotype được giới thiệu  <br /> từ khoa Nhi và Khoa Sản Bệnh viện Trung ương Huế.<br />  Nghiên cứu thiết kế tủ làm tiêu bản, giá gác tiêu bản khi nhuộm.<br />  Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhỏ tiêu bản nhằm tăng chất lượng tiêu bản<br />  Nghiên cứu hoàn thiện các bước làm già, xử lý và nhuộm tiêu bản<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu:<br /> Tất cả  các nghiên cứu cải tiến cũng như  hoàn thiện quy trình làm tiêu bản và <br /> nhuộm band G của chúng tôi đều dựa trên những tiêu chuẩn kỹ  thuật của Hội kỹ <br /> thuật Di truyền thế giới (AGT). Đối với mỗi bước kỹ thuật đều có nhiều cách làm  <br /> khác nhau tuỳ  theo từng phòng xét nghiệm. Vì vậy, đối với mỗi mẫu nuôi cấy thu  <br /> hoạch từ mỗi người được nghiên cứu, chúng tôi chia nhiều lô để thử nghiệm.<br /> Tế   bào   máu   ngoại   vi   sau   khi   được   nuôi   cấy   bằng   môi   trường   F10   và <br /> phytohemagglutinin trong 3 ngày sẽ được thu hoạch với colcemide, sốc nhược trương <br /> bằng  dung  dịch  KCl  và   sodium   citrate,   cố   định   trong  Carnoy  (3  methanol:  1  acid <br /> acetic). Sau đó tiến hành các bước làm tiêu bản và nhuộm như sau:<br /> 2.2.1. Làm tiêu bản:<br /> Chúng tôi nghiên cứu để tiêu bản đạt chất lượng chuẩn là: các NST phân tán <br /> tốt, tối đa chỉ  3 NST có biểu hiện chồng chéo và không có NST bị  biến dạng hoặc <br /> đứt gãy.<br /> Để đạt được kết quả này, quá trình làm tiêu bản phải được thực hiện với các <br /> điều kiện sau:<br /> Điều kiện nhiệt độ, độ   ẩm khu vực nhỏ  tiêu bản thích hợp nhằm giúp tiêu  <br /> bản khô trong khoảng thời gian 30­45 giây : Hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền <br /> tế bào trên thế giới đều sử dụng Thermotron để ổn định nhiệt độ, độ ẩm. Trong điều  <br /> kiện độ ẩm Thừa Thiên Huế cao (80­90%), lại không có Thermotron, chúng tôi thiết  <br /> kế một tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm thông thường với một tủ kính có <br /> cửa sổ. <br /> Lam kính được chuẩn bị tốt : chúng tôi sử dụng các loại lam ướt như sau: <br />  Lam ngâm trong nước 10­20 C<br /> o<br /> <br />  Lam ngâm trong nước 50­60 C<br /> o<br /> <br />  Lam ngâm nước 30­40 C <br /> o<br /> <br /> Sau khi nhỏ, lượng nước trên tiêu bản được làm ráo bằng giấy Kimwipes.<br /> 130<br />  Tư  thế  lam kính khi nhỏ  dịch treo tế  bào phù hợp : chúng tôi lần lượt thử <br /> nghiệm với các tư thế như sau:<br />  Lam kính được đặt nằm ngang<br />  Lam kính được đặt nằm nghiêng 20­30 .<br /> o<br /> <br /> 2.2.2. Làm già tiêu bản:<br /> Có các cách như sau:<br />  Để ở nhiệt độ phòng trong 3­4 ngày<br />  Để  trong tủ sấy 90­95 C, trong 20 phút<br /> o<br /> <br />  Để trong tủ sấy 60 C, trong 12­24 giờ<br /> o<br /> <br /> 2.2.3. Xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025%:<br /> Tác dụng của trypsin lên NST nhằm tạo band khi nhuộm phụ  thuộc vào thời  <br /> gian tiếp xúc với tiêu bản, độ pH của trypsin. Chúng tôi chỉnh pH = 8 bằng Na 2HPO4. <br /> Thời gian ngâm tiêu bản trong trypsin được thử nghiệm ở 10, 15, 20 giây.<br /> Sau khi ngâm trypsin, tiêu bản được rửa 2 lần trong dịch muối đẳng trương.<br /> 2.2.4. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright:<br />  Sử dụng thuốc nhuộm Wright mẹ pha với dung dịch đệm Gurr tỷ lệ 1: 4<br />  Thời gian nhuộm là 3 phút<br />  Vì thuốc nhuộm Wright rất dễ kết tủa nên thay vì ngâm nhiều tiêu bản trong  <br /> cốc nhuộm, chúng tôi cải tiến bằng cách tạo 1 giá nhuộm  ở  la­va­bô. Trên giá này <br /> chúng tôi gác các tiêu bản đã xử lý trypsin và đổ thuốc nhuộm sử dụng lên mỗi tiêu  <br /> bản. Tiêu bản được rửa và làm khô bằng không khí ép.<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ<br /> 3.1. Thiết bị tự thiết kế:<br /> 3.1.1. Tủ làm tiêu bản:<br /> Chúng tôi đã thiết kế  thành công tủ  làm tiêu bản bằng cách nối máy hút  ẩm  <br /> với một tủ kính có 2 cửa sổ.<br /> Sau khi bật máy hút  ẩm 30­60 phút, độ   ẩm trong tủ  còn khoảng 50­60%. <br /> Người kỹ thuật viên dễ dàng luồn tay qua cửa sổ để thao tác việc làm tiêu bản.<br /> 3.1.2. Giá gác tiêu bản để nhuộm:<br /> Chúng tôi đã thiết kế một giá để gác các tiêu bản khi nhuộm ngay tại la­va­bô. <br /> Để nhuộm 1 tiêu bản, chỉ cần trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi <br /> phủ lên tiêu bản đã gác trên giá. Sau 3 phút, rửa ngay tiêu bản tại la­va­bô.  <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 131<br />  3.2. Chất lượng tiêu bản:<br /> Bảng 1: Chất lượng tiêu bản theo tư thế và điều kiện nhiệt độ<br /> của lam kính khi nhỏ tiêu bản<br /> Nhiệt độ   Thời gian  <br /> Lam kính nằm ngang Lam kính nghiêng  20­30oC<br /> nước ngâm   khô<br /> lam kính<br /> Có hiện tượng 2 cụm NST  Hiện tượng 2 hoặc nhiều <br /> o<br /> 10­20 C > 60 giây trộn   lẫn   nhau;   hoặc   các  cụm NST trộn lẫn nhau rất <br /> cụm không phân tán nhiều.<br /> Cụm   NST   có   phân   tán <br /> 30­40oC 30­50 giây nhưng   số   NST   có   sự  Cụm NST phân tán tốt<br /> chồng chéo nhiều (> 3)<br /> 50­60oC