Nghiên cứu lên men Lactobacillus Acidophilus để sản xuất Magnesi lactat

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được tiến hành nhắm mục đích lựa chọn pH thích hợp và phương thức bổ sung MgC03 trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophillus đề điều chế Magnesi lactat, đồng thời kiểm tra tiêu chuẩn, định tính, định lượng sản phẩm Magnesì lactat tạo thành.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu lên men Lactobacillus Acidophilus để sản xuất Magnesi lactat

trị thấp hơn rất nhiều so với liều độc nên dược liệu thư, Đề tài cấp Bộ GD&ĐT. được xem là khá an toàn trong các nghiên cứu tiểp 2. Viện đừợc iiệu (2006), Phương phấp nghiên cứu íheo và trong triển vọng phát triền thành thuốc. tâc dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, NXB Khoa KẾT LUẠN học va kỹ thuật, ír 171 -183, tr 279-292. Cao chiết các phân đoạn cửa cây Mán đỉa 3. Burdon R. H, (1993,), Carcinogenesis and Free (Archidendron clypearía, họ Mimosaceae) đã được Radicals, In Free Radicals: from basis science to nohiên cứu tài'- riụng r.hống nỵv hrtg ị n ụ ị t m Kốt nnả medicine, molecular and cs!! biology updates, Basel, cao chiết phân đoạn ethyi acetat thể hiện hoạt tính pp.187-193. mạnh nhất với các giá trị ED50 là 0,63 Mg/ml. Từ phân 4. Collins A. R. (2005), “Assays for oxidatives đoạn ethyl aceíat đa chiết xuat phân lập, xác định cấu stress an antioxidant status: application research into trúc ổược 6 hợp chất tinh khiết bao gồm Daucosterol, the biological effectiveness of polyphenol”, Am J Clin Methyl galiate, Quercetin-3-O-a-rhamnopyranosid, 7- Nutr, 81, pp.261-267. _ O-Gailoytricetiflavan, 1-octacosanol và acid 5. Gupta R. Sbarma M., Lakshmy R., Prabhaharan docosenoic. Methyl galỉate, Quercetin-3-O-a- D., Reddy K. s. (2009), Improved method of total rhamnopyranosid, 7-0-Galloyíricetiflavan có íác dụng antioxidant assay”, Indian J. Biochem. Biophys., 46, chống oxy hóa trên thử nghiệm in vitro, trong đó 7-0- pp.126-129. Galloytricetiflavan thể hiện tác dụng mạnh nhất với 6. Haimin c., Xiaojun Y., Peng Z-, Jing L. (2006), ED50- 1,02 pg/ml. Cao chiết eíhyl aceíat ơ liều 500 và "Antioxidant activity and hepatoprotective potential of 1000 mg/kg/ngày íhề hiện rõ tác dụng bảo vệ gan và ở agaro-oiigosaccharides invitro and invivo", Nutrition íiều 2000 mg/kg/ngày có tác dụng bảo vệ gan tương Journal, 5(31). đương với Silymarin. 7. Zacurazi Facurazi s., Hairuszah I., Nanthini u. TAI LIỆU THAM KHẢO (2008), "Moringa oleifera Lam prevents acetaminophen 1. Nguỳễn Thị Hoài (2012-2013), Nghiên cứu cấc induced liver through restoration of glutathione level”, cây thuốc của đồng bào Pako Vân Kiều ở Miền Trung Food Chem Toxicol, 46(8), pp.2611-2615. theo hướng tác dụng chống oxy hóa, diệt tế bào ung NGHIÊN c ứ u LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐẺ SẢN XUÁT MAGNESI LACTAT Ths. Nguyễn Minh Ngọc (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương) Ts. Nguyễn Thị Hường (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương) Ts. Đàm Thanh Xuân (Trường Đại học Dược Hà Nội) ĐẶT VẮN ĐỀ học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Magnesi là một nguyên tố đa lượng vai trò thiết yếu máy đo phổ khối lượng (MS) LCMS - 2010EV trong cơ thể, thiếu Magnesi có thể dẫn đến những thay (Shimadzu) tại phòng Thí nghiệm Hoá vậí liệu - Khoa đổi sinh hóa và triệu chứng nghiêm trọng, liên quan Hoá học - Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN. ‘ đến các bệnh như bệnh tim mạch, loãng xương và 2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu bệnh hen suyễn. Các dạng Magnesi vồ cơ có sinh khả Magnesi lactat. dụng thấp hơn các đạng muối Magnesi hữu cơ trong Nuôi cấy Lactobacillus acidophillusở 37°c trong đó có Magnesi íactai Magnesi íactat còn được sư đều kiện vi hiếu khí trong 100ml môi trường MRS có dụng làm nguyên liệu sản xuất Caici lacỉat, axit lactic, bồ sung sữa bộí[6], MgC03. Sau 96h, đun cách thủy nhựa sinh học polylactic... Sản xuất Magnesi lactat dịch lên men írong 20 phút. Ly tâm 4.000 vòng/phút bằng cách lền men các vi khuẩn lactic íừ nguồn trong vòng 15 phút, lọc nóng, ỉhu dịch. Cô cách íhủy nguyên liệu hỵdratcarbon và bổ sung MgC03vào môi còn 30% thể tích. Để kết tỉnh lạnh 4 - 10°c, 12h trong trường nuôi cay đang íà hướng nghiên cứu được quan tủ iạnh. Thu tinh thể, rửa 2 lần bằng nước cất đã đe tâm [1J. Nghiên cứu này được tiến hành nhắm mục lạnh. Dịch rửa được cô tiếp đến còn 30% thể tích, để đích lựa chọnpH thích hợp và phương thức bổ sung kết tinh lạnh qua đêm ở 5 c . sấy tinh thể thu được ở MgC03trong quá trình niioi cấy vi khuân Lactobacillus nhiệt độ 40°c trong 24h thu được sản phẩm thô. Hàm acidophillus đề điều chế Magnesi lactat, đồng thời lượng Magnesi lactat trong sản phẩm thô (q) được xác kiểm tra tiêu chuẩn, định tínhT định iuợng sản phẩm định theophương pháp complexon [2].TÍnh hiệii suất Magnesì lactat tạo thành. tạo sản phẩm Magnesi lactat theo công íhức: ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu m .q.n00-h).i80.lQ 0% 1. Đối tứợng nghiên cứu (a-b).238,45 Chùng Lactobacillus acidophillus ATCC 4356 Môi trường MRS có bổ sung sữa bột, MgC03, Trong đó: Magnesi lactat nguyên liệu và một số hóa chat đạt tiêu H: hiệu suất (%), chùẳn phân tích. m: số gam Magnesi lactat thô Thiềt bị đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hường từ hạt tronglOO ml dịch !ên men. nhân1H-NMR Bruker AV500 (Phòng NMR Viện Hóa q: hàm lượng Magnesi lactat (%)
a: nồng độ glucose ban đầu (%) sinh vật íỷ lệ thuận với mật độ quang ODeoo trong một b: nồng độ glucose khi kết thúc lên men (%) khoảng độ pha loãng vi sinh vật phù hợ pm nên có thể h: hàm ẩm Magnesi lactat (%) sơ bộ kết luận rằna vi sinh vật phát trien tốt íại các 3. Phương pháp tinh chế, xác định cấu trúc khoảng pH từ 5,5 đen 8,0 trong đó ODeoo đạt giá trị cao Magnesỉ lacỉaỉ nhất ỉại pH = 6,0. Vì vậy giá ỉrị pH = 6,0 được iựa chọn * Hòa tan Magnesi lacỉat thô trong nước cấí (tỷ lệ cho các thí nghiệm tiếp theo. 1:6) cho tan hết, thêm ỉhan hoạt, đun tiếp 15 phút, lọc 2. Lựa chọn cách bổ sung Magnesicarbonat ỉhu dịch. Để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lọc vào môi trường nuôỉ cấy L. acidophiilus íhu tinh thể, sấy ở nhiệt đọ 40ỏc đến khối lượng không Nuôi cấy L acidophillusATCỔ 4356 trong môi đồi. Định tính Magnesi lacíat theo phương pháp SKLM trường MRS có 2,6% sữa bộỉ, bồ sung MgC03vào môi theo DĐVN IV [2]. trường nuôi cấy Lacidophillus theo hai phương pháp: » Cấu trúc cua sản phẩm Magnesỉ iacíat sinh tổng 1) Thêm MaC03 vào môi trường nuôi cấy ngay thời hợp được xác định bằng các phương pháp phổ: Pho điểm ban đau; 2) Bổ sung dần M gC03 đề duy tri pH hòng ngoại (IR), phổ khối lượng phân ỉử (ESl-MS), 6,0 vào các thời điểm sau mỗi 24h. Lượng M gC03 phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).Phổ IR thêm MgC03 vào môi trường nuôi cấy ngay thời điểm được ghi ỉrên máy Shimadzu trong vùng 4000 - 400 ban đầu là 2,0g - tương đương với tồng lượng MgC03 cm'1. Phồ MS được ghi ỉheo phương pháp ESI (ỉon bổ sung dần. Sau thời gian 96h thu sản phấm Kếì qua âm) trên máy Shimadzu LCMS trong dung môi tính tổng lượng MgCỐ3 sử dụng, hiệu suất tạo sản Methanol. Phổ 1H-NMR được ghi trong D20 trên máy phểm Magnesi lactat thô và hàm lượng Magnesi lactaí Brucker Av - 500 MHz, chất chuẩn ỉeiramethylsilan. trong sản phẩm thô được írinh bày ở bảng 1. 4. Phương pháp kiểm nghiệm Bảng 1. Tổng lượng MgC03 sư dụng, hiệu suất tạo • Sản phẩm đã tinh chế được kiểm tra chất Magnesi lactat và hàm lượng Magnesi lactat trong sẩn lượng íheo chuyên luận Magnesi iactaí trong Dược phạm thô khi thay đổi cách bổ sung MgC03 vào môi điến Anh BP 2010 [3], 5. Phương pháp xác định m ật độ vỉ sinh vật Cách bổ sunq MqCOs theo nguyên tắc đo độ đục ODeoo[7] Thống số Thời ổiêm ban Sau moi 24h Ly tâm 10ml dịch ien men sau 24h (4.000 đầu vòng/phút trong 15 phút), thu sinh khối. Rửa sinh khối Lượng MgC03 sử dụng 2,0±0,2 2,2±0,3 bằng nước muối sinh lý. Thêm nước muối sinh lý vào
tương ứng với cấu trúc ngậm 2 phân tử nước của Kết quả kiểm nghiệm cho thấy sần phẩm đạt tiêu Magrtesí lactat dỉhydrat[3]. chuẩn chất lượng dược điển Anh (BP 2010) [3], Trong 6. Kiềm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat. quá trinh lên men và sau tinh chế hầu như không có Sản phẩm kiểm tra đạt yêu cầu các tiêu chí đã thử các tạp hữu cơ khác như axit lactic, axit acetic, axit theo dược điển Anh BP 2010 (phụ lục 4). formic, ethanol - những sản phẩm phụ của quá trình Dựa vào các kết quả thu được và một số nghiên lên men, điều này chứng tỏ chùng Lactobacillus *1 Iir I 1 í Ầ m III Ằ •« #kU Ắ (\ Am. l U i a a » ! In n ỉiitỉ _ _l _ __________ í / / í *y*v A T z* ' Ao C ỡ Ị£ d . —> _ £ ______ J ** ì . . 1 "« _ 11 * luận sau: phấm chủ yếu ià acid lactic, đã kết hợp với Magnesi BÀN LUẬN carbonat có trong môi trường nuôi cấy để tạo thánh 1. về định tính sản phẩm Magnesi lactat sinh Magnesi lactat. Đă tìm được qui trình lên men và thu tổng hợp sản phẫm íinh khiết đơn giản, dễ thực hiện, có thể áp Khi nuồi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus dụng để sản xuẩt một nguyên liệu giá rẻ dùng trong acidophillus ATCC 4356 trong môi trường MRS có bổ công nghiệq và Y tế. sung MgC03 có íhề thu được Magnesi lactat. Sản 3. về điều kiện lên men sinh tổng hợp Magnesỉ phẩm sau khi tinh chế là tinh thề co màu trắng, hình lactat. kim (ảnh tinh thể - hình 2), kếí quả này phù hợp với Kết quả nghiên cứu pH thích hợp cho quá trình nghiên cứu của J. V. Krrieken(2005) đã công’ bố[5]. rtuồi cấy cho thấy với môi trường MRS có bổ sung Kết quả định tính Magnesi lactat thu được bẵng sắc sữa, tại pH duy tri = 6,0, sau 24h nuôi cấy mật độ vi ký tóp mỏng [2] cho thấy vểí chinh thu được trên sắc sinh vật trong dịch nuôi cấy đạỉ giá trị cao nhất Điều kỷ đồ của dung dịch thử tương ứng về vị trí, màu sắc này phù hợp với các nghiên cứu đã cống bố về sinh lý va giá trị Rf với vết í ìc ký đồ của dung dịch của L acidophilus cho thầy pH 6,0 thích hợp cho quá chuẩn (Rf = 0,67). trinh phát triển vồ sinh tổng hợp acid lactic [4]. Bản chất cùa L. acidophilus là vi khuẩn sinh acid lacỉic nên - khi môi trường nuôi cấy có pH írung tính hoặc hơi kiềm S i i W (pH = 7,0 - 8,5) thỉ acid lactic do vi sinh vật sinh ra sẽ làm giảm dần pH cùa môi trường và ít tác động đến I n khả năng sinh ìrưởng của tế bào. Trường hợp môỉ trường nuôi cấy có pH quá acid (< 5) thì acid lactic sinh sẽ làm pH của môi trường càng acid và tác động bất lợi đến khả năng sinh trưởng của tế bào, lồm giảm mạnh mật độ tế bào. Kết quả so sánh hai phương pháp bổ sung MgC03ngay thời điểm ban đầu và sau mỗi 24h nuồi cấy (duy trì pH 6) cho thắy phương pháp bổ sung dần Hình 2. Hình ảnh tinh thể Magnesỉ lactat chụp MgC03 cho hỉệusuất thu san phẩm cao hơn, đạt tới qua kính hiện vi quang học 10x 67,9% trong khi hiệusuất thu Magnesi lactat khi bổ 2. về cấu trúc của sản phầm Magnesi lactat sung MgCỐ3 ngay thời điểm ban đầu chì đạt 22,1%. sinh tổng hợp Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã cồng bố Trên phổ hồng ngoại quan sát thấy dải hấp thụ đặc [1], [5]. Tuy MgC03 không tan trong dung dịch nước trưng cua nhóm COO' tại 1610 (C=0), 1184 và nhưng lại tạo pH kiểm. Bổ sung một lượng lớn MgC03 1128cm'1 (C-O). Phổ khối lượng cho pic phân tử m/z vào môi trường nuôi cáy ngay thời điểm ban đầu sẽ ở 200,9 phù hợp với công thức phân tử của Magnesi tạo pH kiềm là điều kiện bất lợi cho vi sinh vật tạo acid lactat C6H10MgO6 (với m = 202). Phổ cộng hường íừ lactic, bổ sung dần M gC03vừa không tạo pH quá hạt nhân proton cho tín hiệu đặc trưng của mảnh kiềm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh acid lactat: tín hiệu Doublet của 3 hydro nhóm -C H 3 iactic của vi khuần, đồng íhời lượng acid lactic sinh ra (0=1,28 ppm), và tín hiệu quartet của 1 hydro nhóm - iàm giảm pH môi trường lại được phản ứng với C.H- (5=4,09 ppm). Hằng số tương tác spin - spin của MgCÕ3 mớibồ sung vào dễ tạo sự ổn định pH trong các hydro này giống nhau (J = 7,0 Hz). quá trình nuôi cấy. KẾT LUẬN Ket quả xác định số phân tử nước trong sản phẩm cho thấy cấu trúc sồn phầm chứa 2 phân tử nước. Nghiên cứu này nhằm mục đích thăm dò khả năng Từ các phân tích trên có thể khắng định sân phầm sinh tổng hợp Magnesi iactat bằng cách nuôi cấy Lactobacillus acidophillus ATCC 4356 trong môi thu được la Magnesi íactat dihydrat co công thức cấu tạo như sau: trường thích hợp có bổ sung MaC03. Đã tiến hành định tính Magnesi íactaí thu được bằng SKLM với hệ HO 0 h 20 số Rf = 0,67 theo phương pháp của Dược điền Việt Nam IV và chứng minh cau trúc sản phầm bằng phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hương từ hạt nhân ' ° M g+0 - 1 proton; Sản phẫm Magnesi iactat tỉnh chế đạt tiêu h 20 ° T ^ oh chuần kiểm nghiệm theo Dược điển Anh - BP 2010. 0 Đã tìm được pH =6,0 là thích hợp để nuôi cầy vỉ khuẩn
và bổ sung dần Magnesi carbonat vào các thời điểm sau mỗi 24h lên men; hiệu suất tạo Magnesi lacíat với Mg£.-D20-lí! môi trường MRS bồ sung 2,6% sữa là 67,9%. TÀI LIỄU THAM KHAO tr ™ 1. P. J. M. Baets (2013), "Process for the ¥ fermentative production of lactic acid from a pianỉ extract the presence of a caustic magnesium salt” WIPO Patent Application, EP2604696 A1 2. Bộ Y Tế (2012), Dược điển việt Nam IV, tr. 375. 3. British Pharmacopoeia Commission (BPC) (2010), Bristish Phaunacopedia, pp. 1325 4. A. M. Eyal, p. R. Gruber, p. McWilliams and D. R. Witkze, (1998), A process for the recovery of lactic acid, PCT Int, Appl, (Cargill incorporated USA). 26 pp. 5. J. V. Krrieken, R. Otto, G. N. Nanninga, J. j . De Vries (2005), "Process for the preparation of lactic acid or lactate from a magnesium lactate comprising medium", United States Patent Office,u s 7705180 B2 Phụ lục 3. Phổ cộng hường từ hat nhân proton 6. Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh, Lê Thị Thu sản phầm Hiền (2012) Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuần L acidophilus cố .định trên chất mang alginaỉ trong lên men sản xuất calci iactat. Tạp chí Hóa học, 50 (50A) , cực QUÂN V CỘNG HÒA XÀ.ilộl Cilú NGHĨA VIỆT NAM pp117-121 vẰmMrniiKiBvrtcmvNix')! 7. F. Widdei (2010), "Theory and Measurement of IB-Trán HiMTSng-HS Nội ĐT: 009555071.- 069553105 Bacterial Growth", Grvndpraktikum Mikrobiologie, 4 Sem (BSc), Universitat Bremen, pp. 4-11. PIHẾỤ KIỂM NGHIỆM (Kèi Qktỉlỉrh '«! «‘ifn