Nghiên cứu nấm Neocosmospora vasinfecta Smith gây hại lạc (Arachis hypogaea L) tại Nghệ An

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br /> <br /> NGHIÊN CỨU NẤM Neocosmospora vasinfecta Smith GÂY HẠI LẠC<br /> (Arachis hypogaea L) TẠI NGHỆ AN<br /> Thị Vinh1, Trần Ngọc Lân2<br /> 1<br /> Chi cục Trồng trọt & BVTV Nghệ An<br /> 2<br /> Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Lạc (Arachis hypogaea L) là cây công<br /> nghiệp cho dầu ngắn ngày hàng đầu ở Việt<br /> Nam. Lạc là một trong 10 loại cây trồng<br /> chính, có giá trị kinh tế cao ở Nghệ An, phù<br /> hợp với các vùng đất cát ven biển, đất phù sa<br /> ven sông và đất đồi. Hàng năm tỉnh Nghệ An<br /> gieo trồng khoảng trên 25.000 ha lạc (vụ xuân,<br /> vụ hè thu và vụ đông) với sản lượng khoảng<br /> 48.000 tấn<br /> Việt Nam nói chung và Nghệ An nói<br /> riêng có khí hậu nóng ẩm là điều kiện thuận lợi<br /> cho dịch hại cây trồng phát sinh phát triển, đặc<br /> biệt là các loài nấm bệnh có nguồn gốc từ đất.<br /> Trong những năm gần đây, sự gia tăng về diện<br /> tích trồng lạc và việc áp dụng các biện pháp kỹ<br /> thuật thâm canh đã làm phát sinh ngày càng<br /> nhiều dịch hại nguy hiểm. Gần đây tại Nghệ<br /> An ghi nhận thêm loài nấm bệnh mới gây hại<br /> trên lạc với các triệu chứng đặc trưng là thân<br /> và gốc rễ có màu đen thối. Cấy lên môi trường<br /> PDA nấm hình thành nhiều quả thể màu cam.<br /> Cùng thời điểm đó nấm bệnh cũng được tìm<br /> thấy ở Thừa Thiên Huế, quả thể nấm hình<br /> thành ngay trên vết bệnh ở ngoài đồng ruộng.<br /> Mẫu nấm thuần ở Nghệ An đã được gửi đến<br /> Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)<br /> và đã được xác định có tên khoa học là<br /> Neocosmospora vasinfecta Smith (Dau.T.V et<br /> al 2010).<br /> Năm 2007, loài nấm này xuất hiện gây<br /> bệnh với tỷ lệ cao trên cây lạc, đậu tương, đậu<br /> xanh ở nhiều vùng của một số nước trong khu<br /> vực châu Á, như là một loài nấm bệnh mới có<br /> nguy cơ gây dịch hại nghiêm trọng cho cây trồng<br /> cạn, nhất là cây lạc (Fuhlbohm M.F et al., 2007).<br /> Để giảm thiểu tác hại của nấm bệnh và<br /> nâng cao năng suất lạc, cần phải có những<br /> nghiên cứu cụ thể nhằm xác định đâu là<br /> nguyên nhân chính gây thiệt hại đến năng suất,<br /> trên cơ sở nghiên cứu tìm ra biện pháp phòng<br /> trừ hữu hiệu để nâng cao năng suất lạc, góp<br /> <br /> một phần vào việc đẩy mạnh sản xuất lạc ở<br /> Nghệ An và Việt Nam.<br /> Bài báo này trình bày kết quả về đặc<br /> điểm sinh học của nấm, quá trình phân lập mẫu<br /> bệnh, lây bệnh nhân tạo và tái phân lập lại tác<br /> nhân lây nhiễm ban đầu tại Nghệ An.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> Mẫu bệnh được thu thập tại các ruộng lạc<br /> thuộc huyện Nghi Lộc, Diễn Châu thời kỳ phân<br /> cành, ra hoa.<br /> * Các vật liệu nghiên cứu trong phòng:<br /> - Môi trường nuôi cấy: + Môi trường<br /> PDA: Khoai tây (250g), Đường Glucose (20g),<br /> Agar (20g), Nước cất (1.000ml).<br /> + Môi trường CLA: Agar (20gr), Lá cẩm<br /> chướng sấy khô, cắt nhỏ (2x2cm), Nước cất<br /> (1.000ml)<br /> + Môi trường WA có kháng sinh: Agar<br /> (20gr), Nước cất (1000ml), Steptomycin sulfate<br /> (1.0g/L) và Neomycin sulfate (0,12g/L).<br /> - Các trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy<br /> dụng cụ, buồng cấy, nồi hấp khử trùng, kính<br /> hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, dụng cụ<br /> nuôi cấy nấm.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Phương pháp xác định tác nhân gây<br /> bệnh được tiến hành theo phương pháp<br /> Koch's Postulates: theo 4 bước<br /> Bước 1. Mô tả triệu chứng và nhận dạng<br /> chi tiết. Ví dụ: Triệu chứng héo vàng, thối thân,<br /> rễ, còi cọc...<br /> Bước 2. Phân lập tác nhân gây bệnh và<br /> thông qua đó mô tả và giám định.<br /> Bước 3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây<br /> bệnh lên cây khỏe, quan sát triệu chứng bệnh<br /> biểu hiện so với mô tả ban đầu.<br /> <br /> 935<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Bước 4. Tái phân lập tác nhân lây nhiễm<br /> ban đầu.<br /> 2.2.2. Phương pháp phân lập mẫu bệnh<br /> - Phương pháp phân lập dựa theo Burgess<br /> và cộng sự. (2009): Đoạn thân được cắt ra từ<br /> thân cây bệnh bao gồm có cả phần mô bệnh và<br /> mô khỏe, được rửa sạch dưới vòi nước máy, sau<br /> đó rửa sạch bằng nước vô trùng, khử trùng bề<br /> mặt bằng cồn 70% trong 5 giây, rửa sạch lại<br /> bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô<br /> trùng. Một phân miếng mẫu nhỏ được cắt ra từ<br /> đoạn mẫu đã được vô trùng ranh giữa ranh giới<br /> mô bệnh và mô khỏe và cấy lên môi trường WA<br /> có các chất kháng sinh và để ở nhiệt độ phòng.<br /> Tản nấm mọc ra từ đoạn mẫu cấy được cấy<br /> chuyền lên môi trường lá cây hoa cẩm chướng<br /> (CLA), nuôi trong điều kiện phòng (250C)<br /> trước khi làm thuần bằng cách cắt đỉnh sinh<br /> trưởng và cấy lên môi trường PDA.<br /> - Phương pháp cấy đơn bào tử dựa theo<br /> Trần Nguyễn Hà và cộng sự 2005: Bào tử từ ổ<br /> bào tử bằng que cấy nấm, hòa bào tử vào ống<br /> nghiệm chứa 10 mL nước cất vô trùng, lắc đều<br /> tay sau đó đổ dung dịch bào tử vào đĩa môi<br /> trường WA và lắc nhẹ cho dịch tràn đều trên<br /> toàn bộ bề mặt môi trường. Đặt đĩa môi trường<br /> nghiêng khoảng 30-400 cho ráo nước trong<br /> điều kiện tối khoảng 18-20 giờ, quan sát dưới<br /> kính lúp điện để tìm bào tử nảy mầm, dùng que<br /> cấy nấm sắc, dẹt cắt xung quanh bào tử và<br /> chuyển miếng môi trường có bào tử sang môi<br /> trường PDA<br /> 2.2.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo<br /> a) Lây bệnh trực tiếp lên cây ký chủ:<br /> Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo với cây lạc<br /> thời kỳ phân cành dựa trên kỹ thuật lây nhiễm<br /> vào thân được mô tả bởi Đậu Thị Vinh và cộng<br /> sự năm 2008: Cây lạc được trồng trong nhà<br /> lưới. Một mảnh của tản nấm được các định là<br /> Neocosmospora vasinfecta được nuối cấy trên<br /> môi trường PDA sau 7 ngày. Các thân cây<br /> được tạo vết thương, cắt một miếng thạch từ<br /> viền của tản nấm khoảng 5x5mm, áp lên vết<br /> thương đã tạo dọc theo thân cây khoảng 2mm.<br /> Dùng Parafilm quấn chặt miếng thạch với vết<br /> thương. Sử dụng các cây ở ô thí nghiệm khác<br /> làm đối chứng và tiến hành tương tự như tạo<br /> vết thương, dùng miếng thạch từ PDA không<br /> có nấm bệnh áp vào vết thương và quấn chặt<br /> <br /> 936<br /> <br /> Parafilm. Các cây thí nghiệm được chăm sóc<br /> dưới ánh sáng mặt trời, nhiệt độ hàng ngày<br /> trong khoảng 20-280C. Triệu chứng bệnh điển<br /> hình như trên đồng ruộng đã xuất hiện tại điểm<br /> cắt tạo vết thương của các cây thí nghiệm với<br /> Neocosmospora vasinfecta sau 20 ngày trên tất<br /> cả các cây đã lây nhiễm (Hình 2). Các cây làm<br /> đối chứng không xuất hiện triêu chứng bệnh.<br /> Nấm Neocosmospora vasinfecta đã được phân<br /> lập từ cây làm thí nghiệm tại vị trí cách vết<br /> thương 5cm, hoàn thành quy tắc Koch’s.<br /> b) Phương pháp lây bệnh qua đất:<br /> Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo qua đất<br /> cũng được thực hiện dựa trên kỹ thuật lây<br /> nhiễm vào thân được mô tả bởi Đậu Thị Vinh<br /> và cộng sự năm 2008: Hạt kê và vỏ trấu được<br /> ngâm trong nước và để qua đêm trong tủ lạnh,<br /> chắt bỏ phần nước, cho 150ml giá thể vào một<br /> bình thủy tinh dung tích 250ml, cuộn thật chặt<br /> một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để<br /> nút chặt miệng bình. Dùng giấy nhôm phủ lên<br /> miệng bình và hấp khử trùng, sau đó cấy các<br /> miếng thạch có sợi nấm vào giá thể, chú ý để<br /> nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác<br /> này được thực hiện trong buồng cấy. Lắc bình<br /> tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo<br /> nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể.<br /> Nấm nhân nuôi trong bình tam giác khoảng 15<br /> ngày, lấy ra trộn vào đất vào bốn phía của cây.<br /> Thí nghiệm được tiến hành trong nhà lưới<br /> (Hình 2).<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO<br /> LUẬN<br /> 3.1. Triệu chứng bệnh trên đồng ruộng<br /> Đối với nấm Neocosmospora vasinfecta<br /> gây bệnh trên cây lạc, triệu chứng bệnh thường<br /> quan sát rõ nét và điển hình nhất vào thời kỳ<br /> cây lạc ra hoa, phát triển tia quả. Ban đầu gốc<br /> thân có những vết màu nâu sau đó đen dần, cây<br /> héo vàng, bệnh nặng cây sẽ bị thối chết.<br /> Triệu chứng bệnh ở bộ phận dưới mặt<br /> đất: Hệ thống rễ cây phát triển chậm. Ban đầu<br /> các chóp rễ bị biến màu có màu nâu nhạt rồi<br /> chuyển sang màu nâu đen, rễ chính bị thối, vỏ<br /> rễ bị thối tạo thành một lớp hoại tử màu đen.<br /> Bộ rễ bị hư hỏng nặng và không cung cấp đủ<br /> nước, lá cây bị biến vàng và cuối cùng chết<br /> toàn bộ cây. Khi chẻ dọc thân và rễ chính cây<br /> lạc, vết bệnh trong thân hóa màu nân đen, khô<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br /> <br /> ráo, ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ rõ<br /> ràng. Trên lớp hoại tử của vết bệnh và trong<br /> <br /> phần đất xung quanh cây bệnh thỉnh thoảng bắt<br /> gặp quả thể nấm màu đỏ cam.<br /> <br /> 3.2. Đặc điểm hình thái (Đặc điểm sợi nấm, tản nấm, bào tử…)<br /> Bảng 1: Kết quả giám định nấm Neocosmospora vasinfecta gây bệnh thối thân, rễ cây lạc<br /> TT<br /> <br /> Chỉ tiêu<br /> <br /> 1<br /> <br /> Sợi nấm (Hyphea)<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tản nấm (Colony)<br /> Bào tử túi<br /> (Ascospores<br /> Bào tử phân sinh<br /> (Conidia)<br /> Túi bào tử (Asci)<br /> <br /> 3<br /> <br /> Đặc điểm<br /> Sợi nấm mọc thẳng, mọc nhanh trên môi trường PDA, ít phân nhánh, màu<br /> trắng xốp.<br /> Trên môi trường PDA tản nấm có màu trắng nhạt, bông và hình thành<br /> nhiều quả thể<br /> Hình cầu đến elip, thành mỏng, trong suốt.<br /> <br /> Kích thước nhỏ, hình trụ đến hình chữ nhật, elip, trong suốt, được xếp<br /> thành cụm ở đỉnh đầu của cành bào tử phân sinh<br /> 5<br /> Hình trụ, thuôn, mỏng. Bên trong chứa 8 bào tử được sắp xếp riêng lẻ.<br /> Có màu đỏ đến da cam, bên ngoài nhẵn, có hình cầu hơi elip được mọc ra<br /> 6 Quả thể (Perithecia)<br /> từ cành bào tử phân sinh. Bên trong chứa nhiều túi bào tử.<br /> Ghi chú: Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái nấm Neocosmospora vasinfecta Smith của<br /> chúng tôi tương ứng với mô tả của Cannon và Hawksworth (1988).<br /> 4<br /> <br /> b<br /> a<br /> <br /> c<br /> d<br /> Hình 1: Đặc điểm hình thái nấm N. vassinfecta<br /> (a) quả thể<br /> (c) quả thể hình thành trên lá cẩm chướng<br /> <br /> (b) tản nấm<br /> (d) túi bào tử<br /> <br /> 937<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMHội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br /> <br /> 3.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo<br /> Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lây bệnh<br /> nhân tạo cho cây lạc bằng nguồn nấm đã được<br /> phân lập và nhân trên môi trường PDA. Đồng<br /> thời tìm hiểu ảnh hưởng của phương pháp lây<br /> khác nhau đến khả năng nhiễm nấm<br /> Neocosmospora vassinfecta Smith trên cây lạc.<br /> <br /> a<br /> <br /> c<br /> <br /> Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bằng nguồn nấm<br /> Neocosmospora vassinfecta Smith đã phân lập<br /> từ mẫu cây bị nhiễm nặng bệnh thối gốc do<br /> nấm N.vassinfecta theo 2 phương pháp khác<br /> nhau, theo dõi khả năng tiềm dục và biểu hiện<br /> triệu chứng của bệnh sau lây nhiễm.<br /> <br /> b<br /> <br /> d<br /> e<br /> Hình 2: Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm N. vassinfecta<br /> <br /> (a) Tạo vết thương ở thân; (b) Cây bệnh sau lây nhiễm vào thân<br /> (c) Nhân sinh khối nấm; (d) Cây bệnh sau lây nhiễm vào đất<br /> (e) Quả thể nấm hình thành trên cây bệnh<br /> <br /> 938<br /> <br /> 938<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm N. vassinfecta trên cây lạc<br /> TT<br /> <br /> Phương pháp lây<br /> <br /> 1<br /> <br /> Lây nhiễm nguồn<br /> bệnh vào gốc thân<br /> <br /> 2<br /> <br /> Lây nguồn bệnh vào<br /> đất<br /> <br /> 4<br /> <br /> Đối chứng<br /> <br /> Cây TN (P)<br /> P1<br /> P2<br /> P3<br /> P4<br /> P5<br /> P6<br /> P7<br /> P8<br /> P9<br /> P10<br /> P1<br /> P2<br /> P3<br /> P4<br /> P5<br /> P6<br /> P7<br /> P8<br /> P9<br /> P10<br /> 10 cây<br /> <br /> Mức độ nhiễm bệnh<br /> 10 ngày<br /> 15 ngày<br /> 20 ngày<br /> +<br /> +++<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> +++<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> +<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> ++<br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> Ký hiệu: (- ) Không biểu hiện bệnh<br /> (+) Cây ốm yếu, bộ lá biến vàng<br /> (++) Bộ lá vàng úa, gốc thân có màu nâu đen<br /> (+++) Bộ rễ và gốc thối mục, cây chết<br /> <br /> Qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy với<br /> thời gian ủ bệnh từ 15 đến 20 ngày, cây lạc được<br /> lây nhiễm xuất hiện triệu chứng giống ngoài<br /> đồng ruộng. Tuy nhiên số cây thể hiện triệu<br /> chứng ở 2 phương pháp có sự khác nhau, phương<br /> pháp cắt vào thân có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn<br /> (100%) sau 20 ngày lây nhiễm và thời gian tiềm<br /> dục ngắn hơn. Chỉ sau 15 ngày hầu hết các cây<br /> đã có biểu hiện bệnh. Còn sử dụng nguồn nấm<br /> nhân trên hạt kê trộn vào đất cho tỷ lệ nhiễm<br /> bệnh thấp hơn (50%) sau 20 ngày lây nhiễm và<br /> thời gian tiềm dục dài hơn (20 ngày). Sau khi cây<br /> bị nhiễm bệnh do lây bệnh nhân tạo, các mẫu tái<br /> phân lập trở lại, kết quả cũng thu được nguồn<br /> nấm Neocosmospora vasinfecta Smith ban đầu.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> 4.1. Kết luận<br /> - Việc hoàn thành Quy tắc Koch's<br /> Postulates đã khẳng định nấm Neocosmospora<br /> vasinfecta Smith gây bệnh thối thân rễ cây lạc.<br /> <br /> 4.2. Đề nghị<br /> - Tiếp tục nghiên cứu riêng lẻ về quy luật<br /> phát sinh, mức độ gây hại của nấm<br /> Neocosmospora vasinfecta Smith để làm rõ vai<br /> trò của nấm bệnh trong phức hợp bệnh thối<br /> thân rễ cây lạc.<br /> - Cần đi sâu nghiên cứu để xác định phổ<br /> ký chủ của nấm Neocosmospora vasinfecta<br /> Smith tại Việt Nam.<br /> - Đề xuất đưa nấm bệnh Neocosmospora<br /> vasinfecta Smith vào danh mục bệnh hại cây<br /> lạc ở Việt Nam.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Burgess Lester W., Timothy E. Knight, Len<br /> Tesoriero, Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm<br /> nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam.<br /> ACIAR.<br /> <br /> 939<br /> <br />