ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU HƢỜNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM
(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
THÁI NGUYÊN - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU HƢỜNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO
LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến
THÁI NGUYÊN - 2016
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hải Yến. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa từng có ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016
Tác giả luận văn
Nguyễn Thu Hƣờng
ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học
Khoa học Thái Nguyên, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ kỹ thuật
viên Phòng thí nghiệm Sinh học của Khoa Khoa học Sự sống đã tạo điều kiện
về thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập và
làm luận văn thạc sĩ.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn
luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm
luận văn này.
Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong
nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có
được kết quả tốt hơn.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016
Tác giả luận văn
Nguyễn Thu Hƣờng
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Giới thiệu chung về phong lan ................................................................... 3
1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium).......................................................... 4
1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) ............... 7
1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan .............................................. 9
1.2. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 10
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy
mô - tế bào ....................................................................................................... 10
1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính ........... 11
1.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro................................................... 12
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ................................ 13
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium ......................... 14
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................... 16
Chƣơng 2: ................. 18
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 18
.................................................................................... 18
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 18
iv
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 19
2.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy............................................................... 20
2.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy ........... 21
2.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây ..................................................................... 21
2.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 21
2.2.6. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 21
2.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................. 24
2.2.8. Xử lý số liệu .......................................................................................... 24
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 25
3.1. Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy ................................................ 25
3.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan ................................................... 25
3.2. Kết quả tái sinh chồi ................................................................................. 26
3.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím ..................... 26
3.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím ............. 28
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhóm
Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím ............ 29
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến
sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum
Lindl.) .............................................................................................................. 33
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phi
điệp tím ............................................................................................................ 35
3.6. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của
cây lan sau khi ra chai trồng trong bầu ........................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
1. Kết luận ....................................................................................................... 40
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết đủ
ABA Abscisic acid
ADN Acid deoxyribonucleic
APG III Angiosperm Phylogeny Group III
B1 Thiamine
B2 Riboflavin
BAP 6 - Benzyl adenin purine
ĐC Đối chứng
EAC Ehrlich ascites cells
GA3 Gibberellic acid
IAA Indol - 3 - acetic acid
IBA Indol - 3 - butyric acid
Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin
KTST Kích thích sinh trưởng
MS Murashige and Skoog
PM Phytamax
RE Robert Ernst
THT Than hoạt tính
VW Vacin Went
USA United States of America
2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid
α - NAA α - Naphthalene acetic acid
CT Công thức
TG Thời gian
KT Khử trùng
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằng
HgCl2 0,1% ..................................................................................... 25
Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím ........ 27
Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệp
tím sau 50 ngày cấy chuyển ............................................................ 29
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan
Hoàng thảo phi điệp tím .................................................................. 30
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền
đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau
30 ngày ............................................................................................ 34
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Hoàng
thảo phi điệp tím ............................................................................. 36
Bảng 3.7. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát
triển của cây .................................................................................... 38
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím ................................ 9
Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím ............................................. 20
Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MS
chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy ....................................... 26
Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từ
hạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP ................................... 27
Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP .... 29
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi
lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ....................................... 33
Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanh
cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ........................ 35
Hình 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày .... 37
Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng và
phát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày ............... 38
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời
sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp
cho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần
thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng,
màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất khá
phổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu
trên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim
ngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15].
Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho
sự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần
Hợp thì nước ta có 137 - 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lan
đều có vẻ đẹp riêng. Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giống
lan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hương
thơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng. Thế giới lan rừng rất phong
phú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàng
thảo (Dendrobium). Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trị
kinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thì
Dendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệp
mỹ phẩm, y học. Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lại
nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này.
Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạng
cây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiên
vì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều. Ngày nay, với công nghệ nhân
giống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn
định về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triển
nguồn gen của các loài lan Việt Nam. Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào
chi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả.
2
Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân
giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)”
nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phương
pháp in vitro.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobium
anosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý
hiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thực
vật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím
(Dendrobium anosmum Lindl.).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự
nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
auxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium
anosmum Lindl.).
- Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và phát
triển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khi
ra cây trồng trong bầu.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoa
học Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về phong lan
Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa,
thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm (Monocotylendons), phân lớp
hành (Liliidae), họ Lan (Orchidaceae). Họ phong lan đã biết khoảng 850 chi
(APG III, 2009) và có trên 25000 loài chiếm khoảng 10% của các loài thực vật
có hoa (Dressler, 1993) [12]. Bên cạnh đó còn có hơn 30000 loài lan lai. Ngày
nay, dựa vào đặc tính di truyền các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ:
Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae,
Vandoideae. Họ Lan là một họ thực vật lớn và phân bố gần như trên toàn thế
giới (ngoại trừ châu Nam Cực). Danh sách dưới đây liệt kê gần đúng sự phân
bố của họ này [18]
Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi
Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi
Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi
Châu Đại Dương: 50 - 70 chi
Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi
Bắc Mỹ: 20 - 25 chi
Ở Việt Nam có 137-140 chi gồm trên 1000 loài lan rừng, bao gồm cả
địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước, hầu hết đều có
hoa đẹp nên được trồng làm cây cảnh [3].
Dựa theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia ra làm hai nhóm
là nhóm cây đơn thân (monopodial) và nhóm cây đa thân (sympodial). Nhóm
cây đơn thân: lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát
triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa đến vài mét. Ví dụ như chi lan Vanda,
Vanilla... Nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến kích thước
nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát triển thay
thế. Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi là “mắt” cây. Các mắt cây phát triển
4
đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây.
Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các
thân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lan
Cattleya, Dendrobium…[4], [17].
Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trường họ lan được
chia thành 4 nhóm chính:
Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩm
mục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống.
Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờ
đất ở sườn núi, bờ suối hay dưới tán rừng ẩm ướt. Địa lan có nhiều loài với
hình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt.
Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục.
Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá.
1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)
1.1.1.1. Phân loại chi lan Hoàng thảo
Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan
đứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600
loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam
Á. Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú về
dạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ để
tiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt. Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm:
Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ở
gần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium
phalaenopsis…[17]
Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mang
nhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như:
Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum…
Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có
5
mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum…
Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc
màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile…
Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớp
lông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17]
Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan
Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính:
Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ
xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao
nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m.
Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia,
Indonexia…).
Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng
nóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17].
1.1.1.2. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium
Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời
nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt
quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa.
Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể
chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông
lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ.
Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70%. Nếu độ
ẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọc
mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió
nụ sẽ ít đi.
Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh
trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan
gồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không
6
phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại
cảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất. Những loại giá thể thường sử
dụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu...
Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3
lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa
đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông,
đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm
quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [19].
1.1.1.3. Sâu bệnh và các vấn đề khác
Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và
môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện
cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:
Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị là
tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây
vào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt
nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18].
Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinh
mạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có
độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb
3/2000; Benlat 1/2000 [18].
Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra. Bệnh phát triển mạnh
vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc
diệt nấm 5 - 7 ngày/lần [18].
Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra.
Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng
theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô
hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18].
Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh
dưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ
7
nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N,
thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và
thối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh
xuất hiện cần phun nhiều hơn (2 - 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnh
giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18].
Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non,
phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc
Malathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng
Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong
3 tuần [19] .
1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)
1.1.2.1. Phân loại
Có nhiều cách phân loại cho Hoàng thảo phi điệp tím, theo hệ thống
APG III thì lan được phân loại như sau:
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae)
Lớp: Một lá mầm (Monocotylendons)
Bộ: Măng tây (Asparagales)
Họ: Phong lan (Orchidaceae)
Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae)
Chi: Hoàng thảo (Dendrobium)
Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)
Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoa
học công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3].
1.1.2.2. Đặc điểm sinh học
- Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễ
thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối
8
khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây,
ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây
quang hợp.
- Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành.
Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát
triển của giả hành mới. Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy
dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để
tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng nên
cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4].
- Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinh
dưỡng bằng quang hợp. Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có
hình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụng
tạo thành các giả hành.
- Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các
giả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có
hai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm
chính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt. Nhị
gồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc
phấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khối
phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng.
- Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 - 6
đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh
và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấu
tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không
khí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần
mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5].
1.1.2.3. Phân bố
Hoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miền
Nam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương,
9
Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừng
từ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16].
Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím
1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan
1.1.3.1. Các phương pháp nhân giống truyền thống
Nhân giống vô tính
Tách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng
thời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn
và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá
thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc
đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thể
cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [5].
Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành một
cách tự nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra
khỏi giả hành để trồng. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di
truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không
đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi
trồng với quy mô lớn.
10
Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn
trùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ
phấn ấy. Có 2 phương pháp thụ phấn:
Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm
nhụy của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì
cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan.
Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoa
hác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống.
Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày
hôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khác
do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vì
hầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra
thành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanh
lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái.
Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải được
nhiễm một số loại nấm cộng sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấm
giúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như:
Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium;
Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonia
lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3].
Nhân giống in vitro
Ngày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạo
ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời có
chất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.
1.2. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô
- tế bào
Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ
tế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc
các mô phân sinh trong cây[1].
11
Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhân
nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và
nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác
nhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với
việc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài
tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai
trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao
phấn trong ngân hàng gen [1].
Vì vậy, nuôi cấy mô - tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có
các ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào
sản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo
tốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu
cây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch
bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận
chuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận
hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm.
1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính
Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triển
cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phân
chia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phân
sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại
của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô - tế bào như các
đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ...
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhân
giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì
không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt
di truyền.
12
1.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro
Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống
in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng
để đưa vào nuôi cấy in vitro [1], [11].
Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợp
chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy [1], [11].
Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ
số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất
điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin…), các chất bổ sung khác
như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh
sáng thích hợp [1], [11].
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường
ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng
l này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật
quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [1], [11].
Giai đoạn 5: Đưa cây ra giá thể
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài môi trường l
bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả
năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn
chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự
dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con đạt
tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất [1], [11].
13
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
Mô nuôi cấy:
Mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa
thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng
trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ
không thu nhận được kết quả hoặc thu được những cây sẽ không phát triển
mạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở một giai đoạn nhất định.
Điều kiện vô trùng:
Môi trường nuôi cấy mô thực vật có các thành phần thích hợp cho các
loại nấm, vi khuẩn phát triển. Vì vậy, điều kiện tiên quyết là phải đảm bảo
nguyên tắc vô trùng cho mẫu cấy, môi trường cấy và các trang thiết bị liên
quan trong suốt quá trình nuôi cấy, tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển…
cũng phải thực hiện trong điều kiệ 1].
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng:
Nguồn cacbon: Nguồ đường sucrose,
glucose, maltose, galactose. Cung cấp năng lượng cho nuôi cấy đồng thời
đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [1], [10].
Thành phần khoáng: Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg,
Ca… được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l và thường tồn tại dưới các dạng +, NaH2PO4, KNO3, KCl… Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Bo, muối NH4
Zn, Cu, Ni… được cung cấp với hàm lượng nhỏ hơn 30 mg/l [1], [10].
Vitamin: Để cây phát triển được tối ưu ta cần bổ sung từ bên ngoài các
vitamin như: Vitamin B1, B2; myo-inositol; biotin; pantothenic acid…
Nước: Nước là thành phần quan trọ ấy, nó
chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng.
Agar: Hàm lượng agar thường dùng cho môi trường nuôi cấy dao động
từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng.
Than hoạt tính: Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 - 3%. Than hoạ
14
hấp thụ độc tố nâu/đen và các độc tố không màu khác; hấp thụ
các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin…); thúc đẩy sự
tạo phôi soma, ổn định độ pH [1], [10].
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:
Là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò
quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác
động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính
vốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy...
Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chất
có tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng và
nhóm chất ức chế sinh trưởng. Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồm
có 3 nhóm chính đó là: auxin, gibberellin và cytokinin được sử dụng chủ yếu
trong nuôi cấy. Còn các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng gồm có ABA,
etilen, các hợp chất phenol, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các chất
diệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh trưởng, người ta còn bổ sung thêm
các dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và không xác định như: dịch
chiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa, cazein thuỷ phân… nhằm
tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy [10].
Ảnh hƣởng củ ật lí:
Nhiệt độ thông thường trong phòng thí nghiệm nhiệt độ được duy trì
bằng máy điều hoà ở 25 ± 2 C phù hợp với đa số mô cấy; ánh sáng có ảnh
hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao gồm cường
độ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991).
Cường độ ánh sáng trắng từ 1000 - 2500 lux, với chu kỳ 16/24 giờ chiếu sáng
được dùng phổ biến cho nhiều mô nuôi cấy; pH của môi trường nuôi cấy
thường ở khoảng 5,8 - 6 thì tốt trong nuôi cấy mô [10].
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium
Phong lan là một trong những loại cây trồng có nhiều thành công nhất
15
trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Trên thế giới
cũng như tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình về nhân nhanh các giống lan
nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Với việc sử dụng kĩ thuật
nhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc nghề trồng lan ở quy mô lớn.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tháng 8/2010, Maridass M. và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitro
phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiên
cứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệu
thân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo
khử trùng với hyponatri 3% (bổ sung 2 - 3 giọt Tween80 EAC) trong 20 phút
và sau đó rửa sạch cho 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được chẻ ra
cắt miếng nhỏ (5 mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của
MS bổ sung các chất KTST như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thành
protocorm tốt trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM. Sau đó
protocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + BAP 0.5μM [14].
Năm 2011, Sana A. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh
chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách, sử dụng môi
trường có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0
mg/l và kinetin. Qua nghiên cứu các tác giả nhận thấy ở môi trường có chứa
BAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo cây
hoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa IBA 2 mg/l với tỷ lệ phần trăm tạo
rễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với
NAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình
thành rễ kém [15].
Bijaya P. và Deepa T. (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống
Dendrobium primulinum Lindl. đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy các
đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môi
trường MS bổ sung kết hợp các chất NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau,
16
các protocorm hình thành đã tạo chồi và rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng chồi
tăng nhanh nhất trên môi trường MS + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l. Trong
thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi trường MS +
IAA 0,5 mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất. Khi ra cây trên giá thể đất sạch và rêu
(dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [13].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Phong lan Việt Nam có số lượng chi và loài phong phú, dần trở thành
một họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế bậc nhất trong các họ cây rừng.
Việt Nam trong những năm gần đây đã có rất nhiều đề tài nhân giống phong
lan đặc biệt là các cây lan có giá trị như các nghiên cứu:
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng
của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra
một số kết quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi
non, được cắt thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + saccharose 20
g/l + nước dừa 100 ml/l + peptone 1 g/l + BA 1 mg/l + NAA 0,3 mg/l + AC 1
g/l. Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệ
tạo soma là 100% trên các mẫu nuôi cấy. Tế bào soma màu trắng sáng, được
tiến hành nhân sinh khối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu được
tế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môi trường VW + BA 1 mg/l + NAA 0,3
mg/l + nước dừa 100 ml/l [8].
Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi
cấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy
(Dendrobium aduncum). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệu
khởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang. Kết quả cho
thấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS + BA 0,5 mg/l và tái sinh tốt
trên môi trường MS + kinetin 3 mg/l + NAA 0,3 mg/l. Từ protocorm tỷ lệ
chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [9].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo phi điệp tím
17
(Dendrobium anosmum Lindl.), Nguyễn Thị Mỹ Duyên - trường Đại học
An Giang (2010) đã tìm ra môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh
protocorm của hạt là MS + NAA 1,0 mg/l và môi trường MS + BA 1 mg/l
+ NAA 0,2 mg/l. Chồi lan Dendrobium anosmum Lindl. phát triển và nảy
chồi rất tốt trên môi trường MS + BA 2 mg/l. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh:
Chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS +
NAA 1 mg/l [2].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra môi trường thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + saccharose 20 g/l + agar 8
g/l + nước dừa 150 ml/l + BAP 2,0 mg/l. Môi trường nhân nhanh protocorm
tốt nhất là MS + saccharose 20 g/l + agar 8 g/l + nước dừa 150 ml/l + BAP
2,0 mg/l. Môi trường MS + saccharose 20 g/l + agar 8 g/l + nước dừa 150 ml/l
+ BAP 2,0 mg/l + NAA 1,0 mg/l thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường MS + saccharose 20
g/l + agar 8 g/l + nước dừa 150 ml/l + NAA 1,0 mg/l thích hợp nhất cho sự ra
rễ của chồi in vitro [6].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo Long nhãn
(Dendrobium fibriatum), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trường
thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + saccharose 10
g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l. Môi trường nhân nhanh protocorm tốt
nhất là Knud + saccharose 10 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + khoai tây
60 g/l. Môi trường MS + saccharose 20 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l +
chuối chín 60 g/l là thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro. Môi trường tạo
cây hoàn chỉnh là RE + saccharose 10 g/l + THT 1 g/l + agar 6 g/l [7].
18
Chƣơng 2
2.1. Vật liệu
Chúng tôi sử dụng hạt của loài phong lan Hoàng thảo phi điệp tím
(Dendrobium anosmum Lindl.) được người dân khai thác từ rừng thuộc địa
bàn tỉnh Thái Nguyên.
Hạt được bao bọc bởi vỏ quả, quả được thu vào tháng 11,12. Quả còn
xanh hoặc già (chưa tách vỏ) đều sử dụng để cho hạt nuôi cấy in vitro được,
một quả chứa rất nhiều hạt. Do hạt được bảo vệ trong quả nên hạt lan không
chứa nguồn gây nhiễm. Điều này giúp cho khâu vô trùng mẫu đơn giản hơn
và hạt ít chịu tác động trực tiếp của hóa chất diệt trùng. Nên chọn những quả
từ các cây có đặc tính ưu việt mong muốn, chọn quả to khỏe cho nhiều hạt
nhất và vỏ quả phải đảm bảo lành lặn.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
- Dụng cụ dùng trong nuôi cấy chủ yếu gồm:
Bình tam giác 250ml hoặc ống nghiệm;
Cân phân tích;
Máy đo pH, quỳ tím;
Lò vi sóng;
Nồi hấp vô trùng;
Box cấy vô trùng;
Dao, kéo, kẹp, panh, khay cấy, đũa thủy tinh, bông không thấm nước,
giấy lọc, đèn cồn và bật lửa…;
Phòng nuôi cấy, phòng chuẩn bị môi trường.
- Dụng cụ dùng cho ra cây:
Cốc nhựa;
Kéo;
19
Túi bóng nilon;
Ghim;
Giá thể: Vỏ thông, dớn, rêu.
- Hóa chất:
Môi trường nuôi cấy: các thành phần vô cơ và hữu cơ theo môi trường
MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung một số
trưởng như kinetin, BAP, IBA, NAA… và các thành phần than hoạt tính,
agar, nước dừa, khoai tây, chuối xanh.
Hóa chất khử trùng là cồn (C2H5OH) 70%, HgCl2 0,1%.
Dung dịch tưới: ½ MS, nước lã, phân đầu trâu 501.
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học Sự sống -
Trường Đại học Khoa học.
Thời gian: Từ tháng 8/2015 đến tháng 9/2016.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS.
Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy
trong bình tam giác 250 ml. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở độ pH từ 5,8 - 6,0 trước khi được tiệt trùng và được khử trùng ở 121oC, áp suất 1,2 atm trong thời gian 20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC; độ
ẩm: ban ngày khoảng 40 - 60%, ban đêm khoảng 60 - 90%; cường độ ánh
sáng từ 2000 - 3000 lux.
a. Phương pháp thu và xử lý mẫu
Nguyên liệu được chọn từ những cây to khỏe, không bị bệnh. Quả thì
chọn những quả ở độ tuổi không quá già, nhìn chắc (mẩy) cho nhiều hạt, vỏ
quả lành lặn và khi chưa cấy nên bảo quản ở ngăn mát của tủ lạnh hoặc nơi
thoáng mát.
20
Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím
b. Khử trùng mẫu và đưa vào nuôi cấy
Quy trình khử trùng mẫu đối với quả gồm các bước cơ bản sau:
Trước khi khử trùng quả được rửa sạch bằng xà phòng loãng dưới vòi nước chảy hoặc có thể lau sạch bằng cồn 70oC rồi đưa vào box cấy để khử trùng. Mẫu được tráng bằng cồn 70oC trong khoảng thời gian 30 giây
đến 1 phút, sau đó tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Tiếp theo mẫu được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời
gian từ 13 - 15 phút. Trong thời gian xử lí, quả phải được ngập hoàn toàn
trong dung dịch diệt khuẩn và phải lắc nhẹ nhàng cho quả được ngấm đều
dung dịch. Sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Chuyển lên giấy
thấm vô trùng để cho thấm khô hết nước và tách vỏ, rồi gieo hạt lên môi
trường nuôi cấy.
2.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy về thành phần và hàm lượng của các muối
khoáng, các vitamin theo môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Chất
điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy thuộc nhóm cytokinin
(BAP, kinetin) và auxin (NAA); các chất bổ sung, sucrose, nước dừa, agar và
than hoạt tính… pH môi trường từ 5,8 - 6,0.
Môi trường được đổ vào bình tam giác 250 ml khử trùng trong nồi áp
suất với nhiệt độ 121oC, áp suất 1,2 atm.
21
2.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Chuối xanh nghiền: Chuối tiêu xanh rửa sạch, gọt vỏ cho vào luộc
trong khoảng 10 - 15 phút cho chuối chín. Sau đó cho chuối vào nghiền mịn
bằng máy xay. Hàm lượng chuối bổ sung vào môi trường tùy theo yêu cầu
của thí nghiệm. Khi bổ sung chuối xanh vào môi trường nuôi cấy cần khuấy
kĩ tránh vón cục làm môi trường không đều và làm ảnh hưởng tới thí nghiệm.
Khoai tây nghiền: Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ cho vào luộc trong
khoảng 10 - 15 phút cho khoai tây chín. Sau đó cho khoai tây vào nghiền mịn
bằng máy xay. Hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường tùy theo yêu cầu
của thí nghiệm. Khi bổ sung khoai tây vào môi trường nuôi cấy cần khuấy kĩ
tránh vón cục làm môi trường không đều và làm ảnh hưởng tới thí nghiệm.
2.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây
Giá thể ra cây gồm hỗn hợp vỏ thông, dớn, rêu. Đầu tiên dớn được bẻ
nhỏ cho vào ngâm nước cùng vỏ thông để tạo độ ẩm. Sau đó cho hỗn hợp vỏ
thông và dớn vào cốc nhựa đã được đục lỗ, những mảnh vỏ thông to được cho
xuống đáy cốc và dớn được cho lên trên để thích hợp cho cây con, cuối cùng
rêu được làm ẩm và đặt lên trên cùng. Cây con trong bình sau khi đủ tiêu
chuẩn sẽ bắt đầu tiến hành ra cây, cây con được đặt vào cốc nhựa rồi cho vào
túi bóng nilon và kẹp lại bằng ghim.
2.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng
Nhiệt độ 16/24 giờ chiếu sáng. 25 - 28oC
Độ ẩm 50 - 60 %
Cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux
2.2.6. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và
hoàn toàn ngẫu nhiên.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng chất điều hòa sinh
trưởng đến khả năng tạo protocorm từ hạt. Thí nghiệm tiến hành trên 3 công
22
thức, mỗi công thức cấy 3 bình. Các công thức thí nghiệm:
CT1: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 1,0 mg/l
CT2: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 1,5 mg/l
CT3: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 2,0 mg/l
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất điều hoà
sinh trưởng đến khả năng nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp
tím. Nồng độ BAP thay đổi 1,0; 1,5; 2,0 mg/l.
CT1: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 1,0 mg/l
CT2: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 1,5 mg/l
CT3: MS + sucrose 20g/l + NAA 0,2mg/l + thạch 10g/l + THT 1g/l +
BAP 2,0 mg/l
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin (BAP,
kinetin) đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím.
Thí nghiệm tiến hành trên 7 công thức, mỗi công thức cấy 3 bình, 5
cụm chồi/bình, thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Các công thức thí nghiệm:
ĐC: MS + sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + THT 1 g/l
CT1: ĐC + BAP 0,5 mg/l
CT2: ĐC + BAP 1,0 mg/l
CT3: ĐC + BAP 1,5 mg/l
CT4: ĐC + kinetin 0,5 mg/l
CT5: ĐC + kinetin 1,0 mg/l
CT6: ĐC + kinetin 1,5 mg/l
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và
23
chuối xanh đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím.
Thí nghiệm tiến hành trên 5 công thức, mỗi công thức cấy 3 bình, 3
cụm chồi/bình, thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Các công thức thí nghiệm:
ĐC: MS + sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + THT 1g/l
+ BAP 1,5 mg/l
CT1: ĐC + chuối xanh 30 g/l
CT2: ĐC + chuối xanh 50 g/l
CT3: ĐC + khoai tây 30 g/l
CT4: ĐC + khoai tây 50 g/l
So sánh sự sinh trưởng của lan Hoàng thảo phi điệp tím trong môi
trường bổ sung chuối xanh nghiền và khoai tây nghiền. Từ đó tìm được môi
trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh của lan Hoàng thảo phi điệp tím.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ
lan Hoàng thảo phi điệp tím
Thí nghiệm tiến hành trên 4 công thức, mỗi công thức cấy 3 bình, 5
chồi/bình, thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Các công thức thí nghiệm:
ĐC: MS + sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + THT 1g/l
+ khoai tây 50 g/l
CT1: ĐC + NAA 0,2 mg/l
CT2: ĐC + NAA 0,5 mg/l
CT3: ĐC + NAA 0,7 mg/l
Xác định nồng độ NAA phù hợp cho môi trường ra rễ in vitro lan
Hoàng thảo phi điệp tím.
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng qua lá đến sinh trưởng
và phát triển lan Hoàng thảo phi điệp tím sau khi ra chai trồng trong bầu.
Thí nghiệm tiến hành trên 3 công thức; mỗi công thức trồng 20 cây,
mỗi cây có chiều cao 2 - 4 cm, 4 - 5 lá, 4 - 5 rễ. Các cây được tưới giữ ẩm
24
hàng ngày.
CT1: Phun tưới nước lã
CT2: Phun tưới ½ MS
CT3: Phun tưới phân đầu trâu 501
Xác định chế độ tưới thích hợp cho sự phát triển của cây.
2.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi trong bình tam giác:
+ Số chồi/cụm;
+ Chiều cao chồi;
+ Số lá/chồi;
+ Số rễ/cây;
+ Độ dài rễ;
Các chỉ tiêu theo dõi khi ra cây:
+ Chiều cao cây (cm);
+ Số lá;
2.2.8. Xử lý số liệu
Kết quả được chúng tôi xử lí theo phương pháp thống kê sinh học trên
phần mềm tin học Microsoft Excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử
dụng được dựa trên công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức:
Giá trị trung bình ( ): =
Độ lệch chuẩn ( ): =
Trong đó: : Giá trị của từng số liệu.
n: Số lầ
25
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khử trùng mẫu đƣa vào nuôi cấy
3.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan
Quả của phong lan Hoàng thảo phi điệp tím được thu vào khoảng tháng
11 - 12. Trong quả có chứa rất nhiều hạt nhỏ, màu vàng. Các hạt lan được bảo
vệ bởi một vỏ quả nên mẫu hạt có chứa rất ít các vi khuẩn, nấm và ít khi chịu
tác động trực tiếp của hóa chất khử trùng. Sau khi khử trùng bề mặt quả,
chúng tôi mới tách vỏ để lấy hạt nuôi cấy.
Trong các loại hóa chất dùng để khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy thì
HgCl2 thường được sử dụng do tác dụng diệt nấm, khuẩn mạnh. Chúng tôi đã
tiến hành khử trùng quả của lan Hoàng thảo phi điệp tím bằng HgCl2 0,1%
trong thời gian 10 và 15 phút. Sau đó, tiến hành tách lấy hạt và cấy lên môi
trường MS bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP với nồng độ thay đổi 0; 1,0; 1,5;
2,0 mg/l. Mật độ gieo hạt trung bình là 1 quả chia ra 4 - 5 bình tam giác
250ml chứa môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ mẫu nhiễm (hoặc nảy mầm) được tính
theo đơn vị là bình nuôi cấy.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím
bằng HgCl2 0,1%
Số bình bị nhiễm nấm, vi khuẩn
Số bình không nhiễm
Số lô TN
Tổng
Tổng
TG khử trùng (phút)
10
15
Tổng số bình nuôi cấy 5 6 6 17 6 12 5 23
1 2 3 Tổng 1 2 3 Tổng
Sau 7 ngày 1 1 1 3 0 2 0 2
Sau 14 ngày 0 0 0 0 0 0 0 0
1 1 1 3 0 2 0 2
Tỉ lệ (%) 20 16,7 16,7 17,6 0 16,7 0 8,7
4 5 5 14 6 10 5 21
Tỉ lệ (%) 80,0 83,3 83,3 82,3 100 83,3 100 91,3
26
Kết quả khử trùng của các thí nghiệm được theo dõi và trình bày trong
bảng 3.1. Từ kết quả trên bảng 3.1 cho thấy, phương pháp khử trùng mẫu quả
của loài Hoàng thảo phi điệp tím bằng HgCl2 0,1% trong 10 hoặc 15 phút đều
cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao từ 80% - 100%. Trong khoảng thời gian 10 phút tỉ
lệ trung bình đạt 82,3%; còn trong khoảng thời gian 15 phút tỉ lệ trung bình
đạt 91,3%.
Do đó, chúng tôi tạm thời kết luận rằng phương pháp khử trùng bằng
HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 10 hoặc 15 phút đều cho kết quả tốt, tỷ lệ
mẫu được vô trùng cao.
3.2. Kết quả tái sinh chồi
3.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím
Các bình hạt sau 15 ngày kiểm tra nếu không bị nhiễm vi khuẩn, nấm
thì được xem như là đảm bảo khâu vô trùng.
Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MS
chứa BAP 2,0 mg/l sau 30 ngày nuôi cấy
Sau 20 ngày có một số hạt đã trương phồng lên và phình ra sau đó
chuyển từ trạng thái vàng nhạt sang vàng nâu, rồi hóa xanh và tạo thành các
thể protocorm có đường kính khoảng 1mm.
Hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím sau khi khử trùng được nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP với nồng độ thay đổi 1,0; 1,5
và 2,0 mg/l và pH là 5,8 đã phát sinh protocorm sau 30 ngày nuôi cấy. Và sau
27
2 tháng đã có hiện tượng nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm tương đối tốt.
Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím
Protocorm phát sinh từ hạt
NAA (mg/l) BAP (mg/l) Số bình nuôi cấy Thời gian KT (phút) Số bình Tỉ lệ (%) Mức độ Thời gian (ngày)
0,2 1,0 5 4 80,0 45 TB
0,2 1,5 6 4 66,7 40 10 Đạt
0,2 2,0 6 5 83,3 25 tốt
0,2 1,0 6 5 83,3 45 TB
0,2 1,5 12 10 83,3 35 tốt 15
0,2 2,0 5 5 100 25 tốt
A B
Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từ
hạt trên môi trường MS chứa BAP 2,0 mg/l
(Hình A): sau 50 ngày nuôi cấy; (Hình B): sau 90 ngày nuôi cấy
Từ bảng số liệu trên cho thấy mức độ phát sinh protocorm từ hạt với
thời gian khử trùng 10 phút trong môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP
1,0 mg/l đạt 80%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l đạt
66,7%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 2,0 mg/l đạt 83,3%.
Với thời gian khử trùng 15 phút mức độ phát sinh protocorm từ hạt
28
trong môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,0 mg/l đạt 83,3%; môi
trường bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 1,5 mg/l đạt 83,3%; môi trường bổ
sung NAA 0,2 mg/l và BAP 2,0 mg/l đạt 100%.
Như vậy, BAP có ảnh hưởng tới sự nảy mầm của hạt lan Hoàng thảo
phi điệp tím. Mức độ phát sinh protocorm trong môi trường bổ sung BAP 2,0
mg/l là cao nhất (đạt 83,3% ở thời gian khử trùng 10 phút và 100% ở thời
gian khử trùng 15 phút).
Dựa vào kết quả bảng 3.2, chúng tôi cũng nhận thấy thời gian khử
trùng không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lan Hoàng thảo phi
điệp tím. Tỷ lệ nảy mầm của hạt khi khử trùng bằng HgCl2 ở thời gian 15 phút
cao hơn so với thời gian 10 phút.
3.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím
Do protocorm phát sinh rất mạnh với mật độ dày đặc sau 90 ngày gieo
hạt nên chúng tôi tiến hành tách cụm và cấy chuyển protocorm trong bình
sang môi trường nuôi cấy có thành phần tương tự. Số bình nuôi cấy của mỗi
môi trường được lặp lại 4 lần, nguyên liệu nuôi cấy thuộc một bình môi
trường gốc ở trên. Sau 50 ngày nuôi cấy cho thấy, protocorm tiếp tục tạo
thành và phát triển mạnh, hơn nữa còn có hiện tượng tạo chồi gần như hoàn
toàn ở một số bình chứa môi trường mới.
Theo dõi quá trình tạo chồi từ protocorm trong 50 ngày (Bảng 3.3) cho
thấy môi trường MS có chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 2,0 mg/l có tỷ lệ
phát sinh chồi là 97,87% cao hơn so với công thức môi trường nhân chồi MS
chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 1,0 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi là 50,57%) và
BAP 1,5 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi là 78,79%).
Như vậy, chúng tôi cho rằng bổ sung BAP với nồng độ 2,0 mg/l tốt cho
nhân chồi từ protocorm. Kết quả này cũng phù hợp khi so sánh với kết quả nhân
chồi từ protocorm lan Kim điệp (Dendrobium Chrysotoxum) của tác giả Nguyễn
29
Văn Song và cộng sự. Các tác giả nhận thấy nhân chồi lan Kim điệp trên môi
trường bổ sung NAA 0,1 mg/l và BAP 2,0 mg/l với nước dừa 150 ml/l là tốt nhất
[6].
Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệp
tím sau 50 ngày cấy chuyển
Môi trƣờng nhân chồi
Số lô thí nghiệm
Tỷ lệ phát sinh chồi (%)
Số cụm protocorm đƣa vào
Số cụm protocorm phát sinh chồi
NAA (mg/l)
BAP (mg/l)
1,0
0,2
1,5
2,0
15 17 30 25 87 30 27 35 40 132 25 20 26 23 94
1 2 3 4 Tổng 1 2 3 4 Tổng 1 2 3 4 Tổng
10 7 15 12 44 24 20 30 30 104 25 20 25 22 92
66,7 41,2 50,0 48,0 50,57 80,0 74,1 85,7 75,0 78,79 100 100 96,15 95,7 97,87
A B
Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa BAP 1,5 mg/l
(Hình A) và BAP 2,0 mg/l (Hình B) sau 50 ngày cấy chuyển
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số kích thích sinh trƣởng nhóm
Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím
30
Cytokinin có vai trò rất lớn trong việc tạo ra các cơ quan thực vật,
chúng sẽ kích thích mạnh tạo ra các chồi non và hoạt động của chúng đối
kháng với sự tạo rễ. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của cytokinin đến sự nhân
nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím, chúng tôi đã sử dụng môi trường MS +
sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 100 ml/l + THT 1 g/l bổ sung BAP
(nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l ) và kinetin (nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5
mg/l). Thí nghiệm tiến hành trên 7 công thức, mỗi công thức cấy 3 bình, 5
cụm chồi/bình. Thí nghiệm 3 lần nhắc lại. Kết quả theo dõi sau 4 tuần thể hiện
ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan
Hoàng thảo phi điệp tím
Nồng
Nồng
Môi
độ
độ
Hệ số nhân
Chiều cao
Hình thái
Số lá/chồi
trƣờng
BAP
kinetin
chồi
chồi (mm)
chồi
(mg/l)
(mg/l)
Chồi nhỏ, lá
0
6,72 ± 0,29
6,3 ± 0,1
1 ± 0,03
0
ĐC
xanh nhạt
Chồi nhỏ, lá
CT1
0,5
7,25 ± 0,06
8,3 ± 0,2
1,1 ± 0,23
0
xanh
CT2
1,0
8,12 ± 0,16
0
11,1 ± 0,16 1,67 ± 0,17 Chồi nhỏ, lá xanh đậm
Chồi mập,
CT3
1,5
9,75 ± 0,32
11,5 ± 0,24
2,1 ± 0,23
0
lá xanh đậm
Chồi nhỏ, lá
CT4
0
0,5
6,34 ± 0,16
6,4 ± 0,1
1,2 ± 0,01
xanh nhạt
Chồi mập,
CT5
0
1,0
8,34 ± 0,14
9,2 ± 0,1
1,9 ± 0,13
lá xanh
Chồi nhỏ, lá
CT6
0
1,5
7,56 ± 0,26
8,6 ± 0,02
1,6 ± 0,14
xanh nhạt
BAP (6 - benzyl amino purin) là hormone sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin có vai trò chủ yếu là kích thích sự phân chia tế bào. BAP ảnh hưởng
31
rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa của cơ quan thực vật, đặc biệt là sự phân
hóa chồi. Thông qua cơ chế di truyền BAP tác động lên quá trình sinh tổng
hợp protein, từ đó ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho
sự phân chia và sinh trưởng của tế bào. Ngoài ra, BAP còn có tác dụng ngăn
chặn sự già hóa của tế bào thực vật, ngăn chặn sự phân hủy protein, axit
nucleic và chlorophyll.
Kinetin là hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có cấu trúc phân
tử là 6 - 2 - furfuryl - aminopurin. Tác dụng của kinetin là kích thích sự phân
chia tế bào, làm chậm quá trình già hóa của tế bào. Thông qua cơ chế di
truyền kinetin tác động lên sự tổng hợp protein, từ đó ảnh hưởng đến sự tổng
hợp protein, enzyme cần thiết cho sự phân chia và sinh trưởng của tế bào. Ở
mức cơ thể, kinetin có ảnh hưởng thúc sự tạo chồi và tạo protocorm trên các
đối tượng là thực vật [1].
Kết quả trong bảng 3.4 cho thấy ở tất cả các môi trường đều có sự nhân
chồi khi bổ sung BAP. Tuy nhiên, có sự chênh lệch lớn về hệ số nhân chồi
cũng như khả năng phát triển của chồi khi thay đổi nồng độ BAP. Trong đó,
môi trường ĐC chúng tôi không bổ sung BAP, các mẫu thu được cho hệ số
nhân chồi thấp nhất chỉ đạt 6,72. Chiều cao chồi, số lá trên chồi cũng rất kém
với chiều cao trung bình chồi là 6,3 mm và số lá trên chồi là 1, chồi nhỏ, lá
xanh nhạt. Khi bổ sung BAP vào môi trường, các chỉ tiêu theo dõi đã có sự
thay đổi. Với nồng độ BAP 0,5 mg/l, kết quả chúng tôi ghi nhận như sau: Hệ
số nhân chồi đạt 7,25; chiều cao trung bình đạt 8,3 mm và số lá/chồi là 1,1;
chồi nhỏ, lá xanh. Tiếp tục tăng nồng độ của BAP lên 1 mg/l và chúng tôi thu
được kết quả ở tất cả các chỉ tiêu tiếp tục tăng cao hơn hệ số nhân chồi đạt
8,12; chồi cao 11,1 mm và có 1,67 lá/chồi; các chồi phát triển xanh tốt. Chúng
tôi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l. Qua quá trình theo dõi, chúng tôi
nhận thấy trên môi trường này cho hệ số nhân chồi cao nhất với hệ số nhân
chồi đạt 9,75; chiều cao chồi đạt 11,5 mm và số lá là 2,1 lá/chồi, các chồi phát
triển khỏe mạnh, đồng đều và có màu xanh đậm.
32
Kết quả cũng cho thấy môi trường nuôi cấy có bổ sung kinetin ở các
nồng độ khác nhau thì thu được các kết quả khác nhau. Với nồng độ kinetin
0,5 mg/l, thì hệ số nhân chồi đạt 6,34; chiều cao trung bình đạt 6,4 mm và số
lá/chồi là 1,2; kinetin ở nồng độ 1,0 mg/l thì khả năng tạo chồi đạt tỷ lệ cao
nhất hệ số nhân chồi đạt 8,3; chiều cao chồi đạt 9,2 mm và số lá là 1,9 lá/chồi,
các chồi phát triển khỏe mạnh và có màu xanh đậm. Khi tiếp tục tăng nồng độ
kinetin lên 1,5 mg/l thì khả năng tạo chồi lại giảm, hệ số nhân chồi còn 7,56;
chiều cao chồi đạt 8,6 mm và số lá là 1,6 lá/chồi.
Như vậy, chúng tôi kết luận môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l;
agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và BAP 1,5 mg/l và MS bổ sung
sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và kinetin 1,0 mg/l
đều phù hợp để nhân chồi của giống lan Hoàng thảo phi điệp tím. Tuy nhiên
khi so sánh tác dụng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của lan
Hoàng thảo phi điệp tím chúng tôi nhận thấy với công thức môi trường bổ
sung BAP 1,5 mg/l thì khả năng sinh trưởng và phát triển của lan là tốt hơn so
với công thức môi trường bổ sung kinetin 1,0 mg/l. Như vậy, chúng tôi kết
luận rằng môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi
điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) là môi trường MS bổ sung sucrose 30
g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và BAP 1,5 mg/l.
Khi xét đến chất lượng chồi chúng tôi nhận thấy cytokinin có tác dụng
quan trọng đến việc tạo chồi trong quá trình nuôi cấy lan Hoàng thảo phi điệp
tím. Điển hình là với nồng độ cytokinin thấp cho kết quả tạo chồi thấp. Tuy
nhiên, hiện tượng khi không bổ sung chất kích thích sinh trưởng cytokinin cây
vẫn cho kết quả tạo chồi, có thể là do loài lan này có chứa lượng cytokinin nội
sinh cao nên vẫn tự tạo được lượng chồi tương đối dù không có bổ sung
cytokinin vào môi trường. Đây là một trong những ưu thế của chi
Dendrobium. Do đó khi nhân giống đối tượng này ta không cần phải tiêu tốn
lượng chất điều hòa sinh trưởng nhiều, điều này vừa kinh tế lại vừa hạn chế
33
được hiện tượng đột biến cho mẫu cấy do tác dụng phụ của các chất kích
thích sinh trưởng.
BAP 1,5 mg/l Kinetin 1,0 mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi lan
Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng khoai tây và chuối xanh đến sự
nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)
Ngoài các chất điều tiết sinh trưởng để thúc đẩy quá trình nuôi cấy giúp
cây sinh trưởng nhanh hơn và có chất lượng tốt hơn người ta thường bổ sung
khoai tây, chuối xanh là những thành phần không xác định có tác dụng kích
thích sự sinh trưởng của mô tế bào.
Khoai tây và chuối xanh đã được nhiều tác giả sử dụng và đạt kết quả
tốt như tác giả Nguyễn Thị Sơn (2011) khi nghiên cứu nhân nhanh in vitro
giống lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fibriatum) [7]. Tác giả thu
được kết quả tốt khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một hàm lượng nhất
định khoai tây và chuối xanh. Do đó trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử
dụng dịch khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền để nghiên cứu tác dụng của
chúng đối với sự sinh trưởng và phát triển của lan Hoàng thảo phi điệp tím in
vitro. Các cụm lan từ thí nghiệm 1 được tách ra rồi chuyển sang môi trường
MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l; BAP 1,5
mg/l và chuối xanh nghiền, khoai tây nghiền với hàm lượng khác nhau (Bảng
3.5). Thí nghiệm tiến hành trên 5 công thức, mỗi công thức cấy 3 bình, 3 cụm
34
chồi/bình và số chồi đưa vào trung bình là 5 chồi/cụm. Kết quả theo dõi sau 8
tuần nuôi cấy.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng chuối xanh và khoai tây nghiền đến
sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 30 ngày
Chiều cao
Môi trƣờng Số chồi/cụm
Số lá/chồi
Hình thái chồi
chồi (mm)
12,6 ± 0,06
15,1 ± 0,16
2,37 ± 0,17 Chồi mập, lá xanh
ĐC
ĐC + 30 g/l
15,8 ± 0,12
18,5 ± 0,24
2,8 ± 0,02 Chồi mập, lá xanh
chuối xanh)
ĐC + 50 g/l
10,1 ± 0,01
14,8 ± 0,32
2,1 ± 0,01 Chồi nhỏ, lá xanh
chuối xanh)
ĐC + 30 g/l
17,6 ± 0,04
21,2 ± 0,04
2,4 ± 0,34 Chồi mập, lá xanh
khoai tây
ĐC + 50 g/l
19,2 ± 0,06
25,2 ± 2,28
3,1 ± 0,13 Chồi mập, lá xanh đậm
khoai tây
Kết quả bảng 3.5 cho thấy môi trường nuôi cấy bổ sung khoai tây
nghiền và chuối xanh nghiền đều có ảnh hưởng khá tốt đến sự nhân nhanh và
sinh trưởng lan Hoàng thảo phi điệp tím. Ở môi trường ĐC thì sự nhân lên là
thấp hơn so với các môi trường khác bổ sung khoai tây nghiền và chuối xanh
nghiền. Môi trường ĐC bổ sung chất KTST thì chồi cũng tiếp tục phát triển
tuy nhiên các chỉ số theo dõi đều thấp. Số chồi trung bình đạt 12,6 chồi/cụm,
chiều cao chồi trung bình là 15,1 mm và số lá/chồi là 2,37. Chồi nhỏ và lá
xanh nhạt hơn so với chồi ở các môi trường bổ sung khoai tây nghiền và
chuối xanh nghiền.
Với hàm lượng chuối xanh 30 g/l, thì số chồi trung bình đạt 15,8
chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình là 18,5 mm và số lá/chồi là 2,8. Tuy
nhiên khi tăng hàm lượng chuối xanh lên 50 g/l thì sự sinh trưởng và phát
triển của chồi bị giảm, số chồi trung bình đạt 10,1 chồi/cụm, chiều cao chồi
35
trung bình là 14,8 mm và số lá/chồi là 2,1. Như vậy, kết quả cho thấy rằng
hàm lượng chuối xanh tốt cho sự nhân nhanh của lan Hoàng thảo phi điệp tím
là 30 g/l.
Bên cạnh đó, với thí nghiệm bổ sung 30 g/l khoai tây nghiền, số chồi
trung bình đạt 17,6 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 21,2 mm và số lá/chồi
là 2,4. Khi tăng hàm lượng khoai tây lên 50g/l thì sự phát triển của chồi là cao
nhất với số chồi trung bình đạt 19,2 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 25,2
mm và số lá/chồi là 3,1.
Như vậy, khi so sánh sự sinh trưởng của chồi ở môi trường có chứa
dịch chuối xanh và khoai tây nghiền, chúng tôi nhận thấy khoai tây có ảnh
hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của chồi trong giai đoạn nhân nhanh hơn
so với chuối xanh nghiền vì vậy nên bổ sung vào môi trường nhân nhanh
lan Hoàng thảo phi điệp tím khoai tây nghiền. Hàm lượng khoai tây phù
hợp là 50 g/l.
Chuối xanh 30 g/l Khoai tây 50 g/l
Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanh cụm
chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phi
điệp tím
α - NAA là hormone sinh trưởng thuộc nhóm auxin. Nó được sinh ra ở
mô phân sinh ngọn và được vận chuyển xuống các bộ phận khác của cây. Vai
trò của α - NAA là thúc đẩy sự sinh trưởng và dãn nở của tế bào thực vật, tăng
36
cường quá trình tổng hợp và trao đổi các chất như ADN, protein... Ngoài ra
nó còn kích thích sự ra rễ, kéo dài rễ và tham gia vào cảm ứng tạo chồi vô
tính trong ống nghiệm. Để nghiên cứu ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng
tạo rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím chúng tôi sử dụng môi trường MS bổ sung
sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l; khoai tây 50 g/l và
NAA với nồng độ thay đổi từ 0,2 mg/l đến 0,7 mg/l. Kết quả theo dõi sau 4
tuần được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan
Hoàng thảo phi điệp tím
CT
Số rễ/cây
Đặc điểm rễ
Độ dài rễ (mm)
Nồng độ α – NAA 0 0,2 0,5
Tỷ lệ ra rễ (%) 20 72 80
ĐC CT1 CT2
CT3
0,7
76
0,8 ± 0,01 1,5 ± 0,05 3,0 ± 0,11 1,88 ± 0,03
2,0 ± 0,12 3,9 ± 0,13 5,1 ± 0,02 4,2 ± 0,08
Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng Rễ nhỏ,màu trắng đục Rễ mập, dài, màu trắng đục Rễ dài, nhỏ, màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh
Qua bảng 3.6, chúng tôi nhận thấy bổ sung α - NAA với hàm lượng
khác nhau thì có tác dụng khác nhau đến sự hình thành rễ của lan Hoàng thảo
phi điệp tím:
- Ở môi trường ĐC không bổ sung NAA thì lan có tăng trưởng về chiều
cao và số lá nhưng tỷ lệ ra rễ thấp chỉ đạt 20%, số rễ trung bình/chồi chỉ đạt
0,8; độ dài rễ là 2 mm. Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng.
- Khi môi trường có bổ sung α - NAA, các chồi đều ra rễ với tỉ lệ khá
cao. Ở nồng độ NAA 0,2 mg/l thì tỉ lệ ra rễ đạt 72%; số rễ trung bình/chồi đạt
1,5; độ dài rễ là 3,9 mm. Rễ nhỏ, màu trắng đục.
- Khi tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l thì tỷ lệ tạo rễ là 80%, độ dài rễ
lên đến 5,1 mm gấp đôi độ dài so với công thức ĐC và số lá và chiều cao cây
tăng lên tương ứng là 5,3 mm và 4,12 cm. Rễ mập, dài, màu trắng đục.
- Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,7 mg/l thì tỷ lệ ra rễ, số rễ trên trung
bình/chồi và chiều dài rễ đều giảm tương ứng là 1,88; 4; 5; 4,6. Rễ dài, nhỏ,
37
màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh.
Từ kết quả trên có thể kết luận rằng, α - NAA thích hợp cho sự ra rễ
của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) và nồng độ α
- NAA thích hợp nhất là 0,5 mg/l.
ĐC NAA 0,5 mg/l
Hình 3.6. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày
3.6. Ảnh hƣởng chế phẩm dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của
cây lan sau khi ra cây trồng trong bầu
ọng bao gồm việc tạo
rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu
bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Đây là giai
đoạ in vitro. Khi cây
con nuôi cấy mô khi đã đạt đủ tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành dùng panh gắp
cây con khỏi bình nuôi cấy sau đó rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước cho thật sạch
agar và tránh để cây bị nát, để cây con ráo nước, rồi trồng vào cốc nhựa đựng
giá thể gồm vỏ thông, dớn, rêu đã được chuẩn bị trước. Sau đó cho vào túi
bóng nilon ghim lại và nuôi trong phòng cấy mô dưới giàn đèn.
Tiến hành chăm sóc các cây con bằng các chế phẩm dinh dưỡng khác
nhau nhằm đánh giá ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng tới sự sinh trưởng
của cây lan con. Thí nghiệm tiến hành trên 3 công thức (CT1: phun tưới nước lã;
38
CT2: phun tưới ½ MS; CT3 phun tưới phân đầu trâu 501) mỗi công thức trồng
20 cây, mỗi cây con có chiều cao 2 - 4cm, số lá 4 - 5, rễ 4 - 5 nhánh. Với mỗi chế
phẩm dùng bình xịt phun sương tưới cho lan 2 - 3 lần/tuần. Các cây được tưới
giữ ẩm hàng ngày. Kết quả theo dõi sau 8 tuần được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng chế phẩm dinh dƣỡng
đến sự sinh trƣởng phát triển của cây
Chiều cao cây
Chế phẩm
Số lá/cây
Đặc điểm cây
(cm)
Lá xanh nhạt, không ra rễ mới, rễ
Nước lã (ĐC)
4,54 ± 0,15
4,56 ± 0,12
cũ có màu xanh nhạt
Phân đầu trâu
Lá xanh, ra rễ mới, rễ xanh, cây
4,86 ± 0,15
4,6 ± 0,03
501
nảy chồi con
Lá xanh, ra rễ mới, rễ xanh, cây
½ MS
5,2 ± 0,01
4,8 ± 0,04
nảy chồi con
½ MS ĐC
Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng và
phát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày
Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các loại chế phẩm dinh
dưỡng đều có tác dụng đến khả năng tăng chiều cao cây và số lá của lan con.
Các cây lan được chăm sóc bằng chế phẩm dinh dưỡng đều cao cây hơn so
39
đối chứng chỉ phun nước lã. Khi phun nước lã thì chiều cao cây chỉ đạt 4,54
cm, số lá là 4,56; lá xanh nhạt, không ra rễ mới, rễ cũ có màu xanh nhạt. Khi
sử dụng chế phẩm dinh dưỡng phân đầu trâu 501 cây đạt chiều cao trung bình
là 4,86 cm và số lá là 4,6; lá xanh, ra rễ mới, rễ xanh, cây nảy chồi con. Khi
phun ½ MS thì các chỉ tiêu theo dõi đều cao nhất: chiều cao cây trung bình là
5,2 cm, số lá trung bình là 4,8; lá xanh, ra rễ mới, rễ xanh, cây tạo chồi con.
Như vậy, trong 2 chế phẩm chăm sóc lan con giai đoạn mới ra cây
chúng tôi đã sử dụng thì ½ MS có tác dụng tốt hơn phân đầu trâu 501. Các
cây lan con được chăm sóc bằng ½ MS sinh trưởng phát triển tốt, ra rễ mới và
ra thêm chồi con sau 8 tuần.
40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1. Khử trùng hạt loài Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum
Lindl.) bằng HgCl2 0,1% trong 10 hoặc 15 phút cho kết quả tốt, tỷ lệ mẫu vô
trùng đạt trên 80% và rất ít ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt.
2. Môi trường MS bổ sung NAA 0,2 mg/l và BAP 2,0 mg/l có tác dụng
tốt đến sự phát sinh Protocorm từ hạt và nhân chồi từ protocorm.
3. Môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng
thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) là môi trường MS bổ sung
sucrose 30 g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l và BAP 1,5 mg/l.
4. Môi trường thích hợp cho sự nhân nhanh chồi lan Hoàng thảo phi
điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) là môi trường MS bổ sung sucrose 30
g/l; agar 6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l; BAP 1,5 mg/l và khoai tây 50 g/l.
5. Môi trường thích hợp cho sự tạo rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím
(Dendrobium anosmum Lindl.) là môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar
6 g/l; nước dừa 100 ml/l; THT 1 g/l; khoai tây 50 g/l và NAA 0,5 mg/l.
6. Chế phẩm dinh dưỡng ½ MS có tác dụng tốt hơn phân đầu trâu 501
đối với sinh trưởng và phát triển của cây lan Hoàng thảo phi điệp tím
(Dendrobium anosmum Lindl.) giai đoạn ra cây trồng trong bầu.
2. Kiến nghị
1. Tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu giá các chế phẩm dinh dưỡng
và thể phù hợp nhất cho cây con ngoài vườn ươm.
2. Tiếp tục tiến hành nghiên cứu, hoàn thiện quy trình nhân giống in
vitro cây lan Dendrobium anosmum Lindl. nhằm góp phần bảo tồn lan rừng
và phục vụ cho nhân nhanh giống, phục tráng các giống cây cảnh.
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học
thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), “Nhân giống lan Dendrobium anosmum,
Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô, nghiên cứu các loại
giá thể trồng lan Dendrobium thích hợp và cho hiệu quả cao”, đề tài
nghiên cứu khoa học cấp trường, Đại học An Giang.
3. Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
4. Thái Hà (2011), Kỹ thuật trồng lan nhiệt đới, NXB Văn hóa Thông tin.
5. Thanh Loan (2011), Kỹ thuật trồng lan, NXB Thời đại.
6. Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp
(Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng”,
Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr. 127 - 136.
7. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai
(2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan
Hoàng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, trường Đại
học Nông nghiệp, tập 10, số 2, tr. 263 - 271.
8. Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ảnh hưởng của chất điều
hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy phát sinh tế bào soma và phôi vô
tính ở cây lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cybidium)”, Hội nghị Khoa
học và Công nghệ 2007, tr. 503 - 508.
9. Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị
Bích Phượng (2010), “Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào
trong nhân giống in vitro cây Hoàng lan thân gãy (Dendrobium
aduncum)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8 (3): 361 - 367.
10. Vũ Văn Vụ, Lê Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ Sinh học
tế bào, NXB Giáo dục.
42
11. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lí học Thực
vật, NXB Giáo dục.
TIẾNG ANH
12. Angiosperm Phylogeny Group (APG), (Octorber 2009), “APG III
system”. Botanical Journal of the Linnean Society.
13. Bijaya P., Deepa T. (24, May 2012), “In vitro mass propagation of an
epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl. through shoot tip
culture”. African Journal of Biotechnology Vol. 11 (42), pp. 9970 - 9974.
14. Maridass M., Mahesh R., Raju G.A., Muthuchelian K. (2010) “In vitro
propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture”.
International Journal of Biological Technology, 1(2), 50 - 54.
15. Sana A., Touqeer A., Ishfaq A. H., Mehwish Y. “In vitro propagation of
orchid (Dendrobium nobile) var. Emma white”. African Journal of
Biotechnology Vol. 10(16), pp. 3097 - 3103, 18 April, 2011.
TRANG WEB
16. http://www.hoalanvietnam.org
17. http://www.vnorchids.net/index.php?/topic/11-lan-hoang-thao%
18. https://vi.wikipedia.org/
19. http://www.vuonhoalan.net/?tab=detailnews&tin=68&title=lan-da-hac-
phi-diep-dendrobium-anosmum
