Nghiên cứu phân lập lycorin từ náng hoa trắng (crinum asiaticum roxb amaryllidaceae) làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP LYCORIN TỪ NÁNG HOA TRẮNG<br /> (CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE)<br /> LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM<br /> Nguyễn Ngọc Quỳnh**, Nguyễn Hữu Phúc**, Trần Hùng*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất và phân lập lycorin trong lá Náng hoa trắng làm chất chuẩn đối chiếu cho<br /> nghiên cứu định tính và định lượng lycorin trong dược liệu và chế phẩm chứa lycorin.<br /> Phương pháp: Dược liệu được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 95% và bốc hơi dưới áp suất<br /> giảm thu được cao chiết. Cao chiết được chiết phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực khác nhau<br /> thu được các cao phân đoạn. Các phân đoạn được tách và lập các chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột cổ<br /> điển. Chất tinh khiết được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại. Chất phân lập được, được xác định cấu trúc<br /> bằng các kỹ thuật phổ NMR và MS. Độ tinh khiết của lycorin được đánh giá bằng HPLC với detector UV.<br /> Kết quả: Đã phân lập được 3,5 g hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc là lycorin và kiểm tra độ tinh khiết<br /> đạt 99 %.<br /> Kết luận: Đã phân lập được lycorin với độ tinh khiết có thể dùng làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm<br /> nghiệm dược liệu và chế phẩm có chứa lycorin<br /> Từ khóa: Náng hoa trắng, Crinum asiaticum, lycorin, phân lập, cấu trúc, HPLC-PDA.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ISOLATION OF LYCORINE FROM CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE – ORIENT AS<br /> REFERENCE SUBSTANCE<br /> Nguyen Ngoc Quynh, Nguyen Huu Phuc, Tran Hung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 602 - 605<br /> Objectives: Extraction and isolation study of lycorine from Crinum asiaticum leaves for using as reference<br /> standard for quality control of herbs and lycorine-containing preparations.<br /> Methods: leaves powder of Crinum asiaticum was percolated with 95% alcohol, percolate obtained was<br /> evaporated under reduced pressure to give a liquid extract. The extract was fractionated by distribution with<br /> solvents. The fractions were then chromatographed on silica gel 60 (0.40 – 0.063 mm). Lycorine was isolated,<br /> purified and elucidated by NMR spectra. The purity of lycorine was determined by HPLC-PDA.<br /> Results: 3 fractions (Q1, Q2, Q3) were obtained from alcoholic extract of Crinum asiaticum leaves. Lycorine<br /> (3.5 g) was isolated from fraction Q3 and its purity was detemined as pure as 99 %.<br /> Conclusions: Lycorine was isolated with the purity suitable for using as reference standard for quality<br /> control of herbs and lycorine-containing preparations.<br /> Key words: Crinum asiaticum, lycorine, isolation, structure, HPLC-PDA.<br /> đông và Đông nam Á, để điều trị các viêm khớp<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> và dùng làm thuốc kháng khuẩn(4,5). Náng hoa<br /> Náng hoa trắng được sử dụng trong y học cổ<br /> trắng được biết như một cây thuốc chứa nhiều<br /> truyền và dân gian của Việt nam và một số nước<br /> alkaloid và một số alkaloid trong nhóm này có<br /> *Đại học Y Dược TPHCM **Trường Đại học Y Dược Cần Thơ<br /> Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096<br /> Email: tranhung@uphcm.edu.com<br /> <br /> 602<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> tác dụng kháng viêm, kháng khối u, và cải thiện<br /> trí nhớ tuổi già, tác dụng này được y học hiện<br /> đại quan tâm đặc biệt(1,2,3,4). Đề tài được thực hiện<br /> với mục đích phân lập lycorin để sử dụng làm<br /> chất chuẩn đối chiếu cho việc xây dựng phương<br /> pháp kiểm nghiệm dược liệu, các chế phẩm<br /> chứa lycorin và các nghiên cứu về tác dụng sinh<br /> học của lycorin sau này.<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> -<br /> <br /> PHƯƠNG<br /> <br /> PHÁP<br /> <br /> Nguyên liệu<br /> Đối tượng là cây Náng hoa trắng được thu<br /> hái tại Tp. Cần Thơ (tháng 6/2008). Mẫu được<br /> định danh và lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu,<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Dược liệu được chiết bằng phương pháp<br /> ngấm kiệt với dung môi là cồn 95%.Cao chiết<br /> được tách thành các phân đoạn đơn giản hơn<br /> bằng cách chiết phân bố lỏng – lỏng. Sau đó các<br /> phân đoạn được tách và phân lập các hợp chất<br /> bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển, chất tinh<br /> khiết được tinh chế bằng phương pháp kết tinh<br /> lại. Cấu trúc của chất phân lập đã được xác định<br /> bằng phổ MS thực hiện trên máy Quattro Micro<br /> API, phổ NMR với máy Bruker Avance 500 sử<br /> dụng CDCl3. Chất phân lập được kiểm tra độ<br /> tinh khiết bằng sắc ký lỏng áp sất cao, thực hiện<br /> <br /> HPLC Hitachi L – 2000<br /> EZChrom Elite, đầu dò UV – Vis, với các<br /> <br /> trên<br /> <br /> máy<br /> <br /> điều kiện sắc ký như sau:<br /> Cột sắc ký: LiChro Cart RP C18 (250 mm x<br /> 4,6 mm, 5μm)<br /> Pha động: Ammonium acetat 1% (kl/tt) pH<br /> 8,0 – Acetonitril (90: 10).<br /> Tốc độ dòng: 1,5ml/phút<br /> Thể tích tiêm mẫu: 20μl<br /> Bước sóng phát hiện: 290nm<br /> Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng<br /> Thời gian phân tích: 18 phút<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> Chiết tách các hợp chất trong Náng hoa<br /> trắng<br /> Bột dược liệu khô (12 kg) được làm ẩm bằng<br /> cồn 95% trong khoảng 1 giờ, vào bình ngấm kiệt,<br /> sau đó thêm dung môi ngập mặt dược liệu<br /> khoảng 2-3 cm. Ngâm trong 24 giờ, rút dịch<br /> chiết cho đến khi kiểm tra trên giấy lọc không<br /> cho vết vàng cam với thuốc thử Dragendorff.<br /> Dịch chiết được cô thu hồi dung môi thu được<br /> cao lỏng và được thêm đồng lượng nước. Chiết<br /> phân bố lỏng – lỏng cao chiết này lần lượt bằng<br /> n-hexan và sau đó là chloroform thu được các<br /> cao tương ứng là Q1 (20 g), Q2 (15g). Dịch chiết<br /> sau khi chiết với CHCl3 được kiềm hóa bằng<br /> NH4OH đđ đến pH 10 và chiết tiếp bằng CHCl3.<br /> cất thu hồi dung môi thu được 23 g cao chiết Q3.<br /> <br /> Phân lập lycorin từ Q3<br /> 23 g cao Q3 được nhồi lên cột (40 × 5 cm) với<br /> 120g Silica gel (0,040-0,063mm), triển khai sắc ký<br /> với hệ dung môi chloroform và chloroform –<br /> methanol với lượng methanol tăng dần.<br /> Kết quả là đã thu được 11 phân đoạn, trong<br /> đó phân đoạn VLC-01.6 thu được có hàm lượng<br /> chất E cao nhất. VLC-01.6 thu được được để kết<br /> tinh phân đoạn và sau đó tinh chế bằng cách kết<br /> tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi<br /> CHCl3–MeOH (1:1) ở 5oC. Lọc lấy tinh thể và rửa<br /> lại nhiều lần bằng MeOH thu được tinh thể<br /> alkaloid E không màu, hình khối nhỏ (3,5 g).<br /> Alkaloid E thu được được kiểm tra bằng sắc<br /> ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung môi, phát hiện<br /> bằng đèn UV 365-254 và thuốc thử Dragendorff.<br /> E chỉ cho 1 vết duy nhất trên các sắc ký đồ.<br /> <br /> Xác định cấu trúc hợp chất E<br /> E là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình khối,<br /> không màu, có độ phân cực trung bình, tan tốt<br /> trong dung môi DMSO, cho phản ứng đặc trưng<br /> của alkaloid. Cấu trúc của M được xác định chủ<br /> yếu bởi các dữ liệu phổ MS và cộng hưởng từ<br /> hạt nhân.<br /> <br /> 603<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> 3,99<br /> <br /> Các dữ liệu phổ NMR cho thấy E có 16<br /> <br /> HO<br /> <br /> carbon cho các tín hiệu phổ từ 20 ppm – 150 ppm.<br /> Trong đó có 5 carbon bậc IV, 7 carbon bậc III, 4<br /> <br /> 10<br /> <br /> H<br /> <br /> 5,95<br /> <br /> H<br /> <br /> 104,99<br /> <br /> 4,85<br /> <br /> 71,67<br /> <br /> 145,59<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10a<br /> 6a<br /> <br /> 145,48<br /> <br /> O<br /> <br /> 6,69 H<br /> <br /> và 145,15 ppm).<br /> <br /> 129,60<br /> <br /> 2,46<br /> <br /> 4a<br /> <br /> 129,70 2,52<br /> <br /> 4,02<br /> <br /> 11<br /> <br /> H<br /> <br /> N<br /> <br /> 28,07<br /> <br /> 2,63<br /> <br /> H<br /> <br /> 53,24<br /> <br /> H<br /> <br /> H<br /> <br /> H 3,21<br /> <br /> 2,22<br /> <br /> 3,34<br /> <br /> Tương tác H-H trong COSY<br /> Tương tác H-C trong HMBC<br /> <br /> hóa sp2 của nối đôi trong đó có 2 carbon của<br /> vòng thơm [δC 106,94 d; δH 6,68 (1H, s) và<br /> 104,99 d; δH 6,82 (1H, s) ppm] và 1 của nối đôi<br /> <br /> Hình 2. Tương tác H và C trong cấu trúc chất E<br /> <br /> ngoài vòng thơm [δC 118,41 d; δH 5,38 (1H, s)<br /> <br /> Bảng 1. So sánh độ dịch chuyển hóa học chất E và<br /> lycorin<br /> <br /> ppm] và 2 carbon sp3 mang nhóm thế oxy (δC<br /> 71,68 và 70,17 ppm).<br /> <br /> C<br /> <br /> E<br /> <br /> Phổ khối ESI-MS positive cho biết khối<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 4a<br /> <br /> δC<br /> 70,16 d<br /> 71,68 d<br /> 118,41 d<br /> 141,68 s<br /> 60,74 d<br /> <br /> lượng phân tử của E là 287. E có số khối lẻ<br /> <br /> 6<br /> <br /> 56,65 t<br /> <br /> chứng tỏ có số lẻ nguyên tử nitơ trong phân tử,<br /> <br /> 6a<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 10a<br /> 10b<br /> 11<br /> <br /> Trong số 4 carbon bậc 2 của E, có một carbon<br /> chuyển dịch ở vùng trường thấp (δC 100,49 ppm)<br /> đặc trưng của nhóm methylendioxy.<br /> <br /> tương ứng với công thức nguyên là C16H17NO4.<br /> Độ bất bão hòa của phân tử tính được là 9. Với<br /> các đặc điểm như trên, có thể dự đoán E là một<br /> alkaloid có một nitơ, 1 vòng thơm, một nối đôi<br /> ngoài vòng, 1 nhóm methylendioxy, 2 nhóm<br /> OH tự do và 5 vòng trong đó có 1 vòng 5 mang<br /> nhóm methylendioxy với kiểu cấu trúc của<br /> lycorin.<br /> Cấu trúc của E được xác định là lycorin bởi<br /> các dữ liệu phổ NMR và được xác nhận bởi so<br /> sánh với dữ liệu chuyển dịch hóa học của<br /> lycorin báo cáo trong tài liệu(1). Cấu trúc và các<br /> tương tác tìm được trong phổ COSY và HMBC<br /> của E được trinh bày ở Hình 2. Chuyển dịch hóa<br /> học của proton và carbon của E, so sánh với<br /> lycorin được trình bày ở Bảng 1<br /> <br /> 604<br /> <br /> 2,46<br /> <br /> 12<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> H<br /> <br /> H<br /> <br /> 4<br /> <br /> H<br /> <br /> 106,94<br /> <br /> 5,38<br /> <br /> 141,68<br /> <br /> 40,15<br /> <br /> 56,65<br /> 7<br /> <br /> H<br /> <br /> 3<br /> <br /> 118,41<br /> <br /> 60,72<br /> <br /> này có 2 carbon mang nhóm thế oxy (δC 145,59<br /> Trong số 7 Carbon bậc III, có 3 carbon lai<br /> <br /> 10b<br /> <br /> O<br /> 8<br /> <br /> 5,95<br /> <br /> 1<br /> 70,16<br /> <br /> dịch ở vùng trường thấp (δC từ 120 – 150 ppm)<br /> đặc trưng của các carbon lai hóa sp2. Trong số<br /> <br /> OH<br /> 2<br /> <br /> H<br /> <br /> 4,29<br /> <br /> H<br /> <br /> 6,82<br /> <br /> carbon bậc II và không có carbon bậc 1.<br /> Tất cả 5 carbon bậc IV của E đều chuyển<br /> <br /> H<br /> <br /> 4,75<br /> <br /> 12<br /> 13<br /> <br /> δH ppm<br /> 4,29 (1H, s)<br /> 3,99 (1H, s)<br /> 5,38 (1H, s)<br /> 2,63 (1H, d)<br /> 4,02 (1H, d);<br /> 3,34 (1H, d)<br /> <br /> 129,70 s<br /> 106,94 d 6,69 (1H, s)<br /> 145,48 s<br /> 145,59 s<br /> 104,09 d 6,82 (1H, s)<br /> 129,60 s<br /> 40,15 d 2,52 (1H, m)<br /> 28,07 t 2,46 (2H, m)<br /> 3,21 (1H, t);<br /> 53,24 t<br /> 2,22 (1H, q)<br /> 5,96 (1H, s)<br /> 100,07 t<br /> 5,95 (1H, s)<br /> <br /> Lycorin(1)<br /> δC<br /> δH ppm<br /> 70,21 d 4,27 (1H, s)<br /> 71,72 d 3,97 (1H, s)<br /> 118,48 d 5,37 (1H, s)<br /> 141,68 s<br /> 60,83 d 2,60 (1H, d)<br /> 3,32 (1H, d);<br /> 56,73 t<br /> 4,02 (1H, d)<br /> 129,75 s<br /> 107,01 d 6,68 (1H, s)<br /> 145,20 s<br /> 145,65 s<br /> 105,06 d 2,50 (1H, s)<br /> 129,57 s<br /> 40,18 d 2,50 (1H, m)<br /> 2,83 t 2,44 (2H, m)<br /> 3,18 (1H, t);<br /> 5,31 t<br /> 2,19 (1H, q)<br /> 100,07 t<br /> <br /> 5,94 (1H, s)<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết lycorin phân lập<br /> được<br /> Lycorin phân lập được được xác định độ<br /> tinh khiết sắc ký trên hệ thống sắc ký lỏng cao<br /> áp với Detector PDA. Kết quả sắc ký cho thấy<br /> lycorin phân lập được chỉ cho một đỉnh chính<br /> trên sắc ký đồ với độ tinh khiết tương ứng là 99<br /> %. Kết quả được thể hiện ở Hình 3. Với độ tinh<br /> khiết này, lycorin phân lập được có thể làm chất<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> chuẩn trong các nghiên cứu xây dựng phương<br /> pháp định tính và định lượng lycorin trong<br /> dược liệu và chế phẩm có lycorin.<br /> 60<br /> <br /> 60<br /> <br /> UV-VIS<br /> <br /> 50<br /> <br /> 40<br /> <br /> 40<br /> <br /> 30<br /> <br /> 30<br /> <br /> 20<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1.520<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> 12<br /> <br /> 14<br /> <br /> phân tích phổ hiện đại NMR, MS. Với độ tinh<br /> khiết 99% (HPLC-PDA), lycorin thu được có thể<br /> làm chất chuẩn sử dụng trong kiểm nghiệm<br /> dược liệu và các chế phẩm có lycorin. Phương<br /> pháp định lượng lycorin trong dược liệu bằng<br /> HPLC sẽ được báo cáo ở bài báo sau.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> mAU<br /> <br /> 50<br /> <br /> 14.193 Lycorine<br /> <br /> mAU<br /> <br /> Retention Time<br /> Name<br /> <br /> 10<br /> <br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 0<br /> <br /> 16<br /> <br /> 18<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Minutes<br /> <br /> Hình 3. Sắc ký đồ lycorin nồng độ 100μg/ml bằng<br /> HPLC nồng độ 100μg/ml<br /> <br /> 4.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Đề tài đã phân lập được lycorin từ cây Náng<br /> hoa trắng với 1 lượng lớn (3,5g). Cấu trúc của<br /> lycorin được xác nhận bằng các phương pháp<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Hitwrayawljid K., Indyk C., Ebyuncghai A.H., Pezzuto J.M.,<br /> Cordel G.A. (1993), Cytotoxic and antimalarial alkaloid from bulbs<br /> of Crinum amabile, J. Nat. Prod., 56(8), 1331-38.<br /> Manske R.H.F. (1975), Amaryllidaceae alkaloids, The alkaloids<br /> chemistry and physiology, XV, Academic Press, 83-164.<br /> Satoru Yui, Masaaki Mikami, Mikio Kitahara, Masatoshi<br /> Yamazaki (1998), “The inhibitory effect of Lycorine on tumor<br /> cell apoptosis induced by polymorphonuclear leukocytederived calprotectin”, Immunopharmacology, 42, 151-162.<br /> Tram N. T. N., Tz.V. Titorenkova, V.St. Bankova, N.V.<br /> Handjieva, S.S. Popov (2002 ), “Crinum L. Amaryllidaceae”,<br /> Fitoterapia 73, 183-208.<br /> Võ văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB<br /> Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 265.<br /> <br /> 605<br /> <br />