Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atra

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISA<br /> ĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA<br /> Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***<br /> Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam<br /> (Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọc<br /> rắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác định<br /> ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)<br /> của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng<br /> (LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.<br /> * Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.<br /> <br /> Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection of<br /> Chinese Cobra (Naja atra) Venom<br /> Summary<br /> Objective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebite<br /> victims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed using<br /> horse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well as<br /> limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test for<br /> were 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analytical<br /> sensitivity, reproducibility and accuracy.<br /> * Key words: Venom; Naja atra; ELISA.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Với nạn nhân rắn độc cắn, việc đánh<br /> giá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợ<br /> cho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân<br /> (BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanh<br /> kháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.<br /> Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độc<br /> <br /> đối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,<br /> với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựa<br /> vào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹ<br /> điều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,<br /> có sự khác nhau giữa các trung tâm<br /> điều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệm<br /> xác định nọc rắn định tính và định lượng<br /> được xem là cơ sở khoa học khách quan,<br /> <br /> * §¹i häc Y Th¸i B×nh<br /> ** Häc viÖn Qu©n y<br /> *** BÖnh viÖn B¹ch Mai<br /> Người phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015<br /> <br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắn<br /> trên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượng<br /> nồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đối<br /> chiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiện<br /> của một số triệu chứng, bác sỹ điều trị có<br /> thể đánh giá một cách khách quan hơn<br /> mức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, có<br /> thể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sử<br /> dụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệu<br /> cho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phương<br /> pháp phân tích miễn dịch dựa trên tương<br /> tác giữa kháng nguyên và kháng thể, với<br /> một số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phân<br /> tích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gian<br /> thực hiện không kéo dài, có thể thực hiện<br /> đồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiện<br /> từng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,<br /> chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưu<br /> hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ<br /> thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn<br /> Hổ mang Naja atra trên in vitro.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> * Sinh phẩm, hóa chất:<br /> - Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).<br /> - Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắn<br /> Hổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thể<br /> IgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra<br /> (Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),<br /> kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).<br /> - Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...<br /> (Hãng Sigma và Merck).<br /> * Dụng cụ, thiết bị:<br /> - Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,<br /> 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.<br /> - Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.<br /> - Phiến ELISA 96 giếng (Corning).<br /> - Tủ ấm.<br /> - Máy đo mật độ quang DTX 880<br /> (Beckman Coulter).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Nguyên lý phản ứng:<br /> <br /> Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.<br /> 39<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Thiết kế phản ứng dựa dựa trên<br /> nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich<br /> (hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)<br /> là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ<br /> <br /> 1. Xác định các điều kiện tối ƣu của<br /> phản ứng.<br /> <br /> mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắt<br /> giữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phản<br /> ứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứ<br /> hai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thể<br /> đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưng<br /> có nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;<br /> kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lại<br /> kháng thể phát hiện, được gắn enzym<br /> horse-radish peoxidase (HRP).<br /> * Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISA<br /> định lượng nọc rắn:<br /> - Xác định các điều kiện tối ưu của phản<br /> ứng.<br /> - Xây dựng đường chuẩn tương quan<br /> tuyến tính giữa mật độ quang (OD) của<br /> dung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắn<br /> chuẩn.<br /> - Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.<br /> - Xác định độ ổn định của bộ kít bằng<br /> cách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữa<br /> các lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.<br /> - Xác định độ đúng của kỹ thuật bằng<br /> cách tính toán tỷ lệ phục hồi (%) sau khi tiến<br /> hành định lượng trên mẫu chuẩn với nồng<br /> <br /> Nhằm đạt độ nhạy và độ chính xác cao<br /> nhất khi phân tích bằng phương pháp<br /> ELISA, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết<br /> quả phân tích cần được khảo sát. Dưới đây<br /> là một số thông số để phản ứng đạt được<br /> mật độ quang (OD) tối ưu và phù hợp nhất<br /> cho phản ứng bao gồm:<br /> - Nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch FBS.<br /> - Nồng độ kháng thể gắn bản (IgG ngựa<br /> kháng nọc rắn) 10 µg/ml.<br /> - Nồng độ kháng thể phát hiện (IgG thỏ<br /> kháng nọc rắn) 5 µg/ml.<br /> - Kháng thể gắn enzym pha loãng ở tỷ lệ<br /> thể tích 1:10.000 trong dung dịch PBS-T<br /> (0,05% Tween).<br /> - Dung dịch blocking: gelatin 1%.<br /> - Nồng độ cơ chất 0,5 mg/ml OPD pha<br /> trong đệm citrate có bổ sung 0,006% H2O2.<br /> - Thời gian ủ mẫu 60 phút, ủ kháng thể<br /> phát hiện 30 phút, ủ kháng thể gắn enzym<br /> 30 phút và ủ cơ chất 10 phút.<br /> - Nhiệt độ áp dụng 37oC.<br /> 2. Xây dựng đƣờng chuẩn.<br /> <br /> lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên nạn<br /> <br /> Tổng số nọc rắn 1 mg/ml, pha thành các<br /> nồng độ: 100 ng/ml; 31,6 ng/ml; 10 ng/ml; 3<br /> ng/ml; 1 ng/ml và 0,3 ng/ml (pha trong dung<br /> dịch FBS). Qua nghiên cứu, chúng tôi đã<br /> <br /> nhân đã được chẩn đoán xác định là bị rắn<br /> <br /> xây dựng được khoảng tuyến tính từ 0,3 -<br /> <br /> Hổ mang Naja atra cắn. Do đó, trong nghiên<br /> <br /> 31,6 ng/ml có OD từ 0,06 - 0,6 (R2 = 0,999;<br /> <br /> cứu này, chúng tôi không tiến hành khảo sát<br /> <br /> hình 2).<br /> <br /> độ nọc rắn đã biết.<br /> Mục đích phát triển bộ kít là nhằm định<br /> <br /> độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kít đã xây<br /> dựng.<br /> <br /> 40<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Nång ®é näc r¾n chuÈn<br /> <br /> Bảng 1: Độ nhạy của bộ kít ELISA (LOD<br /> và LOQ).<br /> L O D<br /> <br /> L O Q<br /> <br /> O D<br /> S è<br /> c h ø n Sg D<br /> g iÕ n g<br /> © m<br /> <br /> Nồng<br /> <br /> Nồng<br /> <br /> độ<br /> <br /> OD<br /> <br /> MËt ®é quang OD<br /> <br /> 24<br /> <br /> 0,073<br /> <br /> 0,001 0,075<br /> <br /> độ<br /> <br /> OD<br /> <br /> (ng/ml)<br /> 0,82<br /> <br /> (ng/ml)<br /> 0,083<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> Như vậy, LOD của phản ứng có mật độ<br /> Hình 2: Đồ thị đường chuẩn của<br /> phản ứng.<br /> <br /> quang 0,075 và LOQ là 0,083. Dựa theo<br /> đường chuẩn, LOD, tính theo nồng độ của<br /> nọc rắn tổng số là 0,87 ng/ml và LOQ tương<br /> ứng là 1,27 ng/ml.<br /> 4. Kết quả xác định độ ổn định và độ<br /> đúng của phƣơng pháp.<br /> Bảng 2: Hệ số biến thiên.<br /> M<br /> M É u<br /> Mo (ng/ml)<br /> t h ö<br /> <br /> H Ö<br /> c ñ a<br /> <br /> l Ë p<br /> <br /> Hình 3: Phản ứng ELISA với mẫu<br /> nọc rắn chuẩn.<br /> 3. Xác định ngƣỡng phát hiện của bộ<br /> kít.<br /> Độ nhạy của phản ứng được đại diện bởi<br /> giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)<br /> và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of<br /> Quantification). LOD là lượng thấp nhất chất<br /> cần thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện<br /> được mà không nhất thiết phải xác định<br /> chính xác hàm lượng. LOQ là lượng thấp<br /> nhất chất cần thử có trong mẫu thử còn có<br /> thể xác định được với mức độ đúng và<br /> chính xác thích hợp.<br /> <br /> (ng/ml)<br /> <br /> t h iª n<br /> (<br /> <br /> ® é<br /> ® Þn h<br /> (<br /> <br /> 1<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14,93 ± 0,38<br /> <br /> 2,12<br /> <br /> 97,88<br /> <br /> 2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 44,18 ± 0,62<br /> <br /> 1,4<br /> <br /> 98,6<br /> <br /> 3<br /> <br /> 75<br /> <br /> 74,15 ± 1,67<br /> <br /> 2,25<br /> <br /> 97,75<br /> <br /> 1,92<br /> <br /> 98,1<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> Độ ổn định được thể hiện bằng hệ số<br /> biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng<br /> với mẫu nọc rắn chuẩn. Trong nghiên cứu<br /> này, chúng tôi xác định hệ số biến thiên (CV:<br /> coefficient of variation) sau khi thực hiện lặp<br /> lại phản ứng 6 lần trên cùng một khay phản<br /> ứng ELISA, bằng cách sử dụng công thức<br /> tính toán: CV = SD/M x 100 (%), trong đó, M<br /> <br /> Từ mật độ quang của mẫu chứng âm, độ<br /> nhạy của phản ứng được tính toán và trình<br /> bày ở bảng 1.<br /> 41<br /> <br /> là giá trị nồng độ đo được dựa vào đường<br /> chuẩn, SD là độ lệch chuẩn.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Bảng 3: Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn.<br /> M<br /> <br /> T û<br /> <br /> M É u<br /> Mo (ng/ml)<br /> <br /> c ñ a<br /> <br /> h å i<br /> <br /> o<br /> <br /> x<br /> <br /> t h ö<br /> t h ù c (ng/ml)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14,68 ± 1,16<br /> <br /> 97,8<br /> <br /> 2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 44,5 ± 2,7<br /> <br /> 98,88<br /> <br /> 3<br /> <br /> 75<br /> <br /> 73,48 ± 3,58<br /> <br /> 97,97<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> đúng của phương pháp, được tính theo<br /> công thức: M/Mo x 100, trong đó M là giá trị<br /> đo được dựa vào đường chuẩn, Mo là giá trị<br /> thực (nồng độ mẫu chuẩn đã biết trước). Để<br /> xác định tỷ lệ phục hồi và độ lặp lại giữa các<br /> lần thực hiện độc lập nhau (cùng một quy<br /> trình và do 3 người khác nhau thực hiện,<br /> mỗi người lặp lại 3 lần), mẫu nọc rắn chuẩn<br /> được pha ở 3 nồng độ 15 ng/ml; 45 ng/ml và<br /> 75 ng/ml (trong dung dịch FBS).<br /> Với tỷ lệ phục hồi 98,22% và hệ số biến<br /> thiên trung bình trong cùng lần thực hiện<br /> phản ứng là 1,92% cho thấy phương pháp<br /> <br /> 42<br /> <br /> Đã phát triển được bộ kít ELISA định<br /> lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Naja atra<br /> sử dụng hai nguồn kháng thể đặc hiệu nọc<br /> rắn Hổ mang Naja atra từ thỏ và ngựa. Bộ<br /> kít đạt được các chỉ tiêu về độ nhạy, độ ổn<br /> định và độ đúng.<br /> <br /> 98,22<br /> <br /> Tỷ lệ phục hồi là đại lượng đánh giá độ<br /> <br /> đạt độ đúng và độ ổn định cao.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> 1. Lê Văn Đông và CS. Nghiên cứu chế tạo<br /> bộ xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn<br /> ở Việt Nam. Báo cáo kết quả đề tài. Học viện<br /> Quân y, Bộ Quốc phòng. 2010.<br /> 2. Nguyễn Văn Cường và CS. Phát triển<br /> phương pháp xác định tồn dư 2,4-D trong hoa<br /> quả bằng kỹ thuật ELISA. Nông nghiệp-Nông<br /> thôn-Môi trường. 2005, số 1, tr.69-71.<br /> 3. Christiane K. Fæste, Christin Plassen.<br /> Quantitative<br /> sandwich<br /> ELISA<br /> for<br /> the<br /> determination of fish in foods. Journal of<br /> Immunological Methods. 2008, (329), pp.45-55.<br /> 4. Jeffre C. Johnson, Jeanette M. Van Emon,<br /> Ann N. Clarke, Brad N. Wamsley. Quantitative<br /> ELISA of polychlorinated biphenyls in an oily soil<br /> matrix using supercritical fluid extraction.<br /> Analytica Chimica Acta. 2001, 428, pp.191-199.<br /> <br />