intTypePromotion=3

Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atra

Chia sẻ: Nguyễn Triềuu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

0
14
lượt xem
1
download

Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atra

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và tối ưu hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên in vitro.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phát triển bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najia atra

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISA<br /> ĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA<br /> Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***<br /> Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam<br /> (Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọc<br /> rắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác định<br /> ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)<br /> của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng<br /> (LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.<br /> * Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.<br /> <br /> Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection of<br /> Chinese Cobra (Naja atra) Venom<br /> Summary<br /> Objective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebite<br /> victims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed using<br /> horse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well as<br /> limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test for<br /> were 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analytical<br /> sensitivity, reproducibility and accuracy.<br /> * Key words: Venom; Naja atra; ELISA.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Với nạn nhân rắn độc cắn, việc đánh<br /> giá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợ<br /> cho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân<br /> (BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanh<br /> kháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.<br /> Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độc<br /> <br /> đối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,<br /> với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựa<br /> vào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹ<br /> điều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,<br /> có sự khác nhau giữa các trung tâm<br /> điều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệm<br /> xác định nọc rắn định tính và định lượng<br /> được xem là cơ sở khoa học khách quan,<br /> <br /> * §¹i häc Y Th¸i B×nh<br /> ** Häc viÖn Qu©n y<br /> *** BÖnh viÖn B¹ch Mai<br /> Người phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015<br /> <br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắn<br /> trên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượng<br /> nồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đối<br /> chiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiện<br /> của một số triệu chứng, bác sỹ điều trị có<br /> thể đánh giá một cách khách quan hơn<br /> mức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, có<br /> thể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sử<br /> dụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệu<br /> cho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phương<br /> pháp phân tích miễn dịch dựa trên tương<br /> tác giữa kháng nguyên và kháng thể, với<br /> một số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phân<br /> tích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gian<br /> thực hiện không kéo dài, có thể thực hiện<br /> đồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiện<br /> từng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,<br /> chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưu<br /> hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ<br /> thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn<br /> Hổ mang Naja atra trên in vitro.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> * Sinh phẩm, hóa chất:<br /> - Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).<br /> - Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắn<br /> Hổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thể<br /> IgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra<br /> (Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),<br /> kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).<br /> - Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...<br /> (Hãng Sigma và Merck).<br /> * Dụng cụ, thiết bị:<br /> - Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,<br /> 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.<br /> - Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.<br /> - Phiến ELISA 96 giếng (Corning).<br /> - Tủ ấm.<br /> - Máy đo mật độ quang DTX 880<br /> (Beckman Coulter).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Nguyên lý phản ứng:<br /> <br /> Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.<br /> 39<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Thiết kế phản ứng dựa dựa trên<br /> nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich<br /> (hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)<br /> là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ<br /> <br /> 1. Xác định các điều kiện tối ƣu của<br /> phản ứng.<br /> <br /> mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắt<br /> giữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phản<br /> ứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứ<br /> hai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thể<br /> đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưng<br /> có nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;<br /> kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lại<br /> kháng thể phát hiện, được gắn enzym<br /> horse-radish peoxidase (HRP).<br /> * Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISA<br /> định lượng nọc rắn:<br /> - Xác định các điều kiện tối ưu của phản<br /> ứng.<br /> - Xây dựng đường chuẩn tương quan<br /> tuyến tính giữa mật độ quang (OD) của<br /> dung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắn<br /> chuẩn.<br /> - Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.<br /> - Xác định độ ổn định của bộ kít bằng<br /> cách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữa<br /> các lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.<br /> - Xác định độ đúng của kỹ thuật bằng<br /> cách tính toán tỷ lệ phục hồi (%) sau khi tiến<br /> hành định lượng trên mẫu chuẩn với nồng<br /> <br /> Nhằm đạt độ nhạy và độ chính xác cao<br /> nhất khi phân tích bằng phương pháp<br /> ELISA, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết<br /> quả phân tích cần được khảo sát. Dưới đây<br /> là một số thông số để phản ứng đạt được<br /> mật độ quang (OD) tối ưu và phù hợp nhất<br /> cho phản ứng bao gồm:<br /> - Nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch FBS.<br /> - Nồng độ kháng thể gắn bản (IgG ngựa<br /> kháng nọc rắn) 10 µg/ml.<br /> - Nồng độ kháng thể phát hiện (IgG thỏ<br /> kháng nọc rắn) 5 µg/ml.<br /> - Kháng thể gắn enzym pha loãng ở tỷ lệ<br /> thể tích 1:10.000 trong dung dịch PBS-T<br /> (0,05% Tween).<br /> - Dung dịch blocking: gelatin 1%.<br /> - Nồng độ cơ chất 0,5 mg/ml OPD pha<br /> trong đệm citrate có bổ sung 0,006% H2O2.<br /> - Thời gian ủ mẫu 60 phút, ủ kháng thể<br /> phát hiện 30 phút, ủ kháng thể gắn enzym<br /> 30 phút và ủ cơ chất 10 phút.<br /> - Nhiệt độ áp dụng 37oC.<br /> 2. Xây dựng đƣờng chuẩn.<br /> <br /> lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên nạn<br /> <br /> Tổng số nọc rắn 1 mg/ml, pha thành các<br /> nồng độ: 100 ng/ml; 31,6 ng/ml; 10 ng/ml; 3<br /> ng/ml; 1 ng/ml và 0,3 ng/ml (pha trong dung<br /> dịch FBS). Qua nghiên cứu, chúng tôi đã<br /> <br /> nhân đã được chẩn đoán xác định là bị rắn<br /> <br /> xây dựng được khoảng tuyến tính từ 0,3 -<br /> <br /> Hổ mang Naja atra cắn. Do đó, trong nghiên<br /> <br /> 31,6 ng/ml có OD từ 0,06 - 0,6 (R2 = 0,999;<br /> <br /> cứu này, chúng tôi không tiến hành khảo sát<br /> <br /> hình 2).<br /> <br /> độ nọc rắn đã biết.<br /> Mục đích phát triển bộ kít là nhằm định<br /> <br /> độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kít đã xây<br /> dựng.<br /> <br /> 40<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Nång ®é näc r¾n chuÈn<br /> <br /> Bảng 1: Độ nhạy của bộ kít ELISA (LOD<br /> và LOQ).<br /> L O D<br /> <br /> L O Q<br /> <br /> O D<br /> S è<br /> c h ø n Sg D<br /> g iÕ n g<br /> © m<br /> <br /> Nồng<br /> <br /> Nồng<br /> <br /> độ<br /> <br /> OD<br /> <br /> MËt ®é quang OD<br /> <br /> 24<br /> <br /> 0,073<br /> <br /> 0,001 0,075<br /> <br /> độ<br /> <br /> OD<br /> <br /> (ng/ml)<br /> 0,82<br /> <br /> (ng/ml)<br /> 0,083<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> Như vậy, LOD của phản ứng có mật độ<br /> Hình 2: Đồ thị đường chuẩn của<br /> phản ứng.<br /> <br /> quang 0,075 và LOQ là 0,083. Dựa theo<br /> đường chuẩn, LOD, tính theo nồng độ của<br /> nọc rắn tổng số là 0,87 ng/ml và LOQ tương<br /> ứng là 1,27 ng/ml.<br /> 4. Kết quả xác định độ ổn định và độ<br /> đúng của phƣơng pháp.<br /> Bảng 2: Hệ số biến thiên.<br /> M<br /> M É u<br /> Mo (ng/ml)<br /> t h ö<br /> <br /> H Ö<br /> c ñ a<br /> <br /> l Ë p<br /> <br /> Hình 3: Phản ứng ELISA với mẫu<br /> nọc rắn chuẩn.<br /> 3. Xác định ngƣỡng phát hiện của bộ<br /> kít.<br /> Độ nhạy của phản ứng được đại diện bởi<br /> giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)<br /> và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of<br /> Quantification). LOD là lượng thấp nhất chất<br /> cần thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện<br /> được mà không nhất thiết phải xác định<br /> chính xác hàm lượng. LOQ là lượng thấp<br /> nhất chất cần thử có trong mẫu thử còn có<br /> thể xác định được với mức độ đúng và<br /> chính xác thích hợp.<br /> <br /> (ng/ml)<br /> <br /> t h iª n<br /> (<br /> <br /> ® é<br /> ® Þn h<br /> (<br /> <br /> 1<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14,93 ± 0,38<br /> <br /> 2,12<br /> <br /> 97,88<br /> <br /> 2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 44,18 ± 0,62<br /> <br /> 1,4<br /> <br /> 98,6<br /> <br /> 3<br /> <br /> 75<br /> <br /> 74,15 ± 1,67<br /> <br /> 2,25<br /> <br /> 97,75<br /> <br /> 1,92<br /> <br /> 98,1<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> Độ ổn định được thể hiện bằng hệ số<br /> biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng<br /> với mẫu nọc rắn chuẩn. Trong nghiên cứu<br /> này, chúng tôi xác định hệ số biến thiên (CV:<br /> coefficient of variation) sau khi thực hiện lặp<br /> lại phản ứng 6 lần trên cùng một khay phản<br /> ứng ELISA, bằng cách sử dụng công thức<br /> tính toán: CV = SD/M x 100 (%), trong đó, M<br /> <br /> Từ mật độ quang của mẫu chứng âm, độ<br /> nhạy của phản ứng được tính toán và trình<br /> bày ở bảng 1.<br /> 41<br /> <br /> là giá trị nồng độ đo được dựa vào đường<br /> chuẩn, SD là độ lệch chuẩn.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br /> <br /> Bảng 3: Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn.<br /> M<br /> <br /> T û<br /> <br /> M É u<br /> Mo (ng/ml)<br /> <br /> c ñ a<br /> <br /> h å i<br /> <br /> o<br /> <br /> x<br /> <br /> t h ö<br /> t h ù c (ng/ml)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14,68 ± 1,16<br /> <br /> 97,8<br /> <br /> 2<br /> <br /> 45<br /> <br /> 44,5 ± 2,7<br /> <br /> 98,88<br /> <br /> 3<br /> <br /> 75<br /> <br /> 73,48 ± 3,58<br /> <br /> 97,97<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> đúng của phương pháp, được tính theo<br /> công thức: M/Mo x 100, trong đó M là giá trị<br /> đo được dựa vào đường chuẩn, Mo là giá trị<br /> thực (nồng độ mẫu chuẩn đã biết trước). Để<br /> xác định tỷ lệ phục hồi và độ lặp lại giữa các<br /> lần thực hiện độc lập nhau (cùng một quy<br /> trình và do 3 người khác nhau thực hiện,<br /> mỗi người lặp lại 3 lần), mẫu nọc rắn chuẩn<br /> được pha ở 3 nồng độ 15 ng/ml; 45 ng/ml và<br /> 75 ng/ml (trong dung dịch FBS).<br /> Với tỷ lệ phục hồi 98,22% và hệ số biến<br /> thiên trung bình trong cùng lần thực hiện<br /> phản ứng là 1,92% cho thấy phương pháp<br /> <br /> 42<br /> <br /> Đã phát triển được bộ kít ELISA định<br /> lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Naja atra<br /> sử dụng hai nguồn kháng thể đặc hiệu nọc<br /> rắn Hổ mang Naja atra từ thỏ và ngựa. Bộ<br /> kít đạt được các chỉ tiêu về độ nhạy, độ ổn<br /> định và độ đúng.<br /> <br /> 98,22<br /> <br /> Tỷ lệ phục hồi là đại lượng đánh giá độ<br /> <br /> đạt độ đúng và độ ổn định cao.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> 1. Lê Văn Đông và CS. Nghiên cứu chế tạo<br /> bộ xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn<br /> ở Việt Nam. Báo cáo kết quả đề tài. Học viện<br /> Quân y, Bộ Quốc phòng. 2010.<br /> 2. Nguyễn Văn Cường và CS. Phát triển<br /> phương pháp xác định tồn dư 2,4-D trong hoa<br /> quả bằng kỹ thuật ELISA. Nông nghiệp-Nông<br /> thôn-Môi trường. 2005, số 1, tr.69-71.<br /> 3. Christiane K. Fæste, Christin Plassen.<br /> Quantitative<br /> sandwich<br /> ELISA<br /> for<br /> the<br /> determination of fish in foods. Journal of<br /> Immunological Methods. 2008, (329), pp.45-55.<br /> 4. Jeffre C. Johnson, Jeanette M. Van Emon,<br /> Ann N. Clarke, Brad N. Wamsley. Quantitative<br /> ELISA of polychlorinated biphenyls in an oily soil<br /> matrix using supercritical fluid extraction.<br /> Analytica Chimica Acta. 2001, 428, pp.191-199.<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản