Nghiên cứu sản xuất Ecotin miniproinsulin từ tế bào Escherichia Coli tái tổ hợp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng dòng tế bào E. coli tái tổ hợp (đã được tạo ra từ nghiên cứu trước) để xây dựng quy trình sản xuất ecotin-miniproinsulin (EMPI) ở quy mô phòng thí nghiệm sau đó, sản xuất insulin người giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu trong nước.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu sản xuất Ecotin miniproinsulin từ tế bào Escherichia Coli tái tổ hợp

N G H IỀ N C Ứ U S ẢN X U Ấ T E C O T IN M INIPROINSULIN T Ừ T Ế B À O ESCHERICHIA COLI T Á I T H P Ths. M ai H ư ng Trà* H ư ở ng dẫn: T S. Võ M in h Trí** TÓM TẴT Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose trong máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, cơ thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ãn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh... Bệnh xảy ra do hormone insulin của tuyển tụy bị thiếu hoặc insulin đủ nhưng hoạt động kém hiệu quà (Glesỉie R.D, 1994). Những nghiên cứu trên thể giới cho thấy rằng Ecotin, protein ức chế trypsin ờ E. coỉi được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một Ư nh tự tiết nằm ở đầu N của Ecotin. Bằng cách đung hợp tr nh tự tiết và tr nh tự mã hóa Ecotin vào đầu N của proinsulin th proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất và sự tái gấp cuộn của proinsulin có hiệu quả cao so với việc dung hợp với các peptide ĩín hiệu của các gen p lB, dsbA, hay om pĩ (Ajamaluddin Maỉik t al, 2007). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử đụng đòng tế bào E. coli tái tổ hợp (đã được tạo ra từ nghiên cứu trước) để xây dựng quy tr nh sản xuất ecotinminiproinsulin (EMPI) ờ quy mô phòng thí nghiệm sau đó, sản xuất insulin người giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu trong nước. Kếỉ quả cho thấy: hàm lượng ecolinMPI thu được sau lên men là 20,4mg/l trong môi inrờng có bổ sung ethanol 1% và sau khi tinh sạch là 13,87mg/l, với hiệu suất thu hồi đạt 68%. * Từ khóa: Đái tháo đường; Ecotin miniproinsulin; Insulin; Esch richia coli tái tổ họp. Pr paration of Ecotin - miniproinsulin from r combinant Esch richm colỉ Summary Diabetes is a glucose metabolic disorder disease, causing an increase in high glucose in blood, which is due to deficiency o f pancreatic insulin or inefficient insulin (Glesiie R.D, 1994). N ative proinsu in belongs to theclassof the difficulttoexpress proteins in Escherichia coli. In this study, we used E. coli recombinant cell lines (that had been created from the previous study) to develop an Ecotinminiproinsulin (EMPI) manufacturing process in the laboratory scale, which aimed to produce human insulin at cheap cost which can meet domestic demand. The results showed that the level of MPI ecotinobiained after fermentation was 20.4 mg/1 in medium supplemented with ethanol 1% and after purification was 13.87 mg/ , with 68% of recovery yield. * Key words: Diabetes, Ecotin miniproinsulin; insulin; Recombinant Esch richia coli. I. Đ Ặ T V Ấ N Đ È Số lượng bệnh nhân ĐTĐ ngày càng gia tăng khiên nhu cầu cần insulin là rất lớn. Tuy nhiên, nguồn insulin trích từ động vật không đủ và có nhiều rủi ro nên việc sản xuất insulin người bằng protein tái tổ hợp đã và đang là giải pháp hiệu quả nhất hiện nay. Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn Gram âm E. coli là một trong những ưu tiên làm tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng ecotin ở E. coli được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một tr nh tự tiết nằm ở đầu N. Bằng cách dung hợp tr nh tự tiết và tr nh tự mã hóa ecotin vào đầu N cùa proinsulin, proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất, giứp pronsulin có cấu h nh tự nhiên. M ặt khác, khi đung họp vói tín hiệu tiết là ecotin th hiệu suất proinsulin thu được cao hơn hẳn so với dung hợp các peptide tín hiệu của các gen p lB, dsbA , hay ompT với năng suất đạt được ỉà 51 mg proinsuỉin/1 dịch lên men (Ajamaluddin M alik t al, 2007). n . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Vật liệu Chủng chủ E. colỉ B834(DE3) [F~ompT hsdSiiịrũmũ) gal dcm m t (DE3)] được dùng để nghiên cứu biểu hiện gen trong plasmid pET43EMPI và lên men ở quy mô phòng thí nghiệm. * Đại học Lạc H ồng ** Đại học Khoa học T ự n h iên TP. Hồ C h í M inh 593
2.2. P hư on g p h áp 2.2.1. C m ứng biểu h i n ecotỉn - M P I trong phân đoạn chu chất của E. coli a. Tạo shock thẩm thấu và kiểm tra khả năng tiết cùa cotin-M PỈ trong chu chất Thu 1,5 ml dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng IPTG vào eppendorf. Ly tâm 10.000 vòng, 5 phút. Sinh khối được huyền phù trong 200 ịú dung dịch chứa sucrose 25%, TrisHCl 0,3M, M gCl2 0,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8. Đễ eppendorf ở nhiệt độ phòng 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 5 pht t, 4°c. Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 100 |*i dung dịch đã làm lạnh chứa M gCl20,5 H Í, EDTA 1 mM, TrisHCI 10 mM, pH 8, để trong đá 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 15 phứt, 4°c. Dịch nổi (phân đoạn chu chất) được thu nhận (Ajamaluddin M alik và c s , 2007). Phân tích sự hiện diện cùa ecotm M PĨ trong chu chất bằng điện di SDSPAGE. b. Xác nhận prot in dung hợp cotin~MPI bằng W st rn blot Gồm các bước chuyển màng, khóa màng, phát hiện protein bắt đặc hiệu vói kháng thể kháng HƯ118 và hiện phim. 2.2.2. K hảo sát ản h hưởng củ a điều kiện nuôi cấy và cảm ứng đến biểu hiện ecotinM PĨ trong chu chất a. Ảnh hưởng cửa thông khí Để xác định ảnh hưởng của thông khí đến khả năng sinh tổng hợp ecotinMPI, chủng được nuôi cấy ở tốc độ lắc 200 vòng/phút với các thể tích khác nhau từ 25 200 ml trong erlen 500 ml. Cảm ứng sự biểu hiện ecotinMPI với nồng độ IPTG 0,5 mM trong 24 giờ ở 25°c. ứ n g với mỗi điều kiện, thu sinh khối từ 1,5 ml dịch nuôi cấy để kiểm tra mức độ hiện diện của ecotinMPI trong chu chất bằng điện di SDSPAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Chủng được nuôi cấy và cảm ứng tổng hợp ecotinMPI tương tự như mục a (dung tích nuôi cấy là 150 ml trong b nh erlen 500 ml), ở 3 nhiệt độ cảm ứng khác nhau là 25°c, 30 °c v à 37°c. Thu mẫu và phân tích mức độ hiện diện của ecotinM PI trong chu chất tương tự như mục a. c. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG Chủng được nuôi cấy với điều kiện tương tự mục b nhưng được cảm ứng bằng các ĩ ồng độ IPTG khác nhau là 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM và 1,0 mM ở 2 5°c trong 24 giờ để phân tích mức độ biểu hiện ecotin MPI trong chu chất. d. Ảnh hưởng của thanol Chủng được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, 4 % hoặc 5% ethanol với các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng và phân tích tương tự như mục a. 2.2.3. L ên m en chững E. coli B 834(Đ E3)/pET43EM PI để tổng h ợ p eotirtM PI b ằn g hệ thống lên m en tự động Chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI được lên men trong 2 môi trường labo và ỉabo + ethanol 1% để tổng hợp ecotinMPI bằng hệ thống lên men tự động BioTronLiFIus GX GX05 12302. Giống cấp ỉ được cấy vào hệ thống lên men theo tỷ lệ 1/20. Giống được tăng sinh ở 37°c đến khi OD600llm đạt 0,8 1. Bổ sung ĨPTG vào b nh lên men cho đạt nồng độ 0,5 mM. N gây sau khi cảm ứng, nhiệt độ b nh lên men được điều chỉnh xuống 25°c. Tiếp tục lên men trong 24 giờ. M âu được thu cách nhau 2 giờ bắt đầu từ lúc cấy giống vào b nh lên men để phân tích sinh khối khô và ỉượng ecotinM PI tạo ra. Các thông sổ lên men được kiểm soát trong quá tr nh lên men như sau: pH: 7,1 (chỉnh pH tự động bằng NaOH hoặc HCỈ) DO: 100%, tốc độ kh í vào (air inlet): 1 vpm, tốc độ khuấy: 250 rpm. 594
2.2.4. Tinh chế ecotinMPI EcotinMPI được biểu hiện bằng hệ thống pET43EMPI trong chu chất cùa E. coli ở dạng tan. V thế, protein này được tinh chế ở điều kiện tự nhiên, pH hơi kiềm bằng phương pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Ni NTA và hệ thống tinh chế HPLC. Protein mục tiêu sẽ được dung ỉy khỏi cột ở điều kiện pH hơi kiềm và nồng độ imidazole cao. r a . K Ế T Q UẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tối ư u h óa các điều kiện nuôi cấy để nãng cao biểu h iện M P I đ u n g h ợ p với ecotin tro n g chu ch ấ t E. coli Trong quá tr nh ỉên men, một số các yếu tố vật lý như nhiệt độ, độ thông khí đã ảnh hưởng lỏn đến phát triển của vi sinh vật và sản xuất các chất chuyển h ó a... Ngoài ra, để sản xuất các protein tái tổ hợp từ các chủng biểu hiện, nồng độ các chất cảm ứng cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá tr nh tổng hợp chúng. M ặt khác, ảnh hưởng của chất bổ sung vào trong môi trường trong suốt quá tr nh nuôi cấy cũng làm tăng hiệu suất protein dung hợp. Ở đây, chúng tôi khảo sát các yểu tố thông khí, nhiệt độ, nồng độ IPTG và sự bổ sung ethanol trong môi trường nuôi cấy lên sự tổng hợp ecotinMPI. 3.1.1. Ả n h hư ởng của sự thông k h í Kết quả ở h nh 1 cho thấy độ thông khí có ảnh hường nhưng không lớn đến khả năng biểu hiện ecotin MPI. Trong nghiên cứu này, binh mà dịch nuôi cấy chiếm khoảng từ 15 30% thể tích binh nuôi cấy (hình , giếng 4, giếng 5) th hàm lượng protein ecotinMPI lớn hơn so với ecotinM PI thu được ở các b nh có lượng dịch nuôi chiém khoảng 5% và 40% (hình 1, giểng 2, giếng ố). Từ kết quả trên, độ thông khí thích hợp được chọn cho sinh tổng hợp ecotinM PI là lượng dịch nuôi cấy chiếm 15 30% thể tích b nh nuôi cấy. kD a 1 2 3 5 6 H nh 1. Ảnh hường của độ thoáng khí đến khả năng biểu hiện ecotinMPI trong chu chất. 1, Thang protein chuẩn; 26, Protein tái tổ hợp 30__ — E trong các thể tích nuồi cấy 25, 50, 75, 150 và 200 mỉ/ thể tích b nh 500 mi 3.1.2.Ả n h hư ởng của nhi t độ n uôi cấy Kết quả cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp trong chu chất. Ở 30°c, lượng protein tái tổ hợp thu được sau khi nuôi cấy không cao. V vậy, có thể nói nhiệt độ trên không thích hợp cho chủng B834(DE3)/pET43EMPI biểu hiện protein tái tổ họp. Ổ 37°c, đây là nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của E. coỉi, không phải là điều kiện tối ưu để tạo sản phẩm. M ặt khác, 37°c là nhiệt độ thích hợp đối với sự hoạt động của nhiều protease. Còn ở 25°c cho thấy vạch protein ecotinMPI đậm nỉiắt ứng vói điều kiện khảo sát ở 25 °c (hình 2, giếng 4) chứng tỏ đây là nhiệt độ thích hợp để biểu hiện ecotinMPI trong chu chất của chủng B834(DE3)/pET43EMPĨ. 595
I'D* 1 2 3 4 5 H nh 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng biểu hiện ecotinMPI trong chu chất. 1, Thang protein chuẩn; 24, Protein tái tổ họp được 3 » EMPI chuẩn; 2, 0,25 mM; 3 ,0 ,5 mM; 4 ,0,7 5 mM; 5, ỉ mM; 6, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG 3.1.4. Ả n h hưởng của bổ sung ethanol vào m ôi trư ờng nuôi cấy Kết quả điện di protein trên h nh 4 cho thấy khi bổ sung ethanol vói nồng độ 1 2%, lượng protein tái tổ T) em tin M P ĩ hiển hiên írn nơ rh n r.hát tănơ lốn ítánrr líi th i Kỉốti kằnr> /= * A A> ĩ r í ~ u n t\ biểu hiện của protein này bị ức chế hoàn toàn ở 4 5% ethan ol Như vậy, việc bổ sung ethanol 1 2% (v/v) sẽ làm tăng năng suất biểu hiện protein ecotinMPI trong chu chất. kDa 1 2 3 4 5 6 7 wp H nh 4. Ảnh hưởng của ethanol (%) trong môi trường nuôi cấy lên sự biểu hiện ecotinMPI ở 30— EMPĨ E. coll B834(DE3)/pET43EMPI. 1, Thang protein I I I chuẩn; 2,0% ; 3 , 1%; 4,2% ; 5,3% ; 6,4% ; 7,5% . 3.2. L ê n m en tỗng h ợp và thu nhận ecotin-M PI bằng h thống lên m en tự động Kết quả theo dõi động học tăng tnrởng của chủng trên {hình 5) cho thấy chủng b ắt đầu vào giai đoạn tăng trường hàm mũ sau 4 giờ cấy giống cấp 1 và kết thúc tại 16 giờ. Sinh khối tế bào đạt cực đại tại thời điểm 16 giờ nuôi cấy vói sinh khối khô thu được tại thời điểm này là 2,6 g/I trên môi trirờng LB và 2,8 g/1 trên môi trường LB bổ sung ethanol 1%. 596
Đưửng cong ting tiuửng cùa chủng trên 2mâi tnràmo H nh 5. Động học tăng trường của chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI HtMglMi(ató> Để đánh giá khả năng biểu hiện protein dung họp ecotinMPI của chủng B834(DE3)/pET43EMPI khi lên men mẻ trên môi trường LB cõng như trên môi trường LB + ethanol 1%, chóng tôi thu mẫu chu chất trong quá tr nh nuôi cấy ở các thời điểm 16 giờ, 18 giờ, 22 giờ và 24 giờ kiểm tra mức độ biểu hiện bằng SĐS PAGE và khẳng định lại bằng W estern blot cũng như định lượng EMPI trong chu chất bằng phần mềm Quantity OneImagine J và phương pháp Bradford. 1234 s 6 7 8 9 to 1 2 3 4 Ỉ 6 7 8 9 I 0 H nh 6. Biểu hiện ecotinM PI trong chu chất E.coli theo thời gian nuôi cấy. SDS PAGE (A); Western blot (B). 6, Thang protein chuẩn; 1: Trước cảm ứng; 25: 16, . EMPI 18, 22, 24 giờ sau nuôi cấy ờ môi trường; 710: 16, 18, 22, 24 giờ sau nuôi cấy ở môi trường LB + ethanol \% . A B Kết quả phân tích ecotinM PI bằng SDSPAGE cho thấy có sự xuất hiện c ủa vạch protein ecotinM PI (khoảng 30 kDa) ở các giếng 2 đến 5 (môi trường LB) và ờ các giếng 7 đến 10 (môi trường LB + ethanol 1%) (H nh 6). Đ ây là các mẫu protein thu được ở phân đoạn chu chất khi cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ờ những khoảng thời gian khác nhau. Trong khi ở m ẫu đối chứng âm không có vạch này (H nh 6, giếng 1). M ặt khác, trên bản phim (H nh 6B) mỗi giếng xuất hiện một vạch tín hiệu tương ứng với các vạch protein trên bản geỉ SDSPAGE chứng tỏ các vạch protein này là ecotinMPI. Mức độ biểu hiện ecotinMPI của chủng khi lên men mẻ là rất tốt thể hiện qua đậm độ và kích thước tương đối của vạch ecotinMPI so với các vạch protein khác trên cùng một giếng. 64.77 sM ô itru òn glB B iểu đồ 1. % EMPĨ trong phân đoạn (%EMÍ>I) 56.3 chu chất sau các thời điểm nuôi cấy khác nhau trên 2 môi trường (Dựa vào HMôitmòngLB + phần m ềm Q uantity OneIm agineJ) ethanol 1% (%EMPI) lổ giờ 18giờ 22giờ 24giờ D ựa vào biểu đồ 1 cho thấy hàm lượng EM PI thu được trong phân đoạn chu chất cao nhất ờ thời điểm 22 giờ nuôi cấy trên môi trường LB (chiếm 60,45% protein trong chu chất) và ở thời điểm 18 giờ nuôi cấy trên môi trường LB + ethanol 1% (chiếm 64,77% protein trong chu chất). M ặt khác, hàm lượng protein tổng trong phân đoạn chu chất ờ các thời điểm nuôi cấy trên cũng được tính toán dựa vào phương pháp Bradford để định lượng EM PI có trong phân đoạn này (biểu đồ 2). 597
35 ] 3 .5 3 0 _| . — I — -H àm luọiiạ ị - protein trỄnmòi 2Q 1 23 8 25,5 25 8 25'^ te l) B iểu đồ 2. Hàm lượng protein ^ I tổng trong chu chất trên 2 môi ị Hõm Itỉợnạ truờ ng ở các thời điểm nuôi cấy _ j protein tiên môi Ị ímòiiạLB +• 0 4 , T T1 eỉtiBiiõl i°0 16 giờ 18giớ 22giố' 24g iờ Từ biểu đồ 1 và 2 suy ra: Hàm lượng protein EMPI thu được nhiều nhất trên môi trường LB là: 60,45% X 25,8 = 15,6 mg/1. Hàm lượng protein EMPĨ thu được nhiều nhất trên môi trường LB 4 ethanol 1% là: 6 4 ,77 % X 31,5 = 2 0 ,4 m g/l 3.3. T ìn h chế ecotin-M P Sau khi ỉên men chủng B834(DE3)/pET43EMPI và thu nhận được protein tái tổ hợp ecotinMPI dung hợp với Ehẻ 6xHis trong phân đoạn chu chất, chúng tôi tiển hành tinh chể ecotinMPI bằng sắc ký ái lực chuyên biệt trên cột NiNTA. Phân đoạn có protein ecotinMPI được phân tích trên SDSPAGE để kiểm tra độ tinh sạch (hình 7, giếng 4). H nh 7. Kết quả tinh chế ecotinMPI bằng cột NiNTA. SDSPAGE (A); Western blot (B). 1, Thang phân tử lượng protein; 2, Phân đoạn sau khi qua cột; 3, Phấn đoạn rửa cột; 4, Phân đoạn sau khi dung ỉy A B Kết quả SDSPAGE cho thấy quá tr nh tinh chế ecotinMPI bằng cột NiNTA đã loại bỏ phần lớn thành phần protein cùa chu chất E.coli. Nhiều vạch protein trong địch chu chất đã bị mất khi qua sắc ký ái lực (hình 7A, giếng 2, 3), Trong phân đoạn dung ly thu được một vạch đậm duy nhất có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa tương ứng vói vạch protein ecotinMPI và được khẳng định bằng kết quả lai Western bỉot (hình 7B). Két quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy từ sinh khối của ỉ lít địch lên men chủng B834(DE3)/pET43EM PI đã thu nhận được 13,87 mg ecotinMPI tinh sạch tương ứng với hiệu suất thu hồi à 13,87/20,4 = 68%. V .K Ể T L U Ặ N Đã thực hiện thành công sự lên men chủng E. coỉi B834(DE3)/pET43EMPI và thu nhận protein đung hợp ecotinMPI ở quy mô 5 lít môi trường nuôi cấy (20,4 mg/1) trong hệ thống lên men tự động và tinh chế thành công ecotinMPĩ băng một bước sắc kỹ ái lực đùng cộtNiNTA (13,87 mg/l), đạt hiệu suất 68%. T À I LIỆ U T H A M K H Ả O 1. Gleslie R.D., í 994. Y học thường thức bệnh đái tháo đường. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh, 200 írang. 2. Ajamaluddin Malik, Marco Jenzsch, Andreas Lubbert, Rainer Rudolph, (2007). Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to Esch richia coli ecotin. Prot in xpr ssion and purification 55:100111. 598