Nghiên cứu tách chiết nhóm cấu tử tạo hương và xác định hoạt tính sinh học của chúng trong tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE<br /> Natural Sci. 2017, Vol. 62, No. 3, pp. 42-50<br /> This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn<br /> <br /> DOI: 10.18173/2354-1059.2017-0006<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT NHÓM CẤU TỬ TẠO HƯƠNG VÀ XÁC ĐỊNH<br /> HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG TRONG TINH DẦU VỎ QUẢ QUÝT LẠNG SƠN<br /> <br /> Nguyễn Văn Lợi<br /> Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, Minh Khai, Hà Nội<br /> Tóm tắt. Sử dụng phương pháp sắc kí cột, hệ dung môi rửa giải n-hexan/dietyl ete với tỉ lệ<br /> =1/1 từ 4 mL tinh dầu vỏ quýt Lạng Sơn đã tách chiết được 0,25 mL dịch sánh đặc màu vàng<br /> đậm, có mùi thơm đặc trưng (phân đoạn 2). Bằng phương pháp GC-MS đã xác định được<br /> 10 cấu tử chính từ phân đoạn này như: octanal, citronellal, decanal, neral, linalyl acetate,<br /> dodecanal, geranial, α-sinensal, β-sinensal và geranyl acetate. Kết hợp với phương pháp<br /> đánh giá cảm quan A không A đã khẳng định rằng đây chính là nhóm cấu tử tạo hương<br /> trong tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn. Bên cạnh đó cũng đã xác định được một số hoạt tính<br /> sinh học của nhóm cấu tử tạo hương trong phân đoạn 2, khả năng quét gốc tự do DPPH<br /> (38,17 ± 0,22%) và khả năng kháng 4 chủng vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus aureus,<br /> Bacillus cereus, Escherichia coli và Salmonella typhi.<br /> Từ khóa: Nhóm cấu tử tạo hương, hoạt tính sinh học, tách chiết, tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Cây quýt có tên khoa học là Citrus reticulata Blanco var. tangerine. Ở Việt Nam quýt được<br /> trồng ở nhiều nơi, có nhiều giống tốt cho năng suất cao và chất lượng tốt. Cây quýt thích nghi với<br /> điều kiện nhiệt đới, nó ít bị sâu bệnh hơn cam. Cây quýt trước đây chỉ được trồng ở huyện Bắc<br /> Sơn, tỉnh Lạng Sơn, hiện nay được trồng ở tất cả các huyện của tỉnh Lạng Sơn. Loại quýt này<br /> thường cho năng suất cao, quả chín có màu vàng, múi chứa nhiều nước và có vị ngọt. Vỏ quýt<br /> thường mỏng, có chứa túi tinh dầu, mùi thơm dễ chịu. Trong tinh dầu vỏ quả quýt có chứa nhiều<br /> cấu tử thuộc nhóm tecpen và dẫn xuất chứa oxi của tecpen, có vai trò quan trọng trong công<br /> nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm [1]. Tuy nhiên chỉ có một vài cấu tử chính có giá trị và tạo mùi<br /> thơm đặc trưng cho tinh dầu vỏ quả quýt. Ở Việt Nam hiện nay có rất ít công trình nghiên cứu và<br /> xác định các cấu tử tạo mùi thơm đặc trưng trong tinh dầu vỏ quả quýt. Trong khi đó nhu cầu về<br /> thông tin, dữ liệu các cấu tử tạo mùi đặc trưng trong tinh dầu vỏ quả quýt sử dụng cho mục đích<br /> hương liệu thực phẩm và mỹ phẩm là rất cần thiết. Nghiên cứu này đã đưa ra quy trình tách chiết<br /> và xác định hoạt tính sinh học của nhóm các cấu tử tạo mùi thơm đặc trưng trong tinh dầu vỏ quả<br /> quýt Lạng Sơn, làm phong phú thêm nguồn tư liệu về quả quýt ở nước ta.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 18/11/2016. Ngày nhận đăng: 8/3/2017.<br /> Tác giả liên hệ: Nguyễn Văn Lợi, địa chỉ e-mail: loichebien@yahoo.com<br /> <br /> 42<br /> <br /> Nghiên cứu tách chiết nhóm cấu tử tạo hương và xác định hoạt tính sinh học của chúng trong tinh dầu…<br /> <br /> 2. Nội dung nghiên cứu<br /> 2.1. Thực nghiệm<br /> 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> Tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn được khai thác bằng phương pháp trích lí bằng etanol 95%<br /> và được làm khan bằng Na2SO4 khan. Dung môi sử dụng để tách chiết cấu tử tạo hương là n-hexan<br /> và dietyl ete. Mẫu tinh dầu chuẩn được ép cơ học trong môi trường lạnh, ly tâm 2500 vòng/phút<br /> trong 5 phút, làm khan phần tinh dầu bằng Na2SO4 khan [4].<br /> 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Phương pháp tách chiết nhóm cấu tử tạo hương<br /> Tách chiết nhóm cấu tử tạo hương bằng phương pháp sắc ký cột được tiến hành với chất hấp<br /> phụ là silicagel Merck 60, cỡ hạt 100 - 160 mesh, được hoạt hóa ở nhiệt độ 105 oC, thời gian 24<br /> giờ, dung môi rửa giải là n-hexan và dietyl ete [2].<br /> - Phương pháp xác định nhóm cấu tử tạo hương<br /> Các cấu tử tạo hương trong tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn được xác định theo phương pháp<br /> GS-MS, bằng máy sắc ký khí GC6890-MS5898, cột mao quản HT-5MS, với chương trình thực<br /> hiện như sau: nhiệt độ cột 80 - 150 oC, tốc độ tăng nhiệt 3 oC/phút, giữ ở 5 phút và 150 - 220 oC<br /> tốc độ tăng nhiệt 8oC/phút, giữ ở 5 phút. Điều kiện MS: ion hóa mẫu ở thế ion hóa 70 eV, nhiệt độ<br /> duy trì 250 oC, khí mang là heli, tốc độ dòng 0,5 mL/phút, tốc độ chia dòng 1:50 [2, 3].<br /> - Phương pháp đánh giá cảm quan nhóm cấu tử tạo hương<br /> Sử dụng phép thử A không A, hội đồng đánh giá cảm quan được lựa chọn là 12 người, mỗi<br /> người được làm quen với mẫu A là mẫu tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn được tách chiết bằng<br /> phương pháp ép lạnh gọi là mẫu chuẩn. Mẫu không A là mẫu phân đoạn 1, phân đoạn 2 và phân<br /> đoạn 3. Mỗi thành viên hội đồng nhận được các cặp mẫu đã được mã hóa, trong mỗi cặp đó có 1<br /> mẫu A và 1 mẫu không A [4].<br /> - Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH<br /> Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền<br /> trong dung dịch etanol bão hòa. Mẫu thí nghiệm gồm có 0,1 mL dịch chứa các cấu tử tạo hương, 2<br /> mL etyl axetat, 1,9 mL metanol và 1 mL DPPH. Hỗn hợp sau khi phối trộn lắc nhẹ và để yên<br /> trong bóng tối ở nhiệt độ phòng 30 phút, đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm [5, 6]. Khả năng quét<br /> gốc tự do của mẫu được tính bằng công thức % DPPH = [(Ao - (A-Ab ))/Ao ] × 100 %, trong đó<br /> Ao : mẫu kiểm chứng, A: mẫu thí nghiệm, Ab: mẫu trắng.<br /> - Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán thạch<br /> Môi trường canh thang thường, kí hiệu MPA, gồm (g/L): Cao thịt (3,0), cao nấm men (5,0),<br /> pepton (10,0), muối ăn, (5,0), pha trong 1000 mL nước, pH = 6,5- 6,8. Sau khi thanh trùng, môi<br /> trường MPA được làm nguội 45 - 48oC, bổ sung vi sinh vật kiểm định với tỉ lệ 150l dịch chủng<br /> trong 30 mL môi trường MPA xốp, lắc đều và đổ vào đĩa pertri với chiều dày thạch là 5mm. Dùng<br /> khoan nút đục lỗ trên đĩa ( = 5mm). Dùng micropipet nhỏ vào mỗi lỗ 80l mẫu (nồng độ<br /> 50 mg/mL), sau đó đặt các đĩa đã nhỏ mẫu vào tủ lạnh ở 4 oC, để trong vòng 3 giờ chờ khuếch tán<br /> dịch. Tiếp theo chuyển đĩa vào tủ ấm 32 oC, đọc kết quả sau thời gian 24 giờ. Khả năng kháng<br /> khuẩn được xác định bằng công thức: D - d = BK trong đó D: đường kính vòng kháng khuẩn<br /> (cm), d: đường kính lỗ khoan thạch (cm), BK: bán kính vòng vô khuẩn (cm) [7-9].<br /> <br /> 2.2. Kết quả và thảo luận<br /> 2.2.1. Tách nhóm cấu tử tạo hương<br /> Cân 40 g silicagel để nhồi cột, hút 4 mL tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn đưa lên cột. Phân<br /> đoạn 1 được rửa giải với 340 mL dung môi n-hexan thì lớp trong suốt được tách ra. Phân đoạn 2<br /> 43<br /> <br /> Nguyễn Văn Lợi<br /> <br /> rửa giải với 320 mL dung môi n-hexan và dietyl ete tỷ lệ là n-hexane: dietyl ete = 1:1 thì lớp<br /> màu vàng đậm được tách ra khỏi cột. Phân đoạn 3 rửa giải với 350 mL dung môi dietyl ete thì<br /> lớp màu vàng nhạt được tách ra khỏi cột. Phân đoạn 1, cô quay 52 phút thì thu được 1,96 mL<br /> dịch trong suốt, không có mùi thơm. Phân đoạn 2, cô quay 15 phút thì thu được 0,25 mL dịch<br /> sánh đặc màu vàng đậm, có mùi thơm đặc trưng của tinh dầu vỏ quả quýt. Phân đoạn 3, cô quay<br /> 14 phút thì thu được 0,35 mL dịch màu vàng nhạt, có mùi thơm nhẹ. Quy trình tách chiết nhóm<br /> các cấu tử tạo hương được mô tả trên Hình 1.<br /> Tinh dầu vỏ quả quýt<br /> Lạng Sơn (4 mL)<br /> <br /> Phân đoạn 1:<br /> 1,96 mL<br /> <br /> Phân đoạn 2:<br /> 0,25 mL<br /> <br /> Rửa giải bằng dung môi nhexan (340 mL)<br /> <br /> Rửa giải bằng hệ dung<br /> môi n-hexan/dietyl ete<br /> = 1/1 (320 mL)<br /> Rửa giải bằng dung môi<br /> dietyl ete (350 mL)<br /> <br /> Phân đoạn 3:<br /> 0,35 mL<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ quy trình tách chiết nhóm các cấu tử tạo hương<br /> - Phân đoạn 1:<br /> + Xác định các cấu tử trong phân đoạn 1:<br /> Bằng phương pháp GC-MS đã xác định được 16 cấu tử trong phân đoạn tinh dầu vỏ quả<br /> quýt Lạng Sơn tách chiết với dung môi n-hexan (phân đoạn 1), kết quả được trình bày ở Bảng 1.<br /> Bảng 1 cho thấy các cấu tử trong phân đoạn tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn tách chiết bằng<br /> dung môi n-hexan, không có màu và trong suốt, thành chủ yếu là hidrocacbon. Trong các cấu tử<br /> này nhóm monotecpen có 11 cấu tử chiếm 74,42% (đặc biệt là một số cấu tử chiếm tỷ lệ cao<br /> như limonene: 15,06%, p-cymene: 12,14%, β-pinene: 10,54%, δ-3-carene: 7,89%...) và nhóm<br /> sesquitecpen có 4 cấu tử chiếm 24,76%, trong đó có một số cấu tử chiếm tỷ lệ cao như αfarnesene: 7,87%, valencene: 4,96%.<br /> <br /> Hình 2. Sắc kí đồ các cấu tử trong phân đoạn 1<br /> 44<br /> <br /> Nghiên cứu tách chiết nhóm cấu tử tạo hương và xác định hoạt tính sinh học của chúng trong tinh dầu…<br /> <br /> Bảng 1. Các cấu tử trong phân đoạn 1<br /> Stt<br /> <br /> Tên các cấu tử<br /> <br /> Thời gian lưu (phút)<br /> <br /> Tỉ lệ (%)<br /> <br /> 1<br /> <br /> nonane<br /> <br /> 2,269<br /> <br /> 6,06<br /> <br /> 2<br /> <br /> α-pinene<br /> <br /> 6,846<br /> <br /> 2,92<br /> <br /> 3<br /> <br /> camphene<br /> <br /> 7,118<br /> <br /> 3,73<br /> <br /> 4<br /> <br /> β-pinene<br /> <br /> 7,653<br /> <br /> 10,54<br /> <br /> 5<br /> <br /> sabinene<br /> <br /> 7,841<br /> <br /> 2,83<br /> <br /> 6<br /> <br /> δ-3-carene<br /> <br /> 8,056<br /> <br /> 7,89<br /> <br /> 7<br /> <br /> myrcene<br /> <br /> 9,923<br /> <br /> 2,96<br /> <br /> 8<br /> <br /> α-phellandrene<br /> <br /> 12,127<br /> <br /> 3,82<br /> <br /> 9<br /> <br /> α-terpinene<br /> <br /> 13,943<br /> <br /> 6,47<br /> <br /> 10<br /> <br /> p-cymene<br /> <br /> 14,905<br /> <br /> 12,14<br /> <br /> 11<br /> <br /> limonene<br /> <br /> 15,237<br /> <br /> 15,06<br /> <br /> 12<br /> <br /> α-cubebene<br /> <br /> 15,617<br /> <br /> 3,05<br /> <br /> 13<br /> <br /> δ-elemene<br /> <br /> 15,765<br /> <br /> 4,02<br /> <br /> 14<br /> <br /> β-bisabolene<br /> <br /> 15,893<br /> <br /> 4,86<br /> <br /> 15<br /> <br /> valencene<br /> <br /> 17,627<br /> <br /> 4,96<br /> <br /> 16<br /> <br /> α-farnesene<br /> <br /> 18,338<br /> <br /> 7,87<br /> <br /> Ghi chú. Tỉ lệ (%) tính theo diện tích pic sắc kí<br /> + Xác định mùi của phân đoạn 1:<br /> Để xác định mùi của phân đoạn 1, xét các cặp mẫu theo phương pháp A không A, kết quả<br /> được thể hiện ở Bảng 2.<br /> Bảng 2. Tổng hợp kết quả trả lời của nhóm người thử trên mẫu phân đoạn 1<br /> Người thử lựa chọn<br /> Mẫu giới<br /> thiệu<br /> <br /> A<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> Không A<br /> <br /> Giá trị<br /> quan sát<br /> <br /> Giá trị<br /> lí thuyết<br /> <br /> Giá trị<br /> quan sát<br /> <br /> Giá trị<br /> lí thuyết<br /> <br /> A<br /> <br /> 3<br /> <br /> 5,5<br /> <br /> 9<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> 12<br /> <br /> Không A<br /> <br /> 8<br /> <br /> 5,5<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6,5<br /> <br /> 12<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 11<br /> <br /> 11<br /> <br /> 13<br /> <br /> 13<br /> <br /> 24<br /> <br /> Giá trị:<br /> <br /> Giá trị X2 tính toán được này lớn hơn giá trị X2tb = 3,84 ở mức ý nghĩa α là 5%. Điều đó kết<br /> luận rằng người thử đã phân biệt được hai mẫu A và không A. Có nghĩa là phân đoạn 1<br /> (tách chiết bằng dung môi n-hexan) không có mùi giống mùi của tinh dầu vỏ quả quýt<br /> 45<br /> <br /> Nguyễn Văn Lợi<br /> <br /> Lạng Sơn tách chiết bằng phương pháp ép lạnh. Như vậy phân đoạn 1 không có mùi thơm của<br /> tinh dầu.<br /> - Phân đoạn 2:<br /> + Xác định các cấu tử trong phân đoạn 2:<br /> Sử dụng phương pháp GC-MS, xác định được 10 cấu tử trong phân đoạn này, kết quả được<br /> thể hiện ở Bảng 3.<br /> Bảng 3. Các cấu tử trong phân đoạn 2<br /> Stt<br /> Tên các cấu tử<br /> Thời gian lưu (phút)<br /> Tỉ lệ (%)<br /> 1<br /> octanal<br /> 2,785<br /> 3,79<br /> 2<br /> citronellal<br /> 5,610<br /> 20,62<br /> 3<br /> decanal<br /> 7,341<br /> 14,53<br /> 4<br /> neral<br /> 9,266<br /> 11,75<br /> 5<br /> linalyl acetate<br /> 10,357<br /> 7,06<br /> 6<br /> dodecanal<br /> 11,628<br /> 7,12<br /> 7<br /> geranial<br /> 12,754<br /> 9,18<br /> 8<br /> α-sinensal<br /> 15,342<br /> 11,69<br /> 9<br /> β-sinensal<br /> 16,129<br /> 9,04<br /> 10 geranyl acetate<br /> 16,573<br /> 4,16<br /> <br /> Hình 3. Sắc kí đồ các cấu tử trong phân đoạn 2<br /> Phân đoạn tinh dầu vỏ quả quýt Lạng Sơn tách chiết với hệ dung môi n-hexan và dietyl ete<br /> có màu vàng đậm, mùi thơm đặc trưng, trong đó có 8 cấu tử thuộc nhóm andehit chiếm 87,72%,<br /> đặc biệt là có một số cấu tử chiếm tỷ lệ cao như citronellal: 20,62%, decanal: 14,53%, neral:<br /> 11,47% và α-sinensal: 11,69%. Nhóm este có 2 cấu tử chiếm 11,22% (linalyl acetate: 7,06% và<br /> geranyl acetate: 4,16%). Theo tác giả Lê Thanh Vân và cộng sự [11] cho rằng cấu trúc tổ hợp<br /> hương gồm 2 thành phần chính là thành phần tạo hương (chất mùi chủ thể, chất khuếch tán và<br /> chất hỗ trợ) và thành phần cố định hương. Thành phần cố định hương, thường là những thành<br /> phần có khối lượng phân tử lớn, nhiệt độ sôi cao, khó bay hơi trong không khí, ở dạng sệt, có độ<br /> nhớt cao hoặc kết tinh rắn, chẳng hạn như β-cyclodextrin, maltodextrin. Tác giả Choi H.S và cộng<br /> sự [12], khi nghiên cứu các cấu tử trong tinh dầu của quả thuộc họ citrus cho rằng, các cấu tử có<br /> nhóm chức andehit đóng vai trò là chất tạo mùi chủ thể và các cấu tử có nhóm chức este đóng vai<br /> trò là chất khuếch tán.<br /> + Xác định mùi của phân đoạn 2:<br /> Để khẳng định phân đoạn 2 có phải là phân đoạn tạo mùi thơm đặc trưng cho tinh dầu vỏ<br /> quả quýt Lạng Sơn hay không, sử dụng phép thử A-không A, nhằm xác định mùi của phân đoạn<br /> tinh dầu vỏ quýt Lạng Sơn tách chiết bằng dung môi n-hexan và dietyl ete với mùi của tinh dầu<br /> vỏ quả quýt Lạng Sơn được tách chiết bằng phương pháp ép lạnh. Kết quả thu được, trình bày ở<br /> Bảng 4.<br /> 46<br /> <br />