intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu tách vùng điều khiển D - loop Ty thể Gà ri, Gà mông và gà sao

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:3

43
lượt xem
1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vùng điều khiển của DNA ty thể (Displacement loop hay D-loop) có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vùng điều khiển D-loop ty thể của lớp chim, gà (Randi et al., 1997 [4]; Lê Đức Long et al., 2007 [3]...) để xác định tính đa dạng di truyền ở mức phân tử.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tách vùng điều khiển D - loop Ty thể Gà ri, Gà mông và gà sao

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁCH VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-loop TY THỂ<br /> GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO<br /> Bùi Thị Kiều Vân - Nguyễn Trọng Lạng (Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên)<br /> <br /> 1. Đặt vấn đề<br /> Vùng điều khiển của DNA ty thể (Displacement loop hay D-loop) có tốc độ tiến hóa<br /> nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ<br /> rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể<br /> cùng loài. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vùng điều khiển<br /> D-loop ty thể của lớp chim, gà (Randi et al., 1997 [4]; Lê Đức Long et al., 2007 [3]...) để xác<br /> định tính đa dạng di truyền ở mức phân tử. Các giống gà nội (gà Ri, gà Mông...) và nhập nội (gà<br /> Sao) thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi Việt Nam, phNm chất trứng, thịt tốt. Vì vậy việc tách<br /> chiết DNA tổng số, phân lập và tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà này tạo điều<br /> kiện cho việc xác định trình tự vùng điều khiển D-loop là một việc làm cần thiết để xác định tính<br /> đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các giống gà trên.<br /> 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Vật liệu N/C là mẫu máu của các giống: gà Ri Hưng Yên (Rhy), gà Mông Nghệ An (Mna), gà<br /> Sao dòng trung (Sdt), được nuôi trong trại giống của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> DNA tổng số được tách chiết từ máu gồm DNA nhân và DNA ty thể theo phương pháp<br /> được mô tả của (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2005 [1]), nồng độ, độ sạch của DNA được xác định<br /> bằng điện di và phổ hấp thụ trên máy quang phổ (Hewlett Parkad, Mỹ).<br /> Phản ứng chuỗi poli merase (PCR) [3] thành phần: Nước 10,85µl; Buffer 2,5µl; MgCl2<br /> 4µl; dNTPs 2,5µl; Mồi H1255-F 0,5µl; Mồi L16725-R 0,5µl; Taq DNA polymerase 0,15µl;<br /> DNA temp 4µl; (tổng thể tích 25µl) thực hiện trên máy PCR - PTC100 (MJ Research, Mỹ). Chu<br /> trình nhiệt: 940C-4'; (940C-1'; 500C-1'; 720C-1' 20'') x 30 chu kỳ; 720C-10'; giữ ở 40C. Trình tự<br /> cặp mồi: L16725-F (Tm = 60 0 C) 5’-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3’;<br /> H1255-R (Tm=55 0 C) 5’-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3’.<br /> Các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo DNA tái tổ hợp như tách chiết, tinh sạch DNA<br /> plasmid, xử lý DNA plasmid bằng enzim cắt hạn chế, gắn nối các đoạn DNA vào vector, điện di<br /> DNA trên gel agarose được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [5].<br /> 3. Kết quả nghiên cứu<br /> 3.1.Tách chiết DNA tổng số<br /> Như đã mô tả, chúng tôi tách chiết được DNA tổng số của ba mẫu Rhy, Mna, Sdt. DNA<br /> tổng số được kiểm tra độ sạch bằng phổ hấp thụ tử ngoại và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.<br /> Kết quả cho thấy các mẫu đều sáng tập trung và rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo<br /> nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21<br /> kb của marker DNA λ. Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về<br /> nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.<br /> 67<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> Hình 1: Điện di DNA tổng số trên gel agarose<br /> 0,8%.M: Thang DNA chu<br /> n; 1; 2; 3 DNA tổng<br /> số mẫu Rhy; Mna; Sdt<br /> <br /> Hình 2: Kết quả điện di sản ph<br /> m PCR<br /> M: Marker; 1: Rhy; 2: Mna; 3: Sdt<br /> <br /> 3.2. Phân lập vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao<br /> Chúng tôi tiến hành PCR từ DNA tổng số của 3 giống gà Rhy, Mna, Sdt sử dụng cặp<br /> mồi H1255-F và L16750-R. Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA<br /> nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuNn (marker), cho thấy kích thước<br /> phân tử của sản phNm PCR vào khoảng 1,3 kb, Các băng đều sáng đậm, rõ nét, tập trung. Như<br /> vậy chúng tôi đã nhân được vùng D-loop (hình 2).<br /> 3.3. Tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao<br /> Sản phNm PCR được nối ghép vào vector pJET1/Blun sau đó được biến nạp vào tế bào<br /> E. Coli, nuôi cấy trên môi trường agar giàu dinh dưỡng có bổ sung Amp, nuôi lắc qua đêm, chọn<br /> khuNn lạc đơn dòng, tách chiết và tinh sạch plasmid. Kết quả trên hình 3 cho thấy các mẫu đều<br /> có các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các<br /> dòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai.<br /> <br /> Hình 3. Ảnh điện di một số DNA plasmid<br /> trên gel agarose 0,8%<br /> ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn<br /> thêm đoạn DNA)<br /> 1-3: DNA plasmid mẫu Rhy;<br /> 4-6: DNA plasmid mẫu Mna;<br /> 7-9: DNA plasmid mẫu Sdt<br /> <br /> Hình 4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng<br /> XhoI và XbaI<br /> M: Thang DNA chuNn (DNA được cắt bằng<br /> EcoRI và Hind)<br /> 1. Plasmid không được cắt;<br /> 2. Sản phNm cắt của plasmid không có đoạn chèn<br /> 3. Sản phNm PCR;<br /> 4-5-6. Sản phNm cắt của dòng Rhy; Mna; Sdt<br /> <br /> Để xác định các dòng trên có được chèn vùng D-loop hay không chúng tôi tiến hành cắt<br /> kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Vì vector<br /> pJET1/Blun có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI và XbaI ở gần hai vị trí ghép nối gen. Mặt<br /> khác trên vùng D-loop ty thể lại không có điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi cắt<br /> 68<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> plasmid tái tổ hợp mang vùng điều khiển D-loop bằng XhoI và XbaI sẽ thu được hai băng DNA<br /> một băng có kích thước 3,1kb của vector và băng còn lại từ sản phNm PCR có kích thước<br /> khoảng 1,3kb tương ứng với kích thước của đoạn D-loop. Kết quả của phản ứng cắt trên hình 4.<br /> cho thấy xuất hiện hai băng đúng như tính toán lí thuyết. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (4; 5; 6<br /> thuộc mẫu Rhy; Mna; Sdt) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm. Những plasmid<br /> mang đoạn chèn chứa vùng D-loop này đã được nhân lên với số lượng lớn và được tinh sạch đấp<br /> ứng yêu cầu cho việc giải trình tự nuleotide của vùng điều khiển D-loop ty thể gà<br /> 4. Kết luận<br /> - Đã tách chiết, tinh sạch được DNA tổng số từ mẫu máu của ba giống: Ri, Mông và Sao.<br /> - Bằng kỹ thuật PCR đã nhân được vùng điều khiển D-loop có kích thước khoảng 1,3 kb<br /> thuộc 3 giống gà trên.<br /> - Thành công trong việc tách dòng phân tử các sản phNm PCR vùng điều khiển D-loop<br /> trong vector pJET1/Blun.<br /> * Xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải, CN. Địch Thị Kim Hương và các cộng<br /> sự Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.<br /> Tóm tắt<br /> Trên cơ sở phân tích thực nghiệm sinh học phân tử, chúng tôi đã tách chiết, tinh sạch<br /> được DNA tổng số từ mẫu máu của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao. Nhân vùng điều khiển<br /> D-loop mtDNA xác định được có kích thước khoảng 1,3 kb và tách dòng phân tử các sản phNm<br /> PCR vùng D-loop trong vector pJET1/Blun.<br /> Summary<br /> Primary study on D-loop of mtDNA in Ri, Mong and Guinea fowl chickens<br /> On the basis of experiment we would like to inform some results of study on control<br /> region (D-loop) of mtDNA in blood patterns from local Ri and Mong chickens in Northern<br /> Vietnam, and Guinea fowl chickens imported from Hungary.<br /> By molecul-biological technique total DNA of tree experiment chickens groups was<br /> determinated. Successful isolation of D-loop region with length about 1,3 kb. Cloning vector of<br /> PCR from D-loop into vector pJET1/Blun. was determinated.<br /> Tài liệu tham khảo<br /> [1]. Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự (2005), "Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) trên<br /> genome ty thể của 5 cá thể người Việt Nam". Tạp chí công nghệ Sinh học 3 (1): tr 31-38.<br /> [2]. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa sinh thịt, đánh giá sự<br /> sai khác di truyền gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn tốt nghiệp ĐHSP Thái nguyên.<br /> [3]. McPherson M.J., Quirke P.(1991), Taylor G.R. PCR - A Practical Approach. IRL Press at<br /> Ôrd University Press.<br /> [4]. Randy E., Lucchini V., Hennache A.(1997), Searching for mtDNA genetic diversity in<br /> captive Edwards’pheasant, The International Studbook For The Edwards’pheasant (Lophura edwardsi)<br /> DNA Its conservation, Paris, pp. 117-120.<br /> [5]. Sambrook J., Russell D. W, (2001), Molecular Cloning: A labroratory Manual, Cold Spring<br /> Harbor Labroatory Press, NewYork.<br /> <br /> 69<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2