Nghiên cứu tách vùng điều khiển D - loop Ty thể Gà ri, Gà mông và gà sao

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁCH VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-loop TY THỂ<br /> GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO<br /> Bùi Thị Kiều Vân - Nguyễn Trọng Lạng (Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên)<br /> <br /> 1. Đặt vấn đề<br /> Vùng điều khiển của DNA ty thể (Displacement loop hay D-loop) có tốc độ tiến hóa<br /> nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác. Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ<br /> rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể<br /> cùng loài. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vùng điều khiển<br /> D-loop ty thể của lớp chim, gà (Randi et al., 1997 [4]; Lê Đức Long et al., 2007 [3]...) để xác<br /> định tính đa dạng di truyền ở mức phân tử. Các giống gà nội (gà Ri, gà Mông...) và nhập nội (gà<br /> Sao) thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi Việt Nam, phNm chất trứng, thịt tốt. Vì vậy việc tách<br /> chiết DNA tổng số, phân lập và tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà này tạo điều<br /> kiện cho việc xác định trình tự vùng điều khiển D-loop là một việc làm cần thiết để xác định tính<br /> đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các giống gà trên.<br /> 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Vật liệu N/C là mẫu máu của các giống: gà Ri Hưng Yên (Rhy), gà Mông Nghệ An (Mna), gà<br /> Sao dòng trung (Sdt), được nuôi trong trại giống của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> DNA tổng số được tách chiết từ máu gồm DNA nhân và DNA ty thể theo phương pháp<br /> được mô tả của (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2005 [1]), nồng độ, độ sạch của DNA được xác định<br /> bằng điện di và phổ hấp thụ trên máy quang phổ (Hewlett Parkad, Mỹ).<br /> Phản ứng chuỗi poli merase (PCR) [3] thành phần: Nước 10,85µl; Buffer 2,5µl; MgCl2<br /> 4µl; dNTPs 2,5µl; Mồi H1255-F 0,5µl; Mồi L16725-R 0,5µl; Taq DNA polymerase 0,15µl;<br /> DNA temp 4µl; (tổng thể tích 25µl) thực hiện trên máy PCR - PTC100 (MJ Research, Mỹ). Chu<br /> trình nhiệt: 940C-4'; (940C-1'; 500C-1'; 720C-1' 20'') x 30 chu kỳ; 720C-10'; giữ ở 40C. Trình tự<br /> cặp mồi: L16725-F (Tm = 60 0 C) 5’-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3’;<br /> H1255-R (Tm=55 0 C) 5’-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3’.<br /> Các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo DNA tái tổ hợp như tách chiết, tinh sạch DNA<br /> plasmid, xử lý DNA plasmid bằng enzim cắt hạn chế, gắn nối các đoạn DNA vào vector, điện di<br /> DNA trên gel agarose được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [5].<br /> 3. Kết quả nghiên cứu<br /> 3.1.Tách chiết DNA tổng số<br /> Như đã mô tả, chúng tôi tách chiết được DNA tổng số của ba mẫu Rhy, Mna, Sdt. DNA<br /> tổng số được kiểm tra độ sạch bằng phổ hấp thụ tử ngoại và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.<br /> Kết quả cho thấy các mẫu đều sáng tập trung và rõ nét, không có những “mảnh vụn” tạo<br /> nên vệt sáng kéo dài phía dưới. Hai băng DNA thu được có kích thước tương đương với vạch 21<br /> kb của marker DNA λ. Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về<br /> nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.<br /> 67<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> Hình 1: Điện di DNA tổng số trên gel agarose<br /> 0,8%.M: Thang DNA chu<br /> n; 1; 2; 3 DNA tổng<br /> số mẫu Rhy; Mna; Sdt<br /> <br /> Hình 2: Kết quả điện di sản ph<br /> m PCR<br /> M: Marker; 1: Rhy; 2: Mna; 3: Sdt<br /> <br /> 3.2. Phân lập vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao<br /> Chúng tôi tiến hành PCR từ DNA tổng số của 3 giống gà Rhy, Mna, Sdt sử dụng cặp<br /> mồi H1255-F và L16750-R. Theo ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA<br /> nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thước chuNn (marker), cho thấy kích thước<br /> phân tử của sản phNm PCR vào khoảng 1,3 kb, Các băng đều sáng đậm, rõ nét, tập trung. Như<br /> vậy chúng tôi đã nhân được vùng D-loop (hình 2).<br /> 3.3. Tách dòng vùng điều khiển D-loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao<br /> Sản phNm PCR được nối ghép vào vector pJET1/Blun sau đó được biến nạp vào tế bào<br /> E. Coli, nuôi cấy trên môi trường agar giàu dinh dưỡng có bổ sung Amp, nuôi lắc qua đêm, chọn<br /> khuNn lạc đơn dòng, tách chiết và tinh sạch plasmid. Kết quả trên hình 3 cho thấy các mẫu đều<br /> có các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt 9 cao hơn dòng đối chứng. Từ đây, có thể dự đoán các<br /> dòng này có thể chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai.<br /> <br /> Hình 3. Ảnh điện di một số DNA plasmid<br /> trên gel agarose 0,8%<br /> ĐC: DNA plasmid đối chứng (không được chèn<br /> thêm đoạn DNA)<br /> 1-3: DNA plasmid mẫu Rhy;<br /> 4-6: DNA plasmid mẫu Mna;<br /> 7-9: DNA plasmid mẫu Sdt<br /> <br /> Hình 4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng<br /> XhoI và XbaI<br /> M: Thang DNA chuNn (DNA được cắt bằng<br /> EcoRI và Hind)<br /> 1. Plasmid không được cắt;<br /> 2. Sản phNm cắt của plasmid không có đoạn chèn<br /> 3. Sản phNm PCR;<br /> 4-5-6. Sản phNm cắt của dòng Rhy; Mna; Sdt<br /> <br /> Để xác định các dòng trên có được chèn vùng D-loop hay không chúng tôi tiến hành cắt<br /> kiểm tra các dòng Rhy 2; Mna 4; Sdt 9 bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Vì vector<br /> pJET1/Blun có chứa điểm nhận biết của enzyme XhoI và XbaI ở gần hai vị trí ghép nối gen. Mặt<br /> khác trên vùng D-loop ty thể lại không có điểm nhận biết của 2 enzyme này. Do vậy khi cắt<br /> 68<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008<br /> <br /> plasmid tái tổ hợp mang vùng điều khiển D-loop bằng XhoI và XbaI sẽ thu được hai băng DNA<br /> một băng có kích thước 3,1kb của vector và băng còn lại từ sản phNm PCR có kích thước<br /> khoảng 1,3kb tương ứng với kích thước của đoạn D-loop. Kết quả của phản ứng cắt trên hình 4.<br /> cho thấy xuất hiện hai băng đúng như tính toán lí thuyết. Như vậy, đã chọn được 3 dòng (4; 5; 6<br /> thuộc mẫu Rhy; Mna; Sdt) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA quan tâm. Những plasmid<br /> mang đoạn chèn chứa vùng D-loop này đã được nhân lên với số lượng lớn và được tinh sạch đấp<br /> ứng yêu cầu cho việc giải trình tự nuleotide của vùng điều khiển D-loop ty thể gà
<br /> 4. Kết luận<br /> - Đã tách chiết, tinh sạch được DNA tổng số từ mẫu máu của ba giống: Ri, Mông và Sao.<br /> - Bằng kỹ thuật PCR đã nhân được vùng điều khiển D-loop có kích thước khoảng 1,3 kb<br /> thuộc 3 giống gà trên.<br /> - Thành công trong việc tách dòng phân tử các sản phNm PCR vùng điều khiển D-loop<br /> trong vector pJET1/Blun.<br /> * Xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải, CN. Địch Thị Kim Hương và các cộng<br /> sự Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài.<br /> Tóm tắt<br /> Trên cơ sở phân tích thực nghiệm sinh học phân tử, chúng tôi đã tách chiết, tinh sạch<br /> được DNA tổng số từ mẫu máu của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao. Nhân vùng điều khiển<br /> D-loop mtDNA xác định được có kích thước khoảng 1,3 kb và tách dòng phân tử các sản phNm<br /> PCR vùng D-loop trong vector pJET1/Blun.<br /> Summary<br /> Primary study on D-loop of mtDNA in Ri, Mong and Guinea fowl chickens<br /> On the basis of experiment we would like to inform some results of study on control<br /> region (D-loop) of mtDNA in blood patterns from local Ri and Mong chickens in Northern<br /> Vietnam, and Guinea fowl chickens imported from Hungary.<br /> By molecul-biological technique total DNA of tree experiment chickens groups was<br /> determinated. Successful isolation of D-loop region with length about 1,3 kb. Cloning vector of<br /> PCR from D-loop into vector pJET1/Blun. was determinated.<br /> Tài liệu tham khảo<br /> [1]. Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự (2005), "Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) trên<br /> genome ty thể của 5 cá thể người Việt Nam". Tạp chí công nghệ Sinh học 3 (1): tr 31-38.<br /> [2]. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa sinh thịt, đánh giá sự<br /> sai khác di truyền gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn tốt nghiệp ĐHSP Thái nguyên.<br /> [3]. McPherson M.J., Quirke P.(1991), Taylor G.R. PCR - A Practical Approach. IRL Press at<br /> Ôrd University Press.<br /> [4]. Randy E., Lucchini V., Hennache A.(1997), Searching for mtDNA genetic diversity in<br /> captive Edwards’pheasant, The International Studbook For The Edwards’pheasant (Lophura edwardsi)<br /> DNA Its conservation, Paris, pp. 117-120.<br /> [5]. Sambrook J., Russell D. W, (2001), Molecular Cloning: A labroratory Manual, Cold Spring<br /> Harbor Labroatory Press, NewYork.<br /> <br /> 69<br /> <br />