Nghiên cứu thành phần Amino Acid và điện di protein dự trữ trong hạt của một số giống đậu xanh ( Vigna radiata ( L. ) Wilczek )

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AMINO ACID VÀ ĐIỆN DI PROTEIN DỰ TRỮ<br /> TRONG HẠT CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek)<br /> Nguyễn Vũ Thanh Thanh (Khoa KHTN&XH- ĐH Thái Nguyên) - Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên)<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó cung cấp<br /> protein cho con người, có giá trị trong y học và cũng là cây cải tạo đất [3]. Nghiên cứu chất<br /> lượng hạt đậu xanh dựa trên phân tích hàm lượng protein, lipid, hàm lượng đường và enzyme đã<br /> được chúng tôi quan tâm nghiên cứu. Trong bài báo này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một số<br /> đặc điểm hóa sinh của 14 giống đậu xanh dựa trên phân tích hàm lượng và thành phần amino<br /> acid, điện di protein dự trữ trong hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu.<br /> 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> Hạt của 14 giống đậu xanh (11 giống do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ Viện cây lương thực và thực phNm cung cấp và 3 giống sưu tập tại tỉnh Hòa Bình và Vĩnh Phúc)<br /> làm vật liệu nghiên cứu. Đặc điểm của các giống được trình bày trong bảng 1.<br /> Bảng 1. Đặc điểm của 14 giống đậu xanh<br /> Ký<br /> hiệu<br /> <br /> Tên giống<br /> <br /> Nơi cung cấp<br /> <br /> Khối lượng 1000<br /> hạt (g)<br /> <br /> Màu vỏ hạt<br /> <br /> Màu vỏ quả<br /> <br /> 1<br /> <br /> V123<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 64,50±0,85<br /> <br /> Xanh bóng<br /> <br /> Đen nâu<br /> <br /> 2<br /> <br /> KP11<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 57,10±0,62<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 3<br /> <br /> KPS1<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 65,50±0,87<br /> <br /> Xanh bóng<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 4<br /> <br /> T135<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 53,30 ±0,47<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 5<br /> <br /> MN93<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 45,30±0,49<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 6<br /> <br /> VC6144<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 59,30±0,64<br /> <br /> Nâu bóng<br /> <br /> Đen nâu<br /> <br /> 7<br /> <br /> HB1<br /> <br /> Hoà Bình-VN<br /> <br /> 61,00±0,60<br /> <br /> Xanh bóng<br /> <br /> Vàng nâu<br /> <br /> 8<br /> <br /> HB2<br /> <br /> Hoà Bình-VN<br /> <br /> 57,40±0,25<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Vàng nâu<br /> <br /> 9<br /> <br /> ĐX06<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 50,00±1,16<br /> <br /> Xanh nâu<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 10<br /> <br /> 263<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 41,20±0,55<br /> <br /> Xanh bóng<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 11<br /> <br /> Ninh Thuận<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 60,50±0,84<br /> <br /> Xanh bóng<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 12<br /> <br /> Quảng Bình<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 35,40±0,75<br /> <br /> Vàng<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 13<br /> <br /> Kon Tum<br /> <br /> Viện KH Nông nghiệp VN<br /> <br /> 48,60±0,85<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Đen<br /> <br /> 14<br /> <br /> Vĩnh Phúc<br /> <br /> Vĩnh Phúc-VN<br /> <br /> 41,40±0,44<br /> <br /> Xanh mốc<br /> <br /> Đen<br /> <br /> Xác định hàm lượng và thành phần amino acid trên máy phân tích amino acid tự động<br /> Biochrom 20 của hãng Pharmacia Biotech tại Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Nông<br /> lâm Thái Nguyên. Thành phần amino acid được xác định theo gam amino acid/100g bột.<br /> Tách chiết và phân đoạn protein theo phương pháp Osborne và Klimenko như mô tả của<br /> Trần Thị Phương Liên (1999) [2]. Sau đó phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide có<br /> chứa SDS theo phương pháp của Leammli [7]. Hạt được nghiền nhỏ thành bột mịn, loại lipid<br /> bằng ether petroleum sau đó tiến hành điện di protein phân đoạn. Protein được chiết bằng 2<br /> cách: trong dung dịch NaCl 1M và nước cất.<br /> 66<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008<br /> <br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1 Hàm lượng amino acid trong hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu<br /> Giá trị sinh học của protein phụ thuộc trực tiếp vào thành phần amino acid. Kết quả phân<br /> tích hàm lượng amino acid trong hạt của 14 giống đậu xanh đều thu được 17 loại amino acid<br /> (hàm lượng cysteine và cystine được tính chung), trong đó đều có 7 loại amino acid không thay<br /> thế (lysine, valine, isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, methionine). Riêng amino acid<br /> không thay thế thứ 8 là tryptophan bị phân giải trong quá trình xử lý mẫu trong HCl nên không<br /> thu nhận được. Glutamin và asparagin chuyển hóa thành glutamic acid và aspartic acid. Từ kết<br /> quả phân tích hàm lượng protein và hàm lượng từng loại amino acid trong hạt của mỗi giống<br /> đậu xanh chúng tôi đã xác định được thành phần amino acid trong protein hạt của các giống đậu<br /> xanh này. Amino acid tổng số dao động trong khoảng 21,3 g - 28,28 g amino acid/100 g bột.<br /> Hàm lượng amino acid của các amino acid không thay thế được thể hiện trong bảng 2.<br /> Bảng 2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein hạt của 14 giống đậu xanh<br /> (ĐVT [g amino acid/100 g bột])<br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> <br /> Tên giống<br /> V123<br /> KP11<br /> KPS1<br /> T135<br /> MN93<br /> VC6144<br /> HB1<br /> HB2<br /> ĐX06<br /> 263<br /> Ninh Thuận<br /> Quảng Bình<br /> Kon Tum<br /> Vĩnh Phúc<br /> <br /> Thr<br /> 0,88<br /> 0,90<br /> 0,80<br /> 0,74<br /> 1,16<br /> 0,87<br /> 0,96<br /> 1,17<br /> 1,01<br /> 0,79<br /> 0,81<br /> 0,81<br /> 0,81<br /> 0,79<br /> <br /> Val<br /> 1,76<br /> 1,79<br /> 1,70<br /> 1,73<br /> 1,97<br /> 1,74<br /> 1,80<br /> 2,13<br /> 1,85<br /> 1,69<br /> 1,78<br /> 1,72<br /> 1,78<br /> 1,70<br /> <br /> Amino acid không thay thế<br /> Met<br /> Phe<br /> Ile<br /> 0,26<br /> 1,43<br /> 0,92<br /> 0,25<br /> 1,41<br /> 0,97<br /> 0,34<br /> 1,47<br /> 0,88<br /> 0,27<br /> 1,37<br /> 0,84<br /> 0,27<br /> 1,35<br /> 0,91<br /> 0,32<br /> 1,59<br /> 0,95<br /> 0,27<br /> 1,41<br /> 0,91<br /> 0,21<br /> 1,41<br /> 1,11<br /> 0,27<br /> 1,47<br /> 1,14<br /> 0,32<br /> 1,45<br /> 0,87<br /> 0,34<br /> 1,47<br /> 0,95<br /> 0,33<br /> 1,37<br /> 0,91<br /> 0,34<br /> 1,45<br /> 0,95<br /> 0,35<br /> 1,34<br /> 0,86<br /> <br /> Leu<br /> 1,97<br /> 1,92<br /> 1,85<br /> 1,74<br /> 2,08<br /> 2,05<br /> 1,99<br /> 1,96<br /> 2,10<br /> 1,89<br /> 1,94<br /> 1,86<br /> 1,94<br /> 1,84<br /> <br /> Lys<br /> 1,74<br /> 1,75<br /> 1,71<br /> 1,69<br /> 1,95<br /> 1,87<br /> 1,89<br /> 2,07<br /> 2,02<br /> 1,72<br /> 1,76<br /> 1,72<br /> 1,83<br /> 1,62<br /> <br /> Ghi chú: Thr=Threonine; Val=Valine; Met=Methionine; Phe=Phenylalanine;<br /> Ile=Isoleucine; Leu=Leucine; Lys=Lysine.<br /> <br /> Bảng 2 cho thấy, trong số 7 amino acid không thay thế thì hàm lượng của valine (1,69 g2,13 g/100g bột), leucine (1,74 g - 2,10 g/100 g bột) và lysine (1,62 g - 2,07 g/100 g bột) cao<br /> hơn so với các amino acid còn lại, hàm lượng của methionine thấp nhất (0,21 g - 0,35 g/100 g<br /> bột). Giống HB2 có hàm lượng lysine cao nhất (2,07 g/100 g bột) thì hàm lượng methionine lại<br /> thấp nhất (0,21 g/100g bột), giống Vĩnh Phúc có hàm lượng lysine thấp nhất (1,62 g/100g bột)<br /> thì hàm lượng methionine lại cao nhất (0,35 g/100g bột). Các amino acid: valine, leucine và<br /> lysine có hàm lượng chênh lệch nhau không đáng kể. Kết quả này cũng phù hợp với Lê Doãn<br /> Diên nghiên cứu về thành phần amino acid của các giống đậu xanh [1]. Đối với lúa gạo, hàm<br /> lượng lysine chỉ cao hơn hàm lượng methionine trung bình khoảng 1,5 lần [4]. Còn đối với đậu<br /> xanh, kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy: hàm lượng lysine cao hơn hàm lượng<br /> methionine rất nhiều (trung bình khoảng 6,3 lần).<br /> 67<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008<br /> <br /> Hình 1. Sắc ký đồ amino acid ở hạt của giống đậu xanh KP11<br /> <br /> 3.2 Phân tích phổ điện di các phân đoạn protein<br /> Protein chiếm một lượng lớn trong hạt đậu xanh (khoảng 24%-28%). Hàm lượng này<br /> không giống nhau giữa các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau. Protein dự trữ<br /> chiếm tỷ lệ cao trong hạt đậu, trong đó phải kể đến là globulin. Nhằm đánh giá chất lượng hạt và<br /> tìm ra sự khác nhau giữa các tiểu phần protein của các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn<br /> khác nhau, chúng tôi tiến hành điện di protein phân đoạn theo phương pháp của Osborne và<br /> Klimenko như mô tả của Trần Thị Phương Liên.<br /> Phân đoạn 1: Protein được chiết bằng NaCl 1M. Phổ điện di phân đoạn này được xem<br /> như protein tổng số của đậu xanh gồm albumin và globulin. Số băng điện di ở mỗi giống dao<br /> động trong khoảng 13-24 băng. Khối lượng phân tử của một số băng chính đã được xác định.<br /> Các băng đậm là các vạch tương ứng với các tiểu đơn vị globulin dự trữ trong hạt. 14 giống đậu<br /> xanh nghiên cứu đều có đầy đủ các tiểu đơn vị globulin là vicilin (hệ sô lắng 8S), legumin (hệ số<br /> lắng 11S) và globulin kiềm (7S), chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của các băng sau khi điện di.<br /> Điện di phân đoạn 1 có đủ 4 băng của vicilin (8S) với kích thước 60 kDa, 48 kDa, 32 kDa, 26<br /> kDa, trong đó băng 48 kDa rất đậm và rõ ràng. Kết quả điện di cũng thấy có đủ 2 băng của<br /> legumin với kích thước 24 kDa và 40 kDa nhưng băng mờ hơn so với các băng điện di của<br /> vicilin. Còn globulin kiềm cũng có đủ hai băng: một băng kích thước 28 kDa và băng 16 kDa.<br /> Kết quả này cũng phù hợp với công bố của các tác giả khác [5], [6], [8]. Trên hình ảnh điện di<br /> phân đoạn 1 cũng nhìn thấy rõ băng của albumin có kích thước 30,6 kDa ở tất cả các giống đậu<br /> xanh nghiên cứu. Như vậy, tuy các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau nhưng đều<br /> có đầy đủ các tiểu đơn vị của globulin dự trữ. Tuy nhiên, các giống đậu xanh khác nhau có sự<br /> thay đổi về số lượng băng nhưng chỉ là sự chênh lệch ở các băng phụ mờ (hình 2).<br /> Phân đoạn 2: chứa phần lớn albumin được chiết bằng cách thNm tích phân đoạn 1. Kết<br /> quả điện di cho thấy tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu đều có băng albumin rõ nhất ở kích thước<br /> 30,6 kDa. Các băng còn lại đều có ở tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu nhưng mờ hơn so với<br /> băng 30,6 kDa (hình 3.6). Vai trò của từng protein này như thế nào là vấn đề cần nghiên cứu tiếp.<br /> Phân đoạn 3: cặn li tâm thu được ở quá trình nhận phân đoạn 2 được tiếp tục chiết bằng<br /> NaCl 1M. Phân đoạn này chỉ chứa globulin. Số băng điện di dao động từ 8-13 băng.<br /> Phân đoạn 4: protein được chiết bằng H2O gồm cả albumin và globulin. Phổ điện di cho<br /> thấy số băng dao động trong khoảng 18-24 băng. Các băng phụ nhiều hơn và rõ hơn so với phân<br /> đoạn 1. Điều này có thể lý giải là do tỷ lệ albumin và globulin tan trong nước chiếm tỷ lệ cao.<br /> 68<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di protein phân đoạn 1 của một số giống đậu xanh<br /> Ghi chú: 1. HB1; 2. HB2; 3.ĐX06; 4. KP11; 5. MN93.<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh điện di protein phân đoạn 2 của một số giống đậu xanh<br /> Ghi chú: 1. HB1; 2. HB2; 3.ĐX06; 4. KP11; 5. MN93.<br /> <br /> Phân đoạn 5: nhận được sau khi thNm tích phân đoạn 4, chứa hầu hết albumin. Số băng<br /> điện di dao động từ 14-24 băng.<br /> Phân đoạn 6: Cặn li tâm sau khi nhận phân đoạn 5 được tiếp tục chiết bằng NaCl 1M.<br /> Phân đoạn 6 chứa phần lớn globulin tan trong muối. Số băng điện di dao động từ 11-14 băng.<br /> Phân đoạn 7: protein được chiết bằng NaCl 1M từ cặn ly tâm sau khi chiết bằng nước (ở<br /> phân đoạn 4), chứa phần globulin còn lại. Phổ điện di của phân đoạn 7 dao động từ 13-24 băng. Các<br /> băng của các tiểu phần vicilin, legumin và globulin kiềm đều có đầy đủ và rất rõ nét ở 14 giống đậu<br /> xanh nghiên cứu. Tuy nhiên, các băng này có độ đậm nhạt khác nhau ở các giống khác nhau.<br /> 4. Kết luận<br /> Đã xác định được sự có mặt của 17 amino acid , trong đó 7 amino acid không thay thế<br /> đều có trong protein hạt của 14 giống đậu xanh nghiên cứu.<br /> Phân tích điện di phân đoạn protein trong hạt của 14 giống đậu xanh nghiên cứu cho<br /> thấy, có sự khác biệt về mức độ hoà tan của các tiểu đơn vị globulin. Tất cả các giống đậu xanh<br /> đều có các tiểu đơn vị của globulin và albumin. Như vậy, protein dự trữ có đủ các thành phần bảo<br /> đảm thực hiện chức năng dự trữ và tạo cấu trúc không gian đúng của các phân tử protein. Sự khác<br /> nhau về phổ điện di protein trong hạt của các giống đậu xanh chỉ biểu hiện ở các băng vạch phụ
<br /> 69<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008<br /> <br /> Summary<br /> STUDY ON AMINO ACID AND ELECTROPHORESIS COMPOSITION OF SEED PROTEINS OF<br /> SOME MUNGBEAN CULTIVARS (Vigna radiata (L.) Wilczek)<br /> Nguyen Vu Thanh Thanh and Chu Hoang Mau<br /> <br /> Mungbean, which is rich in source of dietary protein, is a widely grown grain legume in the<br /> tropics and subtropics area. Seed of 14 mungbean cultivars was used for the study. Total amino acid<br /> content in the seeds of mungbean cultivars was from 21,3 g - 28,28g of dry weight. The protein fractions<br /> were analyzed by 12,5 SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Based on the study on electrophoresis<br /> composition of seed proteins of 14 mungbean cultivars, it showed that protein storage of 14 mungbean<br /> cultivars have globulin and albumin. The variation of protein bands in seeds of mungbean cultivars arises<br /> from the difference in the gene encoding storage proteins.<br /> <br /> Tài liệu tham khảo<br /> [1]. Lê Doãn Diên (1990), “Nghiên cứu về protein và amino acid trong một số giống cây trồng ở<br /> miền Bắc Việt Nam”, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật nông nghiệp, tr. 100-115.<br /> [2]. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số<br /> giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ<br /> sinh học, Hà Nội.<br /> [3]. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.<br /> [4]. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa<br /> bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.<br /> [5]. Garcia R.N, Adachi M., Tecson-Mendoza E.M., Bernardo A.E., Utsumi S. (2006),<br /> “Physicochemical properties of native and recombinant mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) 8S<br /> globulins and the effects of the N-linked glycans”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(16),<br /> pp. 6005-6010.<br /> [6]. Itoh T., Garcia R.N., Adachi M., Maruyama Y., Tecson-Mendoza E.M., Mikami B., Utsumi<br /> S. (2006), “Structure of 8S alpha globulin, the major seed storage protein of mungbean”, Acta<br /> crystallographica. Section D, Biological crystallography, 62, pp. 824-832.<br /> [7]. Leammli U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of<br /> bacteriophage T4”, Nature, 227, pp. 680-685.<br /> [8]. Mendoza E.M., Adachi M., Bernardo A.E., Utsumi S. (2001), “Mungbean (Vigna radiata L.<br /> Wilczek) globulins: Purification and characterization”, Journal of Agricultural of Food Chemistry,<br /> 49(3), pp. 1552-1558.<br /> <br /> 70<br /> <br />