Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym α–amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM

α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ

LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC

Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM

α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ

Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc

Maõ soá: 60 42 40

LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC

NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC:

PGS.TS. LÖÔNG ÑÖÙC PHAÅM

Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009

MỞ ÑAÀU

Vi sinh vaät trong töï nhieân raát ña daïng vaø phong phuù. Chuùng coù maët khaép

nôi: trong ñaát, trong nöôùc, trong khoâng khí,… keå caû trong cô theå con ngöôøi. Ngoaøi

taùc haïi do vi sinh vaät gaây ra nhö: gaây beänh cho thöïc vaät, ñoäng vaät vaø con ngöôøi;

thì nguoàn lôïi maø chuùng mang laïi cho chuùng ta voâ cuøng to lôùn neáu ta hieåu, bieát vaø

söû duïng chuùng hôïp lyù. Caùc chuûng vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån Bacillus noùi

rieâng ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng raát phoå bieán trong caùc cheá phaåm sinh hoïc ñeå

phuïc vuï cho caùc ngaønh saûn xuaát nhö: röôïu, bia, coâng nghieäp deät, thuoäc da, boå

sung vaøo thöùc aên cho gia suùc ñeå deã tieâu hoaù, thöùc aên trong nuoâi troàng thuyû saûn,

trong y hoïc vaø nghieân cöùu,… laø nhôø khaû naêng sinh caùc loaïi enzym thuyû phaân cuûa

caùc chuûng vi sinh vaät naøy.

Enzym laø nhöõng chaát xuùc taùc sinh hoïc, ngoaøi nhöõng tính chaát cuûa moät chaát

xuùc taùc noù coøn coù nhöõng tính chaát öu vieät hôn nhö: coù hieäu suaát xuùc taùc raát cao ôû

ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, coù tính ñaëc hieäu cao. Caùc tính chaát naøy

vaãn ñöôïc baûo toàn khi taùch enzym ra khoûi heä thoáng soáng, hoaït ñoäng trong ñieàu kieän

invitro. Vì vaäy, enzym ngaøy caøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong thöïc teá, vôùi quy moâ

ngaøy caøng lôùn, daãn ñeán vieäc hình thaønh vaø phaùt trieån ngaønh coâng ngheä saûn xuaát

enzym. Vieäc söû duïng enzym trong thöïc teá khoâng chæ coù yù nghóa veà kinh teá maø coøn

giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà xaõ hoäi, caùc vaán ñeà böùc xuùc veà moâi tröôøng.

Tröôùc kia, enzym thöôøng ñöôïc thu nhaän töø teá baøo thöïc vaät hoaëc ñoäng vaät

(chaúng haïn amylase ñöôïc laáy töø haït naûy maàm, protease töø nhöïa ñu ñuû, daï

daøy,…). Tuy nhieân quaù trình sinh toång hôïp enzym ôû ñoäng vaät vaø thöïc vaät gaén lieàn

vôùi söï trao ñoåi chaát vaø nhu caàu cuûa teá baøo. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn phaûi phaù boû

caùc toå chöùc teá baøo ñeå taùch chieát vaø thu nhaän enzym. Nhö vaäy, vieäc duøng teá baøo

ñoäng vaät, thöïc vaät laøm nguoàn nguyeân lieäu ñeå thu nhaän enzym laø khaù haïn cheá,

thieáu tính kinh teá vaø khoâng ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu veà soá löôïng enzym caàn thieát

cho saûn xuaát.

Trong khi ñoù, ôû vi sinh vaät haàu nhö chöùa ñaày ñuû caùc loaïi enzym vaø vieäc söû

duïng nguoàn enzym töø vi sinh vaät mang laïi lôïi ích lôùn hôn, cuï theå nhö nguoàn

nguyeân lieäu duøng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng reû tieàn hôn vì chuùng thöôøng laø

pheá phuï phaåm coâng noâng nghieäp (nhö caùm, traáu, baõ mía, baõ khoai myø,…) hoaëc

nguoàn nguyeân lieäu töï nhieân nhö daàu moû, khí ñoát,… Maët khaùc, ñieàu kieän nuoâi caáy

deã daøng, vaø enzym coù hoaït tính cao hôn. Vì theá, khoaûng 50 naêm gaàn ñaây caùc cheá

phaåm enzym töø vi sinh vaät ñaõ daàn thay theá caùc enzym coù nguoàn goác thöïc vaät,

ñoäng vaät.

Trong haøng loaït caùc loaïi enzym khaùc nhau thì amylase laø enzym phaân giaûi

tinh boät taïo ñöôøng cho caùc sinh vaät. Töø nhöõng naêm ñaàu theá kyû 18 caùc nhaø khoa

hoïc ñaõ baét ñaàu nghieân cöùu veà amylase vaø ñeán nay ñaõ bieát khaù roõ veà loaïi enzym

naøy. Amylase ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc saûn xuaát nhö coâng

nghieäp thöïc phaåm, coâng nghieäp deät,…Saûn xuaát amylase coâng nghieäp ñaõ ñöôïc chuù

yù töø raát laâu vaø ngaøy caøng phaùt trieån ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Vieät Nam chuùng

ta laø moät trong nhieàu nöôùc ñaõ vaø ñang coù raát nhieàu nghieân cöùu vaø öùng duïng

enzym amylase, nhöng neàn coâng nghieäp saûn xuaát enzym ôû nöôùc ta chöa thaät söï

phaùt trieån.

Xuaát phaùt töø cô sôû treân chuùng toâi choïn ñeà taøi cho luaän vaên: “Nghieân cöùu

thu nhaän enzym α-amylase töø tröïc khuaån coû khoâ”.

Noäi dung cuûa ñeà taøi goàm moät soá vaán ñeà sau:

1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh tröôûng vaø

sinh enzim amylase coù hoaït tính maïnh töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ.

2. Nghieân cöùu hình thaùi teá baøo, hình thaùi khuaån laïc, vaø caùc ñaëc ñieåm sinh

hoïc cuûa chuûng tuyeån choïn.

3. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc dòch enzym amylase

coù hoaït ñoä cao.

4. Ñònh danh chuûng ñöôïc tuyeån choïn baèng kyõ thuaät di truyeàn phaân töû.

5. Nuoâi caáy chuûng ñaõ tuyeån choïn trong thieát bò bình leân men tam giaùc 1 lít

vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình sinh

toång hôïp amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä enzym.

6. Taùch chieát enzym amylase töø dòch leân men nhôø caùc taùc nhaân tuûa.

7. So saùnh hieäu suaát thu nhaän vaø hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase

thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau.

8. Nghieân cöùu ñoä beàn nhieät vaø ñoä beàn pH cuûa CPE amylase.

Chương I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

1.1. Giống vi khuaån Bacillus [5], [16], [38], [39]

Bacillus laø vi khuaån Gram döông, hình que coù kích thöôùc khaùc nhau (0,5 –

2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chuùng phaân boá roäng raõi trong töï nhieân, trong ñaát, nöôùc,

khoâng khí.

Laø vi khuaån dò döôõng hoaù naêng, thu naêng löôïng nhôø söï oxi hoaù caùc hôïp chaát

höõu cô, coù chuøm tieân mao giuùp chuùng coù khaû naêng di ñoäng, soáng hieáu khí hoaëc

hieáu khí tuyø tieän.

Bacillus coù khaû naêng sinh baøo töû, baøo töû ñöôïc hình thaønh khi teá baøo ñaõ traûi

qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát, hoaëc khi thieáu chaát dinh döôõng. Moãi teá baøo

sinh döôõng sinh ra moät baøo töû. Khi baøo töû tröôûng thaønh, teá baøo sinh döôõng töï

phaân giaûi giaûi phoùng baøo töû. Caùc teá baøo Bacillus ñaëc tröng laø sinh baøo töû maøø vaãn

giöõ hình daùng tröïc khuaån khi mang baøo töû, trong moät soá tröôøng hôïp teá baøo vi

khuaån chæ phình to moät ít khi chöùa baøo töû. Tuyø loaøi maø baøo töû coù theå naèm chính

taâm, leäch taâm hay gaàn ñaàu teá baøo.

Baøo töû coù khaû naêng chòu nhieät, tia töû ngoaïi, phoùng xaï vaø nhieàu ñoäc toá, vì

vaäy chuùng coù khaû naêng giöõ ôû traïng thaùi baøo töû nhieàu naêm. Baøo töû khoâng phaûi cô

quan sinh saûn maø laø moät traïng thaùi baûo veä noøi gioáng, noù ñöôïc taïo ra ñeå giuùp teá

baøo chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Ñoù laø daïng nghæ cuûa teá baøo.

Baøo töû ôû daïng töï do khoâng coù quaù trình trao ñoåi chaát, khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi

moãi baøo töû cho ra moät teá baøo sinh döôõng.

Ña soá Bacillus sinh tröôûng toát ôû pH = 7, moät soá phuø hôïp vôùi pH = 9 – 10 nhö

Bacillus alcalophillus, hoaëc vôùi pH = 2 – 6 nhö Bacillus- acidocaldrius.

Veà nhieät ñoä, coù nhieàu chuûng öa nhieät ñoä cao (450C – 750C), hoaëc öa laïnh

(50C –250C), nhöng thöôøng gaëp Bacillus soáng ôû nhieät ñoä toái öu laø 340C – 370C.

Haàu heát Bacillus khoâng gaây beänh cho ngöôøi vaø ñoäng vaät. Moät soá loaïi gaây

beänh cho coân truøng nhö Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B.

cereus, B. anthracis (trong ñoù B. cereus vaø B. anthracis coù theå gaây beänh cho

ngöôøi)…ña soá coøn laïi trong töï nhieân laø coù ích.

Bacillus coù khaû naêng sinh enzym ngoaïi baøo: α-amylase, protease kieàm,

cellulase… vaø caùc enzym naøy ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong coâng nghieäp, baûo veä

moâi tröôøng, noâng nghieäp…

Sau ñaây laø moät soá loaøi Bacillus thöôøng gaëp trong töï nhieân

1.1.1 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis ñöôïc phaùt hieän vaø ñaët teân vaøo naêm 1872, noù phaân boá phoå

bieán trong ñaát vaø ñaëc bieät laø ôû coû khoâ neân Bacillus subtilis ñöôïc goïi laø tröïc

khuaån coû khoâ.

Laø nhöõng vi khuaån hình que, ngaén, nhoû, kích thöôùc (3 -5) × 0,6 μm, nhieàu

khi teá baøo noái laïi vôùi nhau thaønh chuoãi daøi ngaén khaùc nhau hoaëc teá baøo ñöùng

rieâng reõ.

Khuaån laïc khoâ, khoâng maøu hoaëc maøu xaùm nhaït, hôi nhaên hoaëc taïo ra lôùp

maøng mòn lan treân beà maët thaïch, coù meùp nhaên baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch.

Nhieät ñoä thích hôïp cho Bacillus subtilis sinh tröôûng laø 300C – 500C, thöôøng

nuoâi caáy ôû 370C.

Baøo töû hình baàu duïc, kích thöôùc 0,6 – 0,9 μm, phaân boá leäch taâm, gaàn taâm

nhöng khoâng chính taâm. Baøo töû coù theå soáng vaøi naêm ñeán vaøi chuïc naêm. Ñaõ coù

nhöõng chöùng cöù veà vieäc duy trì söùc soáng baøo töû B. subtilis trong 200-300 naêm.

Vi khuaån B. subtilis coù maøng nhaøy (giaùc maïc) giuùp vi khuaån coù khaû naêng

chòu ñöôïc ñieàu kieän khaéc nghieät vì maøng nhaøy coù theå döï tröõ thöùc aên vaø baûo veä vi

khuaån traùnh toån thöông khi khoâ haïn. Maøng nhaøy coù theå quan saùt ñöôïc khi nhuoäm

tieâu baûn, qua kính hieån vi chuùng ta coù theå nhìn thaáy maøng nhaøy cuûa B. subtilis laø

khoâng maøu, trong suoát, coøn teá baøo vi khuaån baét maøu naâu ñoû treân neàn tieâu baûn

xanh hoaëc ñen.

B. subtilis coù khaû naêng sinh ra moät soá enzym nhö: α-amylase, protease

kieàm coù giaù trò cao, ñaëc bieät coù khaû naêng toång hôïp riboflavin (tieàn vitamin B2).

Vì vaäy, B. subtilis ñöôïc öùng duïng khaù nhieàu trong caùc ngaønh coâng nghieäp.

1.1.2. Bacillus mesentericus

Bacillus mesentericus coøn ñöôïc goïi laø tröïc khuaån khoai taây do chuùng coù

maët chuû yeáu treân khoai taây. Chuùng gaàn gioáng Bacillus subtilis khuaån laïc aên saâu

vaø baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch, beà maët nhaên nhuùm, khoâ, khoâng moïc lan ra

moâi tröôøng, maøu xaùm nhaït-traéng, hoaëc hôi vaøng naâu, hoaëc hoàng nhö Bacillus

mensentericus ruber hoaëc ñen nhö Bacillus mensentericus niger .

Bacillus mensentericus sinh tröôûng phaùt trieån toát nhaát ôû nhieät ñoä 36 –

450C, toái ña 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngöøng phaùt trieån.

Bacillus mensentericus coù hoaït tính amylase vaø protease lôùn hôn haún

Bacillus subtilis, nhöng leân men ñöôøng laïi keùm hôn.

Bacillus mensentericus vaø Bacillus subtilis raát phoå bieán trong töï nhieân,

chuùng laây nhieãm laøm hö hoûng thöïc phaåm, nhaát laø caùc loaïi thöïc phaåm coù chöùa

nitô vaø caùc saûn phaåm giaøu ñöôøng (baùnh keïo, hoa quaû). Ngoaøi ra, chuùng coøn sinh

ra moät loaïi hôïp chaát coù hoaït tính khaùng moät soá vi khuaån khaùc goïi laø bacterioxin,

ôû Bacillus subtilis goïi laø subtilin.

1.1.3. Bacillus cereus

Vi khuaån naøy coù moái quan heä gaàn guõi vôùi Bacillus anthracis, B. mycoides,

B. thuringiensis. Baøo töû cuûa chuùng hình baàu duïc, kích thöôùc 0,9 × (1,2 – 1,5) μm,

naèm leäch taâm, phaùt taùn khaép nôi, trong ñaát, trong khoâng khí…Chuùng thöôøng sinh

soâi naûy nôû treân thöïc phaåm nhö côm vaø coù theå sinh ra ñoäc toá laøm cho thöïc phaåm

hö hoûng vaø gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm.

Teá baøo cuûa B. cereus daøy, kích thöôùc (1 -1,5) × (3 – 5) μm coù khi daøi hôn,

ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh chuoãi.

Khuaån laïc cuûa B. cereus phaúng, hôi loõm, beà maët hôi xuø xì (daïng boät, hoaëc

daïng haït nhoû) traéng ñuïc, meùp loài loõm.

1.1.4. Bacillus megaterium

Megaterium coù nghóa laø “con thuù lôùn”, teá baøo cuûa noù khaù lôùn khoaûng gaáp

hôn 2 laàn teá baøo cuûa Bacillus subtilis, kích thöôùc (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. ÔÛ caùc

oáng nuoâi giaø thì teá baøo ngaén hôn, troøn hôn, ñoâi khi hình thoi vôùi ñaàu heïp laïi. Teá

baøo chöùa nhieàu haït nhoû vaø chaát döï tröõ (haït môõ, glycogen).

Baøo töû lôùn, hình ovan hay baàu duïc, kích thöôùc 1,5 × (0,7 – 1) μm, chuùng

naèm leäch taâm thöôøng theo chieàu ngang hoaëc chieàu xieân cuûa teá baøo.

Khuaån laïc troøn ñeàu, loài nhaün nhöng thöôøng coù voøng vieàn quanh khuaån laïc

hoaëc caùc voøng ñoàng taâm treân beà maët, khoâng thuyø, khoâng neáp, meùp troøn ñeàu hay

löôïn soùng, maøu traéng söõa hay ñuïc, coù khi coù maøu naâu nhaït.

Sinh tröôûng treân moâi tröôøng dinh döôõng ñôn giaûn khoâng caàn theâm baát kyø

yeáu toá dinh döôõng naøo khaùc.

1.1.5. Bacillus pumilus

Baøo töû phaùt taùn roäng, coù maët trong ñaát nhieàu hôn Bacillus subtilis. Khuaån

laïc nhoû, xung quanh vieàn môø lan khoâng ranh giôùi. Teá baøo cuûa noù gaàn gioáng teá

baøo B. subtilis.

1.1.6. Bacillus polymyxa

Kích thöôùc teá baøo laø (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh

ñoâi, chuoãi ngaén. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo seõ phoàng leân hình quaû chanh. Baøo

töû hình baàu duïc keùo daøi khoaûng (1,7 – 2,6 μm), treân beà maët caét ngang nhö hình

sao, naèm giöõa teá baøo, chuùng phaùt taùn roäng.

Khuaån laïc cuûa B. polymyxa voâ maøu, phaúng hoaëc loài, trôn, lan daàn ra xung

quanh, meùp ñoâi khi coù thuyø.

Chuùng thöôøng sinh tröôûng phaùt trieån treân thöïc vaät ñang bò hoûng. Vì vaäy,

ngöôøi ta thöôøng phaân laäp chuùng töø thöïc phaåm. Chuùng laø nguoàn ñeå saûn xuaát

khaùng sinh polymyxin.

1.1.7. Bacillus simplex

Teá baøo B. simplex nhoû beù, coù kích thöôùc (2 – 5) × 0,6 μm, thöôøng ñöùng

rieâng reõ khoâng gaén thaønh chuoãi. Baøo töû hình baàu duïc coù kích thöôùc 0,6 × 0,9 μm,

naèm leäch taâm.

Khuaån laïc cuûa B. simplex gioáng khuaån laïc B. cereus, chæ khaùc laø khuaån laïc

cuûa B. simplex coù khaû naêng sinh saéc toá luïc nhaït, vaøng vaø tieát vaøo moâi tröôøng.

1.1.8. Bacillus brevis

B. brevis laø tröïc khuaån coù kích thöôùc (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, ñöùng rieâng

reõ, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi. Baøo töû coù hình baàu duïc naèm cuoái teá baøo laøm cho teá

baøo coù moät ñaàu hôi phoàng to.

Khuaån laïc cuûa B. brevis maøu traéng, ñoâi khi coù maøu vaøng, loài hoaëc phaúng,

laáp laùnh, meùp raêng cöa gioáng nhö daïng môõ ñaëc.

1.1.9. Bacillus aslersporus

Teá baøo daøy (1,0–1,2) × (3 –7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi. Baøo

töû hình truï hay hình keùo daøi, kích thöôùc 1,0 × (1,5–2) μm, naèm giöõa teá baøo. Khi

hình thaønh baøo töû teá baøo phoàng leân moät chuùt troâng gioáng nhö daïng Clostridium.

Khuaån laïc cuûa B. aslersporus nhoû, maøu traéng hay maøu luïc nhaït, phaúng,

meàm, nhaøy, ñoàng chaát.

1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym [1], [4], [15], [23], [49].

Sinh vaät ñöôïc xem nhö laø moät heä thoáng môû coù lieân quan chaët cheõ ñeán quaù

trình trao ñoåi chaát trong teá baøo cuûa cô theå, vaø giöõa cô theå vôùi moâi tröôøng ngoaøi.

Quaù trình trao ñoåi chaát cuûa sinh vaät laø bieåu hieän sinh ñoäng nhaát cuûa söï soáng. Khi

cô theå khoâng coøn khaû naêng trao ñoåi chaát thì cô theå seõ cheát. Quaù trình trao ñoåi

chaát lieân tuïc ñöôïc xaûy ra giöõa trong vaø ngoaøi teá baøo, taïo neân söï bieán ñoåi lieân tuïc

cuûa vaät chaát trong thieân nhieân. Caùc phaûn öùng sinh hoïc xaûy ra thöôøng xuyeân

khoâng chæ ôû trong teá baøo sinh vaät maø ôû caû ngoaøi moâi tröôøng bao quanh teá baøo.

Caùc phaûn öùng sinh hoïc naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi moät loaïi protein ñaëc bieät ñöôïc goïi

laø enzym. Caùc enzym tham gia phaûn öùng trong teá baøo goïi laø enzym noäi baøo, coøn

caùc enzym thuyû phaân coù chöùc naêng phaân huyû chaát höõu cô ngoaøi teá baøo thaønh

chaát dinh döôõng coù theå haáp thuï vaøo teá baøo goïi laø enzym ngoaïi baøo. Caû hai loaïi

enzym naøy ñeàu ñöôïc toång hôïp trong teá baøo.

1.2.1. Enzym caûm öùng.

Nhöõng enzym ñöôïc taïo thaønh töø VSV khoâng phaûi chæ phuï thuoäc vaøo loaïi

VSV maø coøn phuï thuoäc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, ñieàu kieän nuoâi caáy.

Hieän töôïng treân laø do trong moâi tröôøng coù chaát khoù ñoàng hoaù, VSV tieát vaøo moâi

tröôøng moät hoaëc caùc enzym töông öùng ñeå taïo thaønh chaát coù theå ñoàng hoaù ñöôïc.

Caùc enzym ñöôïc tieát ra nhö theá ñöôïc goïi laø enzym caûm öùng vaø caùc cô chaát

kích thích quaù trình toång hôïp enzym caûm öùng goïi laø chaát caûm öùng.

1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym.

Caùc loaïi enzym ñeàu coù caùc ñaëc tính sinh hoïc chung nhö sau:

+ Enzym ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät.

+ Enzym tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzym ñöôïc

taùch khoûi teá baøo soáng.

+ Enzym tham gia phaûn öùng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoaø, vì enzym

ñöôïc toång hôïp vaø hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä cuûa teá baøo vaø nhieät ñoä cuûa

cô theå. Phaàn lôùn nhieät ñoä cuûa cô theå sinh vaät dao ñoäng trong khoaûng 30-40oC.

+ Enzym coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå.

+ Phaûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. Trong

khi ñoù, caùc phaûn öùng hoaù hoïc ñöôïc xuùc taùc bôûi caùc chaát xuùc taùc hoaù hoïc ñoøi hoûi

naêng löôïng raát lôùn.

+ Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng. Ñieàu naøy

coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc ñieàu khieån söï toång hôïp enzym trong teá baøo sinh vaät.

1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym.

Phaân tích thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa enzym ngöôøi ta chia thaønh hai nhoùm:

+ Nhoùm enzym ñôn caáu töû: laø caùc enzym ñöôïc caáu taïo chæ coù protein. Caùc

hydrolase thuoäc loaïi naøy.

+ Nhoùm enzym ña caáu töû: bao goàm nhöõng enzym coù hai thaønh phaàn:

• Phaàn protein thuaàn ñöôïc goïi laø apoprotein hay apoenzym. Ngaøy nay

môùi tìm thaáy moät soá ARN coù hoaït tính enzym chuyeån hoaù tieàn chaát thaønh caùc

ARN. Caùc enzym ARN ñöôïc goïi laø Ribozim. Hieän nay ñaõ bieát coù 3500 enzym coù

baûn chaát protein vaø 100 ribozim.

• Phaàn thöù hai laø thaønh phaàn khoâng phaûi protein maø laø nhöõng chaát höõu

cô ñaëc hieäu coù vai troø thuùc ñaåy quaù trình xuùc taùc. Thieáu thaønh phaàn thöù hai naøy

thì caùc enzym khoâng hoaït ñoäng, neân goïi chuùng laø chaát coäng taùc (cofactor). Caùc

chaát höõu cô ñaëc hieäu naøy coù theå gaén raát chaët vôùi phaàn protein baèng lieân keát ñoàng

hoaù trò ñöôïc goïi laø nhoùm phuï (prosthetic), hoaëc cuõng coù theå gaén loûng leûo vaø deã

daøng taùch chuùng khoûi protein ñöôïc goïi laø coenzym.

Apoenzym quyeát ñònh tính ñaëc hieäu cao vaø laøm taêng hoaït ñoä xuùc taùc cuûa

enzym. Coøn nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu quyeát ñònh kieåu phaûn öùng, tröïc tieáp

tham gia phaûn öùng vaø laøm taêng ñoä beàn cuûa apoenzym ñoái vôùi caùc yeáu toá gaây

bieán tính.

Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn cuûa enzym coøn coù söï hieän dieän moät soá kim

loaïi, caùc kim loaïi naøy thöôøng raát deã taùch ra khoûi enzym. Trong tröôøng hôïp

enzym maát kim loaïi chuùng seõ maát hoaït tính. Khi ñöa trôû laïi caùc kim loaïi töông

öùng vaøo enzym thì hoaït tính cuûa enzym laïi ñöôïc khoâi phuïc, tính chaát naøy mang

tính thuaän nghòch. Vai troø cuûa kim loaïi trong hoaït ñoäng cuûa enzym vaãn chöa thöïc

söï laøm saùng toû. Tuy nhieân caùc nhaø khoa hoïc cho raèng coù theå kim loaïi ñoùng vai

troø lieân keát giöõa enzym vaø cô chaát, giöõa apoenzym vaø coenzym, tham gia tröïc

tieáp vaøo quaù trình vaän chuyeån ñieän töû nhö vai troø cuûa saét trong cytochrome vaø

peroxydase.

1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym.

Enzym coù theå hoaø tan trong nöôùc, trong dung dòch muoái loaõng taïo thaønh

caùc dung dòch keo öa nöôùc, nhöng enzym khoâng tan trong dung moâi khoâng phaân

cöïc. Khi enzym ñöôïc hoaø tan vaøo nöôùc, caùc phaân töû nöôùc löôõng cöïc seõ keát hôïp

vôùi caùc ion, caùc nhoùm ion hoaëc caùc nhoùm phaân cöïc trong phaân töû enzym taïo

thaønh lôùp voû hydrat. Löôïng nöôùc hydrat naøy khaù lôùn vaø coù vai troø quan troïng laøm

moâi tröôøng cho caùc phaûn öùng sinh hoaù.

Enzym bò keát tuûa bôûi caùc taùc nhaân gaây tuûa protein nhö muoái trung tính baõo

hoaø (NaCl, (NH4)2SO4 …), dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä thaáp (etanol, aceton…) neân

caùc chaát naøy ñöôïc duøng ñeå thu cheá phaåm enzym hoaït ñoäng. Tuy nhieân, protein

seõ bò bieán tính laøm cho enzym maát hoaït tính do söï taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân

nhö: nhieät ñoä cao, moâi tröôøng acid hay kieàm quaù cao, caùc muoái kim loaïi naëng. Vì

vaäy, ngöôøi ta ñaõ duøng caùc yeáu toá treân ñeå kìm haõm hoaït tính enzym khi caàn thieát.

1.2.5. Caáu truùc enzym.

Khoâng phaûi toaøn boä caùc thaønh phaàn cuûa enzym tham gia vaøo hoaït ñoäng

xuùc taùc, maø chæ coù nhöõng boä phaän raát ñaëc bieät mang tính ñaëc hieäu trong phaân töû

enzym môùi tham gia xuùc taùc phaûn öùng. Boä phaän ñaëc hieäu naøy ñöôïc goïi laø trung

taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Phaàn coøn laïi ñoùng vai troø nhö moät caùi khung, giöõ cho

caáu truùc khoâng gian thích hôïp vôùi khaû naêng xuùc taùc. Moãi enzym thöôøng coù moät

trung taâm hoaït ñoäng. Tuy nhieân cuõng coù enzym coù hai thaäm chí coù boán trung taâm

hoaït ñoäng.

1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym

Baûn chaát cuûa caùc phaûn öùng enzym laø khi coù söï tham gia xuùc taùc cuûa caùc

enzym, caùc cô chaát seõ ñöôïc hoaït hoaù maïnh, töø ñoù laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc

cuûa cô chaát. Döôùi taùc duïng cuûa enzym, cô chaát coù theå coù nhöõng thay ñoåi khoâng

chæ veà caáu truùc hoaù hoïc, maø coøn thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc. Quaù trình xuùc taùc

cuûa enzym xaûy ra qua ba giai ñoaïn:

• Giai ñoaïn thöù nhaát: enzym seõ keát hôïp vôùi cô chaát baèng nhöõng lieân keát

yeáu, nhôø ñoù seõ taïo ra phöùc heä enzym-cô chaát thöôøng khoâng beàn, phaûn öùng xaûy ra

raát nhanh, ñoøi hoûi moät ít naêng löôïng.

• Giai ñoaïn thöù hai: cô chaát bò thay ñoåi caáu hình khoâng gian vaø möùc ñoä

beàn vöõng cuûa caùc lieân keát. Keát quûa laø caùc lieân keát trong cô chaát bò phaù vôõ.

• Giai ñoaïn thöù ba: ñaây laø giai ñoaïn cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh

vaø taùch khoûi enzym. Enzym ñöôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do nhö ban ñaàu.

Cô cheá xuùc taùc toång quaùt cuûa enzym ñöôïc toùm taét nhö sau:

E + S ↔ ES → E + P

Trong ñoù, E: enzym (enzyme); S: cô chaát (substrate); P: saûn phaåm

(products).

1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym.

• Noàng ñoä cô chaát

Khi phaân giaûi moät loaïi cô chaát naøo ñoù, phaàn cô cheá taùc duïng cuûa enzym

cho thaáy phaûn öùng khi coù enzym tham gia seõ traûi qua ba giai ñoaïn:

Giai ñoaïn ñaàu neáu noàng ñoä cô chaát thaáp thì vaän toác phaûn öùng (V) phuï

thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát.

Giai ñoaïn keá tieáp neáu V xaáp xæ giaù trò cöïc ñaïi thì V khoâng phuï thuoäc vaøo

cô chaát.

Giai ñoaïn tieáp theo neáu noàng ñoä cô chaát tieáp tuïc taêng cao thì haàu nhö V

khoâng taêng nöõa maø ñaït giaù trò gaàn vôùi Vmax vì caùc enzym ñaõ baõo hoaø cô chaát.

• Noàng ñoä enzym

Neáu thöøa cô chaát, V phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng ñoä enzym: V = k[E]

Trong ñoù: V: vaän toác phaûn öùng

[E]: noàng ñoä enzym

k: haèng soá vaän toác phaûn öùng.

• Nhieät ñoä

Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán phaûn öùng enzym. Toác ñoä phaûn öùng chæ

taêng ñeán moät giôùi haïn nhieät ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù nhieät ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng

seõ giaûm vaø daãn ñeán möùc trieät tieâu do caáu truùc protein ñaõ bò phaù vôõ. Nhieät ñoä toái

öu cuûa nhöõng enzym khaùc nhau laø hoaøn toaøn khaùc nhau. Phaàn lôùn enzym hoaït

ñoäng maïnh nhaát ôû nhieät ñoä 40-50oC, coù moät soá enzym khaùc laø 600C hoaëc 700C,

thaäm chí moät soá enzym cuûa vi khuaån Bacillus subtilis laïi hoaït ñoäng maïnh ôû 900C.

Neáu taêng nhieät ñoä cao hôn möùc toái öu thì hoaït tính cuûa enzym seõ bò giaûm,

khi ñoù enzym khoâng coù khaû naêng phuïc hoài laïi hoaït tính. Ngöôïc laïi, ôû nhieät ñoä

00C thì hoaït tính cuûa enzym bò haïn cheá raát maïnh, nhöng khi ñöa nhieät ñoä leân töø

töø thì hoaït tính cuûa enzym seõ taêng daàn ñeàu ñeán möùc toái öu.

Nhieät ñoä toái öu cuûa moät enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo söï coù maët cuûa cô

chaát, kim loaïi, pH, caùc chaát baûo veä.

Ngöôøi ta thöôøng söû duïng heä soá nhieät Q10 ñeå bieåu thò aûnh höôûng cuûa nhieät

ñoä ñeán vaän toác phaûn öùng. Heä soá naøy caøng lôùn thì phaûn öùng caøng khoù xaûy ra ôû

nhieät ñoä thöôøng.

• pH moâi tröôøng

pH thöôøng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä ion hoaù cô chaát, enzym, vaø ñaëc bieät aûnh

höôûng ñeán ñoä beàn cuûa enzym. Ña soá enzym beàn ôû pH = 5-9, ñoä beàn cuûa enzym

taêng neáu coù maët cô chaát, coenzym, hoaëc Ca2+. Moãi enzym coù moät giaù trò pH toái

öu (pHopt) taïi ñoù V ñaït Vmax.

Nhieàu enzym hoaït ñoäng raát maïnh ôû pH trung tính, cuõng coù enzym hoaït

ñoäng ôû pH acid hoaëc pH kieàm.

• Caùc chaát kìm haõm (I)

Caùc chaát kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzym laøm giaûm hoaït tính enzym nhöng

laïi khoâng bò enzym laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc, caáu taïo hoaù hoïc vaø tính chaát

vaät lyù cuûa chuùng. Caùc chaát naøy bao goàm caùc ion, caùc phaân töû voâ cô, caùc chaát höõu

cô vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm coù yù nghóa raát lôùn trong ñieàu khieån caùc quùa

trình trao ñoåi chaát ôû teá baøo sinh vaät.

Cô cheá kìm haõm cuûa caùc chaát kìm haõm coù theå thuaän nghòch hoaëc khoâng

thuaän nghòch, ñaëc hieäu hoaëc khoâng ñaëc hieäu. Sau ñaây chuùng ta chæ xeùt caùc chaát

kìm haõm thuaän nghòch. Tuyø thuoäc vaøo baûn chaát taïo phöùc EI, baûn chaát cuûa chaát

kìm haõm ngöôøi ta chia thaønh caùc loaïi chaát kìm haõm sau:

 Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh

Caùc chaát naøy coù caáu truùc töông töï nhö caáu truùc cuûa cô chaát vì theá chuùng

coù khaû naêng keát hôïp vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû laø trung taâm

hoaït ñoäng cuûa enzym bò chaát kìm haõm chieám maát, do ñoù cô chaát maát moät phaàn

khaû naêng töông taùc laøm toác ñoä phaûn öùng giaûm.

 Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh

Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi enzym ôû moät vò trí khoâng

phaûi trung taâm hoaït ñoäng, keát quaû laø chuùng laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa

phaân töû enzym theo chieàu höôùng baát lôïi cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Vì theá caùc chaát

kìm haõm laøm giaûm hoaït ñoäng cuûa enzym.

Khi keát hôïp vôùi chaát kìm haõm, enzym vaãn coù khaû naêng keát hôïp vôùi cô chaát

khi ñoù seõ taïo thaønh phöùc hôïp EIS.

Trong thöïc teá chaát kìm haõm chæ keát hôïp vôùi phöùc hôïp ES maø khoâng keát hôïp

vôùi E töï do. Caùc chaát kìm haõm coù theå laø nhöõng chaát sau:

 Kìm haõm bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng

Caùc saûn phaåm cuûa phaûn öùng coù theå ñoùng vai troø nhö chaát kìm haõm khoâng

caïnh tranh. Neáu enzym xuùc taùc cho phaûn öùng cuûa cô chaát A vaø B taïo thaønh saûn

phaåm P1 vaø P2, enzym coù aùi löïc vôùi P1, P2 vaø caû cô chaát A, B. Khi ñoù P1vaø P2 trôû

thaønh chaát kìm haõm cuûa enzym.

 Kìm haõm do thöøa cô chaát

Khi ES ñöôïc taïo thaønh coù theå coù moät cô chaát gaén vôùi ES laøm chuùng khoâng

theå chuyeån hoaù tieáp ñöôïc: ES + S ↔ ESS

• Chaát hoaït hoaù

Laø nhöõng chaát coù taùc duïng laøm taêng hoaït tính enzym. Chaát hoaït hoaù enzym

coù theå laø anion, caùc ion kim loaïi, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp coù nhieäm

vuï chuyeån nhoùm hydrogen hoaëc phaù vôõ moät soá lieân keát trong phaân töû tieàn enzym

hoaëc phuïc hoài caùc nhoùm chöùc naêng trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym.

Caùc chaát hoaït hoaù chæ coù taùc duïng hoaït hoaù ôû moät noàng ñoä nhaát ñònh, vöôït

quaù noàng ñoä naøy chuùng seõ gaây öùc cheá hoaït ñoäng cuûa enzym.

1.3. Heä enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44]

Amylase thuoäc heä enzym thuyû phaân (hydrolase) chuùng thuyû phaân caùc lieân

keát α-1,4 vaø α-1,6 glucoside cuûa tinh boät. Töø xöa chuû yeáu ngöôøi ta thu nhaän

amylase töø malt, nhöng ngaøy nay vieäc thu nhaän chuû yeáu töø nuoâi caáy VSV.

Cuõng nhö nhieàu VSV khaùc, vi khuaån Bacillus taïo ra raát nhieàu enzym

ngoaïi baøo nhö: amylase, protease, celullase,... Trong ñoù amylase raát quan troïng

vì chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán vaø mang laïi nhieàu lôïi ích cho neàn saûn xuaát coâng

nghieäp. Caùc loaïi amylase thöôøng gaëp khi nuoâi caáy VSV goàm: α – amylase, β-

amylase vaø γ-amylase.

1.3.1. Giôùi thieäu veà enzym α – amylase.

• Caáu taïo:

α-amylase coù caáu taïo goàm 3 tieåu ñôn vò:

* A laø tieåu ñôn vò loõi coù caáu truùc ñaëc tröng helix (α/β) 8 barel.

* Tieåu ñôn vò C ñöôïc noái vôùi A coù caáu truùc taùm ñoaïn β-sheet song song.

* Tieåu ñôn vò B goàm hai ñoaïn β-sheet ñöôïc loàng vaøo giöõa ñoaïn β-sheet thöù

ba vaø α-helix thöù ba cuûa tieåu ñôn vò A. Tieåu ñôn vò B quyeát ñònh ñoä beàn hoaït ñoä

cuûa enzym vaø lieân keát enzym-cô chaát. Ion canxi noái giöõa tieåu ñôn vò A vaø B, coù

töø 1-30 nguyeân töû gam Ca/mol.

Khi taùch hoaøn toaøn canxi ra khoûi enzym thì α-amylase maát heát hoaït tính, vì

Ca duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzym. Maët khaùc, Ca coøn coù taùc duïng ñaûm

baûo ñoä beàn raát lôùn cuûa enzym ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï thuyû phaân

cuûa caùc enzym phaân giaûi protein.

Tuyø thuoäc vaøo daïng enzym maø coù theå coù theâm moät soá tieåu ñôn vò khaùc ñöôïc

gaén vôùi ñaàu C-terminal hoaëc ñaàu N-terminal cuûa phaân töû protein.

Taâm hoaït ñoäng cuûa α-amylase coù chöùa caùc nhoùm –COOH vaø NH3 .

Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase [50]

• Tính chaát lyù hoùa

Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau thöôøng khoâng

gioáng nhau.

- pH

pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø naám sôïi laø 4,5-4,8 vaø cuûa vi

khuaån laø 5,8-6,0. Nhìn chung pH toái öu naèm trong khoaûng acid yeáu 4,8-6,9.

pH<4,0 α-amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït hoaøn toaøn, tuy nhieân moät soá α-

amylase chòu acid cao nhö cuûa Bacillus acidocaldarious (pH toái thích laø 3,5) vaø

chòu kieàm maïnh nhö B. licheniformis (pH toái thích laø 9,0).

- Nhieät ñoä

Nhìn chung α-amylase beàn nhieät hôn so vôùi caùc amylase khaùc, ñaëc tính

naøy ñöôïc cho raèng coù lieân quan ñeán haøm löôïng ion canxi trong phaân töû (α-

amylase cuûa caùc vi khuaån öa nhieät coù chöùa canxi nhieàu hôn α - amylase cuûa naám

moác 3 - 4 laàn). α - amylase cuûa vi khuaån coù ñoä beàn nhieät cao hôn caû.

Baûng 1.1. Ñoä beàn nhieät cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau

(theo Miller, Johson vaø Palmer)

Nhieät ñoä (oC) Hoaït ñoä α-amylase, % so vôùi hoaït ñoä ban ñaàu

cuûa naám sôïi cuûa malt cuûa vi khuaån

100 100 100 65

100 100 52 70

100 58 3 75

92 25 - 80

58 1 - 85

52 - - 90

8 - - 95

Tính beàn nhieät cao cuûa α-amylase vi khuaån laø moät öu ñieåm lôùn. Vì trong

saûn xuaát α-amylase ñöôïc söû duïng ñeå xöû lyù nguyeân lieäu ôû coâng ñoaïn phaûi duøng

nhieät ñoä cao.

• Cô cheá taùc duïng

α-amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát α-1,4 glucoside trong phaân töû

polysaccharid moät caùch ngaãu nhieân. Vì theá ngöôøi ta goïi noù laø enzym amylase noäi

phaân (endoamylase). Khi taùc duïng leân tinh boät taïo ra saûn phaåm chuû yeáu laø

dextrin phaân töû löôïng thaáp (phaûn öùng khoâng maøu vôùi iod), ngoaøi ra coøn coù

maltose, vaø moät ít glucose. Vì vaäy, ngöôøi ta goïi α-amylase laø amylase dextrin

hoaù hay amylase dòch hoaù.

1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase.

Enzym coù theå ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn khaùc nhau nhö ñoäng vaät, thöïc

vaät, vi sinh vaät (VSV). Tuy nhieân vieäc khai thaùc enzym töø thöïc vaät, ñoäng vaät

thöôøng gaëp khoù khaên vì nguoàn nguyeân lieäu haïn cheá, hieäu suaát thaáp neân giaù

thaønh cao. Hieän nay phaàn lôùn enzym ñeàu ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät, vì coù

nhöõng ñieåm noåi baät sau:

- VSV coù toác ñoä sinh tröôûng, phaùt trieån vaø sinh saûn cöïc kyø nhanh, töø ñoù

toång hôïp enzym vôùi cöôøng ñoä raát maïnh, neân trong moät thôøi gian ngaén coù theå thu

ñöôïc moät löôïng enzym raát lôùn.

- Heä enzym cuûa VSV raát phong phuù, töø caùc chuûng VSV khaùc nhau ta coù

theå thu nhaän ñöôïc nhieàu loaïi enzym khaùc nhau, trong ñoù coù nhöõng enzym

chuyeân bieät chæ coù ôû VSV maø haàu nhö khoâng thaáy ôû ñoäng vaät, thöïc vaät.

- Moâi tröôøng nuoâi caáy VSV ñôn giaûn, reû tieàn, thöôøng laø nhöõng pheá phuï

lieäu cuûa ngaønh coâng nghieäp neân giaù thaønh enzym reû hôn vaø deã aùp duïng cho caùc

cô sôû saûn xuaát.

- VSV chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi thaønh phaàn dinh döôõng, caùc taùc ñoäng

cuûa moâi tröôøng, do ñoù ngöôøi ta coù theå thay ñoåi thaønh phaàn dinh döôõng hoaëc caùc

yeáu toá taùc ñoäng ñeå ñieàu khieån quaù trình toång hôïp enzym theo yeâu caàu.

- Vieäc caûi taïo gioáng VSV ñeå taïo ra caùc chuûng VSV coù khaû naêng toång hôïp

ra caùc loaïi enzym theo yù muoán coù theå thöïc hieän ñöôïc vaø chæ trong thôøi gian ngaén,

vì khaû naêng thích öùng vôùi moâi tröôøng cuûa VSV laø raát maïnh.

- Saûn xuaát enzym töø VSV coù theå thöïc hieän treân qui moâ coâng nghieäp, töï

ñoäng hoùa vaø cô giôùi hoaù.

Ngöôøi ta ñaõ bieát nhieàu loaïi VSV coù khaû naêng toång hôïp amylase, trong ñoù

ñöôïc söû duïng nhieàu hôn caû laø naám sôïi, giaû naám men vaø vi khuaån, coøn xaï khuaån

thì ít hôn.

- Caùc gioáng naám sôïi thöôøng ñöôïc duøng ñeå thu amylase laø Aspergillus,

Rhizopus.

- Nhieàu chuûng vi khuaån cuõng coù khaû naêng taïo löôïng lôùn amylase nhö:

Bacillus polymyxa, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutylicum,… trong

ñoù caùc chuûng vi khuaån öa nhieät taïo nhieàu amylase ñaùng chuù yù laø Bacillus

diastaticus, B. stearothermophilus, B. coagulans, B. circulans; vi khuaån öa aåm taïo

amylase maïnh ñöôïc nghieân cöùu nhieàu hôn caû vaø söû duïng roäng raõi nhaát laø B.

subtilis.

Nhöõng chuûng VSV taïo nhieàu amylase thöôøng ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn

töï nhieân. Trong coâng nghieäp, caùc bieán chuûng taïo ra ñöôïc baèng caùch gaây ñoät

bieán, nhôø taùc nhaân lyù hoïc hoaëc hoaù hoïc hoaëc phoái hôïp caû hai loaïi taùc nhaân treân,

laø nhöõng chuûng hoaït ñoäng raát maïnh vaø coù khaû naêng sinh toång hôïp nhieàu

amylase.

1.3.3 Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh toång hôïp amylase cuûa VSV [18], [23]

 Gioáng vi sinh vaät

Coù raát nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh amylase vaø löôïng

amylase cuûa VSV nhö: chuûng VSV, moâi tröôøng dinh döôõng, ñieàu kieän nuoâi

caáy,… Trong caùc yeáu toá treân thì chuûng gioáng VSV laø ñieàu kieän ñaàu tieân vaø cô

baûn nhaát.

Khoâng phaûi caùc chuûng VSV ñeàu coù khaû naêng toång hôïp amylase nhö nhau.

Ngay caû nhöõng chuûng cuøng chi, thaäm chí laø cuøng loaøi cuõng raát khaùc nhau veà

löôïng enzym do chuùng sinh ra. Chính vì theá maø vieäc tuyeån choïn chuûng VSV coù

khaû naêng taïo nhieàu amylase laø voâ cuøng quan troïng.

Ngoaøi vieäc tuyeån gioáng coù khaû naêng sinh amylase cao, thì vieäc baûo quaûn

gioáng, tieán haønh nuoâi caáy trong ñieàu kieän toái öu cuõng voâ cuøng quan troïng nhaèm

ñaûm baûo khaû naêng sinh toång hôïp enzym cao nhaát vaø oån ñònh nhaát. Vì taàm quan

troïng nhö vaäy maø nhieàu nöôùc treân theá giôùi ñaõ ñöa coâng taùc naøy leân taàm côõ quoác

gia vaø ñaõ thaønh laäp caùc trung taâm, chi nhaùnh giöõ gioáng goïi laø baûo taøng VSV.

 Nguoàn dinh döôõng

Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caàn phaûi ñaûm baûo ñaày ñuû, thích hôïp caùc

thaønh phaàn vaø tæ leä caùc chaát dinh döôõng cho töøng VSV cuï theå.

• AÛnh höôûng nguoàn cacbon

Thaønh phaàn vaø haøm löôïng cacbon coù aûnh höôûng lôùn ñeán sinh toång hôïp

enzym. Theo soá lieäu cuûa Grigorev veà aûnh höôûng cuûa nguoàn cacbon tôùi cöôøng ñoä

sinh toång hôïp amylase coù theå xeáp theo thöù töï sau:

Vôùi α–amylase: tinh boät > dextrin > maltozô > lactozô > glucozô >

sacarozô > galactozô > manozô > arabinozô.

Vôùi glucoamylase: tinh boät > dextrin > maltozô > sacarozô > glucozô >

lactozô > lactozô > arabinozô > galactozô > manozô.

Noàng ñoä nguoàn cacbon cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym. Moãi

loaøi VSV chæ coù theå thích hôïp vôùi moät noàng ñoä hydratcacbon nhaát ñònh.

• AÛnh höôûng nguoàn nitô

Nitô caàn cho söï hình thaønh caùc axit amin ñeå caáu taïo neân caùc protein caáu

truùc cho caùc phaân töû cuûa enzym. Nguoàn nitô boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy coù

theå laø nitô voâ cô hoaëc nitô höõu cô. Nguoàn nitô thöôøng duøng laø nitrat amon, sunfat

amon, ureâ,… Caùc hôïp chaát höõu cô laø nhöõng nguyeân lieäu giaøu ñaïm nhö cao ngoâ,

boät ñaäu töông, khoâ laïc, khoâ ñaäu,… Ngoaøi ra moät soá axit amin, bazô purin,

pyrimidin cuõng thöôøng ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy VSV.

Ngoaøi hai nhaân toá cô baûn treân, trong moâi tröôøng dinh döôõng cuûa VSV sinh

enzym noùi chung caàn phaûi coù maët nhieàu nguyeân toá khoaùng ôû daïng muoái magieâ,

photpho, kali,…vaø caùc nguyeân toá vi löôïng. Ví duï ion Mg2+ coù taùc duïng laøm oån

ñònh amylase ôû nhieät ñoä cao, Ca2+ coù trong thaønh phaàn protein cuûa α – amylase.

 Ñieàu kieän nuoâi caáy

Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caùc yeáu toá nhö, nhieät ñoä, ñoä pH, ñoä aåm,

thôøi gian nuoâi caáy,… cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym cuûa VSV.

• AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä

Nhieät ñoä toái thích cho sinh toång hôïp enzym cuûa caùc VSV laø khaùc nhau. Ví

duï ôû ña soá naám moác treân moâi tröôøng raén laø 28-32oC, cuûa vi khuaån 30-35oC.

• AÛnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng

pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán söï phaùt trieån vaø taïo

thaønh enzym. Ña soá naám moác phaùt trieån vaø taïo amylase ôû moâi tröôøng axit yeáu,

trong khi ñoù vi khuaån laïi thích hôïp trong moâi tröôøng trung tính. pH moâi tröôøng

khoâng chæ aûnh höôûng ñeán löôïng enzym toång hôïp maø coøn aûnh höôûng ñeán chuûng

loaïi enzym ñöôïc toång hôïp. Ví duï ôû Asperillus oryzae khi pH moâi tröôøng laø 6,5 thì

öu theá toång hôïp thuoäc veà α – amylase, trong khi ñoù öu theá toång hôïp

glucoamylase khi pH moâi tröôøng laø 4,5.

• AÛnh höôûng ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy

Trong quaù trình saûn xuaát caàn phaûi duy trì ñoä aåm cuûa moâi tröôøng, vì ñoä aåm

seõ laøm giaûm ñoä thoaùng khí cuûa moâi tröôøng, coøn ñoä aåm thaáp laïi kìm haõm söï sinh

tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV. Ñoä aåm moâi tröôøng xoáp thích hôïp nuoâi naám moác laø

50 – 60%, coøn ñoái vôùi vi khuaån laø 50 – 70%.

• AÛnh höôûng thôøi gian nuoâi caáy

Thôøi gian nuoâi caáy aûnh höôûng lôùn ñeán söï hình thaønh enzym. Ñoái vôùi ña soá

naám moác khi nuoâi ôû moâi tröôøng xoáp söï taïo thaønh amylase cöïc ñaïi thöôøng keát

thuùc khi naám moác baét ñaàu sinh baøo töû, thôøi gian keát thuùc söï taïo thaønh amylase

thöôøng töø 30-42 giôø. Coøn ñoái vôùi vi khuaån söï taïo thaønh amylase toát nhaát töø

khoaûng 40-50 giôø. Coøn nuoâi caáy chìm sinh tröôûng cuûa chuûng gioáng ñaït cöïc ñaïi

tôùi pha oån ñònh tröôùc, khoaûng töø 5 ñeán 8 giôø sau thì hoaït ñoä enzym ñaït cöïc ñaïi.

1.3.4. Taùch chieát enzym töø caùc nguoàn nguyeân lieäu [4], [10], [12], [14]

- Ñoái vôùi enzym ngoaïi baøo: ngöôøi ta taùch sinh khoái vaø caùc chaát caën baõ khoûi

canh tröôøng baèng phöông phaùp loïc hoaëc ly taâm. Söû duïng theâm caùc chaát trôï loïc

(diatomite, than hoaït tính…) hoaëc caùc chaát taïo keát tuûa ñeå caùc chaát naøy deã daøng bò

laéng caën keùo theo sinh khoái giuùp quaù trình loïc deã daøng hôn.

- Ñoái vôùi enzym noäi baøo: ñeå thu nhaän enzym caàn phaûi phaù vôõ teá baøo baèng

caùc phöông phaùp sau:

▪ Phöông phaùp vaät lyù

Nghieàn teá baøo trong maùy ñoàng hoaù hoaëc nghieàn vôùi boät thuyû tinh hay caùt

traéng saïch trong coái söù. Thay ñoåi nhieät ñoä ñoät ngoät hoaëc taïo aùp suaát thaåm thaáu

cao ñeå phaù vôõ thaønh teá baøo.

▪ Phöông phaùp hoaù hoïc

Söû duïng acid ñeå thuyû phaân thaønh teá baøo. Tuy nhieân cho acid quaù nhieàu coù

theå laøm bieán tính enzym. Hoaëc coù theå duøng kieàm, nhöng neáu enzym coù tính acid

thì khoâng duøng ñöôïc.

▪ Phöông phaùp sinh hoïc

Phöông phaùp sinh hoïc ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát laø phöông phaùp enzym.

Duøng caùc enzym töông öùng vôùi caùc cô chaát coù trong thaønh teá baøo ñeå thuyû phaân,

nhö vaäy thaønh teá baøo seõ bò phaù vôõ.

Sau khi phaù vôõ teá baøo, caùc enzym ñöôïc taùch chieát baèng caùc dung moâi

khaùc nhau nhö: nöôùc, dung dòch ñeäm, muoái trung tính. Phaàn lôùn caùc enzym thuyû

phaân tan toát trong nöôùc, do ñoù nöôùc laø dung moâi toát nhaát ñeå chieát ruùt enzym, coù

theâm moät ít focmalin ñeå saùt truøng. Nhieät ñoä nöôùc ñeå ruùt chieát enzym thöôøng laø

25-280C. Caàn laøm laïnh nhanh dòch chieát xuoáng 10-120C ñeå ngaên caûn VSV laï phaù

hoûng dòch enzym.

1.3.5 ÖÙng duïng cuûa amylase trong thöïc teá saûn xuaát vaø ñôøi soáng [6], [15],

[28], [29], [46]

 Trong saûn xuaát baùnh keïo

Muïc ñích cuûa vieäc söû duïng enzym vaøo saûn xuaát caùc loaïi baùnh quy laø laøm

taêng muøi vaø vò cuûa baùnh. Theâm caùc enzym protease vaø amylase khi cheá bieán boät

laøm taêng haøm löôïng caùc acid amin töï do vaø löôïng ñöôøng khöû, töø ñoù chuùng tham

gia vaøo caùc phaûn öùng oxi hoaù khöû vaø keát quûa taïo cho baùnh quy coù muøi, vò vaø

maøu haáp daãn.

 Trong coâng ngheä saûn xuaát baùnh mì

Trong saûn xuaát baùnh mì, enzym ñöôïc xem nhö chaát phuï gia ñeå laøm taêng

chaát löôïng baùnh: laøm taêng theå tích baùnh, baùnh coù maøu saéc ñeïp hôn vaø muøi thôm

hôn. Trong quaù trình saûn xuaát ngöôøi ta söû duïng enzym protease, α-amylase, β-

amylase, trong ñoù:

o Enzym protease coù taùc duïng laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa boät nhaøo do gluten

gaây ra vaø laøm taêng heä soá tieâu hoaù protein.

o Enzym α-amylase, β-amylase tham gia thuyû phaân tinh boät taïo ra

ñöôøng, nhôø ñoù naám men deã daøng chuyeån hoaù ñöôøng thaønh coàn, CO2, töø ñoù laøm

taêng theå tích cuûa baùnh vaø taïo maøu saéc, höông vò cuûa baùnh.

Ngaøy nay, nguoàn enzym amylase vaø protease ñöôïc söû duïng chuû yeáu töø

naám moác Aspergillus oryzae, vaø A. awamori.

 Trong saûn xuaát bia

Ngaøy nay, caùc nöôùc treân theá giôùi öùng duïng enzym trong caùc coâng ñoaïn saûn

xuaát bia. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng enzym amylase vaø protease cuûa vi khuaån, vì

caùc loaïi enzym thu nhaän töø vi khuaån thöôøng coù hoaït tính cao vaø khaû naêng chòu

nhieät ñoä cao raát toát maø nhieät ñoä cao thöôøng laøm bieán tính enzym trong malt.

Ngöôøi ta söû duïng roäng raõi cheá phaåm enzym amylase cuûa naám moác

Aspergillus oryzae, A. niger, A. awamori,…vaø cuûa vi khuaån Bacillus subtilis, B.

diastaticus,…ñeå ñöôøng hoaù thay malt. Duøng amylase VSV coù theå thay theá töø 50-

100% malt baèng nguyeân lieäu khaùc nhö boät gaïo, boät baép, boät saén…nhöng thoâng

thöôøng chæ thay theá töø 60-70% malt thì chaát löôïng bia toát hôn, thôm ngon hôn.

YÙ nghóa cuûa vieäc söû duïng enzym VSV thay theá malt trong saûn xuaát bia ñaõ

tieát kieäm ñöôïc haøng taán malt ñaïi maïch loaïi toát, giaûm giaù thaønh vaø ruùt ngaén thôøi

gian saûn xuaát. Ñoái vôùi Vieät Nam cuõng nhö nhöõng nöôùc phaûi nhaäp malt vôùi giaù

thaønh cao thì bieän phaùp treân coù yù nghóa to lôùn.

 Trong saûn xuaát röôïu

Söû duïng amylase cuûa VSV ôû giai ñoaïn ñöôøng hoaù trong saûn xuaát röôïu, coàn

ñaõ ruùt ngaén thôøi gian vaø taêng hieäu suaát do khaû naêng thuyû phaân saâu saéc cuûa phöùc

heä enzym VSV. Vai troø cuûa α-amylase trong saûn xuaát röôïu laø laøm dòch hoaù

nhanh ôû giai ñoaïn naáu vaø ôû caû giai ñoaïn ñaàu cuûa söï ñöôøng hoaù, dextrin hoaù vaø

tích tuï ñöôøng.

Enzym amylase ñöôïc thu nhaän töø naám moác Aspergillus usamii, A. awamori,

A. oryzae vaø töø vi khuaån Bacillus subtilis, B. diastaticus. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa

söï thuyû phaân tinh boät nhôø amylase naám moác chuû yeáu laø glucose, ñöôøng deã leân

men, do ñoù söï leân men röôïu xaûy ra nhanh hôn. Coøn cheá phaåm amylase töø vi

khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao neân ñöôïc söû duïng trong giai ñoaïn dòch hoaù tinh boät

tröôùc khi ñöôøng hoaù laø raát thích hôïp.

 Trong saûn xuaát maät tinh boät

Ngaøy nay ngöôøi ta duøng cheá phaåm amylase VSV thay cho acid vaø malt ñeå

thuyû phaân tinh boät taïo maät tinh boät (maät glucose, maltose). Khi thuyû phaân tinh

boät nhôø amylase VSV laøm cho chaát löôïng dòch thuyû phaân toát hôn vaø deã daøng tinh

cheá hôn, vì khoâng xaûy ra söï phaân huyû ñöôøng bôûi acid, bôûi nhieät, vaø khoâng phaân

huyû caùc taïp chaát coù laãn trong tinh boät.

Hai loaïi enzym ñöôïc söû duïng chuû yeáu laø α-amylase vaø γ-amylase

(glucoamylase) töø naám moác, vi khuaån vaø giaû naám men. α-amylase duøng ñeå dòch

hoaù tinh boät vaø taïo maltose, coøn γ-amylase duøng ñeå ñöôøng hoaù taïo glucose.

 Trong saûn xuaát chaát taåy röûa

Enzym amylase coù khaû naêng phaân giaûi caùc veát baån do carbohydrate trong

quaàn aùo. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng α-amylase cuûa vi khuaån vì enzym naøy thöôøng

chòu ñöôïc nhieät ñoä cao (ñeán 90oC) vaø pH kieàm (pH = 9). Ngoaøi ra, enzym naøy

coøn ñöôïc duøng phoái hôïp vôùi protease kieàm cho hieäu quaû taåy röûa caùc chaát

carbohydrate vaø protein ñöôïc toát hôn.

 Trong coâng nghieäp deät

Enzym amylase ñöôïc duøng ñeå ruõ hoà vaûi tröôùc khi taåy traéng vaø nhuoäm.

Trong vaûi moäc chöùa 5% tinh boät vaø nhieàu taïp chaát khaùc. Ñeå laøm vaûi meàm, coù

khaû naêng nhuùng öôùt, taåy traéng vaø baét maøu toát khi nhuoäm thì nhaát thieát phaûi taùch

boû tinh boät.

Ngaøy nay, ngöôøi ta söû duïng α-amylase cuûa VSV nhö vi khuaån Bacillus

subtilis, Bacillus mesentericus hay naám moác Aspergillus oryzae thay cho amylase

malt vaø pancreatin. α-amylase cuûa vi khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao, hoaït ñoäng

maïnh ôû 85-90oC. Moät soá enzym cuûa amylase cuûa B.subtilis coù theå hoaït ñoäng ôû

105-115oC.

Khi ruõ hoà vaûi, löôïng cheá phaåm enzym tính cho moãi lít dung dòch laø 0,3-0,6g,

nhieät ñoä xöû lyù laø 90oC, trong thôøi gian töø 5-15 phuùt. Phöông phaùp naøy khoâng laøm

haïi vaûi, maø taïo ñoä mao daãn toát ñoàng thôøi ñaûm baûo veä sinh.

 Trong chaên nuoâi

Amylase ñöôïc söû duïng rieâng reõ hay phoái hôïp vôùi caùc enzym khaùc nhö

protease, cellulase, pectinase…ñeå saûn xuaát caùc loaïi thöùc aên deã tieâu hoaù cho gia

suùc, gia caàm, ñaëc bieät laø vaät nuoâi coøn non giuùp taêng troïng nhanh, sinh saûn toát,

söùc ñeà khaùng cao…

 Trong y hoïc vaø nghieân cöùu khoa hoïc

Amylase cuøng caùc enzym khaùc ñöôïc duøng trong chöõa trò beänh do thieáu

enzym, khaû naêng chuyeån hoaù caùc chaát keùm, caùc beänh veà tieâu hoaù,…

Ngoaøi ra, cheá phaåm amylase coøn ñöôïc duøng ñeå ñieàu cheá moâi tröôøng nuoâi

VSV phuïc vuï cho coâng taùc khoa hoïc. Moät dung dòch beàn vöõng chöùa α-amylase

cho pheùp phaùt hieän caùc oligosaccharide phaân töû löôïng lôùn vôùi ñoä nhaïy raát cao.

Chương II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP

NGHIEÂN CÖÙU

2.1 Vaät lieäu

2.1.1 Ñoái töôïng

Laø caùc chuûng tröïc khuaån ñöôïc phaân laäp töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ.

2.1.2. Duïng cuï

Caùc duïng cuï, thieát bò cuûa phoøng thí nghieäm Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi

hoïc Sö phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Thieát bò goàm coù:

Tuû caáy voâ truøng Beáp oån nhieät

Caân ñieän töû Maùy laéc

Kính hieån vi ñieän töû Maùy ño OD

Tuû aám Tuû laïnh

Tuû saáy Maùy ño pH

Noài haáp thanh truøng Maùy ly taâm

2.1.3. Hoaù chaát

Caùc hoaù chaát cuûa phoøng Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh

phoá Hoà Chí Minh, goàm coù:

NaCl Cao thòt

Pepton MgCl2

CaCl2 Cao naám men

Agar KI

Iot Tinh boät tan

Tím Gentian H2O2

Etanol 96oC Aceton

(NH4) 2SO4 Na2HPO4.12H2O2

Thuoác thöû Folin KH2PO4

HCl ñaäm ñaëc Na2CO3

CaCO3 K2HPO4

2.2. Caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng

2.2.1 Moâi tröôøng phaân laäp vaø nuoâi Bacillus (MPA) [5]

Pepton 10g

5g Cao thòt

5g NaCl

10g Agar

Nöôùc caát 1000ml

2 2.2. Moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp α-amylase cuûa Bacillus [7]

5g Pepton Cao naám men 2g

0,5g NaCl 0,5g MgSO4

1g Tinh boät 10g K2HPO4

1g Nöôùc caát 1000ml KH2PO4

0,15g CaCl2

2.2.3. Moâi tröôøng thöû hoaït tính amylase [17]

Nöôùc 1000ml Pepton 5g

pH 5,5 – 7,8 Cao men 2,5g

Tinh boät tan 1%

Ñeå thöû hoaït tính amylase söû duïng dung dòch lugol, ño voøng thuyû phaân

tinh boät. 2.3. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu

2.3.1 Phöông phaùp phaân laäp caùc chuûng Bacillus töø ñaát vöôøn qua trung gian coû

khoâ [5], [17].

Laáy moät ít ñaát vöôøn (10g) cho vaøo bình tam giaùc vaø theâm 90ml nöôùc caát voâ

truøng laéc ñeàu ñeå taïo huyeàn phuø, gia nhieät tôùi 850C trong 20 – 25 phuùt. Caét nhoû

moät ít coû khoâ, raéc xung quanh coû ít boät CaCO3 roài cho vaøo bình tam giaùc treân sao

cho nöôùc vöøa ngaäp coû, ñeå töø 1 – 2 ngaøy ôû nhieät ñoä phoøng. Ñoå 10ml moâi tröôøng

phaân laäp vaøo ñóa petri voâ truøng, ñeå nguoäi vaø caáy moät laàn que caáy voøng töø maøng

VSV moïc treân maët lôùp coû khoâ leân beà maët moâi tröôøng ñaëc, duøng que gaït gaït ñeàu,

sau ñoù goùi ñóa petri vaø cho vaøo tuû aám 25-35oC. Sau 2-3 ngaøy thaáy xuaát hieän caùc

khuaån laïc rieâng bieät treân maët moâi tröôøng thaïch.

2.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng caáy chuyeàn [11]

Ñoå moâi tröôøng giöõ gioáng vaøo oáng nghieäm, ñeå nghieâng oáng nghieäm. Tieáp

theo, duøng que caáy voâ truøng laáy dòch vi khuaån phaân laäp ñaõ ñöôïc pha loaõng baèng

nöôùc caát voâ truøng, vaø caáy zic zaéc treân beà maët thaïch nghieâng. Nuùt oáng nghieäm laïi

ñaët vaøo tuû aám ôû 34oC, sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì chuyeån oáng nghieäm

vaøo tuû laïnh ôû 4oC ñeå giöõ gioáng.

Gioáng ñöôïc caáy chuyeàn haøng thaùng vaø hoaït hoaù tröôùc khi nhaân gioáng.

2.3.3. Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa Bacillus

 Phöông phaùp nhuoäm Gram [18]

Vôùi muïc ñích choïn caùc chuûng coù khaû naêng nhuoäm maøu Gram (+). Ñaây laø

phöông phaùp laøm tieâu baûn nhuoäm maøu ñöôïc söû duïng phoå bieán ñeå quan saùt ñaëc

ñieåm hình thaùi, ñeám soá löôïng vi khuaån. Nhöõng tieâu baûn naøy coù theå giöõ ñöôïc laâu.

• Nguyeân taéc: Khaû naêng baét maøu cuûa VSV coù lieân quan ñeán muoái Magie cuûa

acid Ribocleic. Khi nhuoäm muoái naøy coù phaûn öùng vôùi thuoác nhuoäm loaïi

tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) vaø khoâng bò maát

maøu döôùi taùc duïng cuûa coàn. Nhöõng vi khuaån nhö theá goïi laø vi khuaån Gram

döông, ngöôïc laïi nhöõng vi khuaån khoâng giöõ ñöôïc maøu khi nhuoäm goïi laø vi khuaån

Gram aâm.

• Caùch tieán haønh: Cho moät gioït nöôùc caát leân phieán kính, duøng que caáy voâ

truøng laáy moät ít teá baøo vi khuaån moïc treân moâi tröôøng ñaëc hoaø vaøo gioït nöôùc. Hô

phieán kính leân ngoïn löûa ñeøn coàn 2-3 laàn, chuù yù khoâng ñeå phieán kính noùng quaù vì

nhö theá teá baøo vi khuaån seõ bò bieán daïng. Khi gioït nöôùc bay hôi daàn vi khuaån seõ

gaén chaët vaøo phieán kính.

Nhuoäm maøu nhôø tím Gentian baèng caùch nhoû thuoác nhuoäm naøy leân veát boâi,

giöõ 1-2 phuùt roài röûa baèng nöôùc caát. Tieáp theo nhoû dung dòch Lugol leân tieâu baûn ñeå

trong 1 phuùt, roài ñoå thuoác ñi vaø traùng baèng nöôùc caát. Sau ñoù röûa baèng coàn 96o trong

thôøi gian khoaûng 30-40 giaây. Röûa laïi tieâu baûn baèng nöôùc caát roài ñeå khoâ veát boâi.

Sau ñoù nhuoäm boå sung baèng Fucshin loaõng khoaûng 1-2 phuùt. Röûa laïi baèng

nöôùc caát cho ñeán khi heát maøu roài ñôïi khoâ.

Quan saùt döôùi kính hieån vi quang hoïc, neáu vi khuaån nhuoäm maøu tím laø vi

khuaån Gram döông, ngöôïc laïi vi khuaån nhuoäm maøu hoàng laø vi khuaån Gram aâm.

 Phöông phaùp nhuoäm baøo töû [11]

Baøo töû vi khuaån khoâng phaûi laø cô quan sinh saûn vaø thöôøng coù 2 daïng: hình

caàu vaø hình baàu duïc. Khi teá baøo soáng trong moâi tröôøng khoâng thích hôïp cho söï

sinh tröôûng vaø phaùt trieån hoaëc khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh

nhaát thì baøo töû ñöôïc hình thaønh.

• Nguyeân taéc: Khi teá baøo ñöôïc xöû lyù baèng nhieät hay/vaø acid thì teá baøo chaát

cuûa baøo töû raát deã baét maøu. Nhuoäm caû teá baøo chaát cuûa baøo töû vaø teá baøo vôùi thuoác

nhuoäm coù hoaït tính nhuoäm maïnh roài taåy maøu cuûa teá baøo chaát cuûa teá baøo vaø

nhuoäm noù vôùi moät thuoác nhuoäm phaân bieät khaùc. Khi ñoù teá baøo chaát mang moät

maøu vaø baøo töû seõ mang maøu khaùc.

• Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng MPA ñaëc trong tuû aám

34oC, sau 5 ngaøy laøm veát boâi treân moät phieán kính saïch vaø ñeå khoâ töï nhieân.

Nhoû vaøi gioït HCl 0,5% leân veát boâi, hô noùng treân ngoïn löûa ñeøn coàn cho

boác hôi trong 2 phuùt roài röûa vôùi nöôùc.

Nhuoäm veát boâi vôùi thuoác nhuoäm Fuchsin, qua mieáng giaáy loïc, hô noùng

cho ñeán boác hôi trong voøng 5 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc. Taåy maøu baèng dung

dòch H2SO4 1% trong 2 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc.

Nhuoäm veát boâi baèng xanh methylene trong 5-15 phuùt. Röûa laïi vôùi nöôùc vaø

ñeå khoâ töï nhieân.

Quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi vaät kính daàu (×100). Baøo töû seõ mang maøu

ñoû, teá baøo sinh döôõng mang maøu xanh.

 Phöông phaùp phaùt hieän hoaït tính catalase [19]

Phöông phaùp naøy duøng ñeå xaùc ñònh vi khuaån hieáu khí. Tröôùc khi thöû hoaït

tính catalase caàn phaûi tieán haønh caáy daøn vi khuaån treân ñóa petri coù moâi tröôøng

MPA ñaëc, nuoâi trong tuû aám 340C. Sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì nhoû moät

gioït dung dòch H2O2 10% leân khuaån laïc. Neáu thaáy coù boït khí xuaát hieän thì chöùng

toû coù catalase trong teá baøo, vaø keát luaän laø chuûng vi khuaån hieáu khí.

 Quan saùt ñaëc ñieåm khuaån laïc [17]

Quan saùt moät soá chæ tieâu cuûa chuûng nghieân cöùu treân moâi tröôøng nuoâi

Bacillus: - Khaû naêng phaùt trieån cuûa khuaån laïc.

- Beà maët khuaån laïc.

- Maøu saéc khuaån laïc.

 Laøm tieâu baûn teá baøo soáng [5]

Loaïi tieâu baûn naøy duøng ñeå xem hình daïng, kích thöôùc vaø söï saép xeáp caùc

teá baøo, khaû naêng hình thaønh baøo töû.

• Caùch tieán haønh: Laáy moät phieán kính khoâ vaø saïch ñaët leân giaù ñôõ, nhoû moät

gioït nöôùc caát leân giöõa phieán kính. Duøng que caáy laáy moät ít VSV moïc treân moâi

tröôøng ñaëc MPA hoaø nheï vaøo gioït nöôùc treân phieán kính ñeå taïo huyeàn phuø. Ñaäy

nheï laù kính ñeå traùnh taïo thaønh boït khí. Duøng giaáy thaám huùt löôïng nöôùc thöøa ôû

quanh laù kính. Moïi thao taùc phaûi ôû caïnh ngoïn löûa ñeøn coàn, vaø moïi duïng cuï phaûi

ñöôïc laøm saïch, voâ truøng. Sau ñoù ñaët tieâu baûn leân baøn kính vaø quan saùt vôùi vaät

kính 40X.

2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån theo maät ñoä quang

[11], [25]

• Nguyeân taéc: Phöông phaùp xaùc ñònh noàng ñoä teá baøo baèng maùy so maøu quang

hoïc ñöôïc söû duïng roäng raõi. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø tính chaát haáp phuï hoaëc

laøm leäch moät phaàn aùnh saùng cuûa caùc dung dòch coù vaät chaát lô löûng. Ñeå ñaùnh giaù

toác ñoä phaùt trieån cuûa vi khuaån ta coù theå ño söï taêng sinh khoái qua giaù trò OD

(Optical Density) ôû böôùc soùng 620nm (OD620).

• Caùch tieán haønh: Sau khi nuoâi caáy vi khuaån trong moâi tröôøng loûng vôùi caùc

ñieàu kieän phuø hôïp vôùi muïc ñích thí nghieäm treân maùy laéc, thì laáy dòch sau nuoâi

caáy ño OD baèng maùy so maøu ôû böôùc soùng 620nm. Taát caû dòch nuoâi caáy ñeàu ñöôïc

pha loaõng 10 laàn tröôùc khi ño OD620.

2.3.5. Phöông phaùp nghieân cöùu khaû naêng phaân huyû tinh boät [17], [20]

Söû duïng phöông phaùp ñuïc loã treân ñóa thaïch.

• Nguyeân taéc: Enzym ngoaïi baøo α-amylase coù khaû naêng phaân huyû tinh boät

taïo ra ñöôøng, maø tinh boät laø moät polysaccharide coù caáu truùc khoâng gian töông

ñoái phöùc taïp. Khi moâi tröôøng chöùa tinh boät ñöôïc nhuoäm baèng iod, iod ñöôïc giöõ

laïi trong caáu truùc maïng khoâng gian cuûa tinh boät vaø laøm cho moâi tröôøng coù maøu

xanh ñaäm. Neáu VSV coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät thì caáu truùc khoâng gian cuûa

tinh boät bò phaù vôõ, neân xuaát hieän voøng phaân giaûi trong suoát.

• Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp

amylase daïng loûng ôû 37oC treân maùy laéc vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau 36-

40h laáy caùc dòch nuoâi ñoù ñem ly taâm vôùi cheá ñoä 5000 voøng/phuùt trong 15 phuùt ñeå

thu dòch enzym.

Tieáp theo, ñoå moâi tröôøng ñaëc thöû hoaït tính amylase coù chöùa 1% tinh boät ñaõ

ñöôïc khöû truøng vaøo ñóa petri, chôø cho moâi tröôøng nguoäi vaø ñoâng laïi. Sau ñoù duøng

khuyeân ñuïc loã (ñöôøng kính khoaûng 1cm) ñaõ ñöôïc khöû truøng ñeå ñuïc loã treân beà

maët moâi tröôøng taïo thaønh caùc gieáng.

Duøng pipet Man huùt dòch enzym nhoû vaøo caùc gieáng trong ñóa petri. Goùi ñóa

laïi vaø ñaët vaøo tuû laïnh 3-4h ñeå dòch trong gieáng khueách taùn ñeàu, sau ñoù ñaët vaøo tuû

aám 34oC.

Sau 24h duøng dung dòch Lugol ñoå leân moâi tröôøng coù chöùa tinh boät. Neáu coù

enzym amylase thì xuaát hieän vuøng chöa bò phaân giaûi coù maøu xanh möïc, vaø vuøng

trong suoát xung quanh gieáng laø do tinh boät bò phaân giaûi bôûi amylase. Tieán haønh

ñaùnh giaù khaû naêng sinh amylase baèng caùch ño ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh

boät cuûa amylase.

2.3.6. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä α- amylase theo Heinkel, 1956 [7]

• Nguyeân taéc

Amylase xuùc taùc phaûn öùng thuyû giaûi tinh boät thaønh ñöôøng (ñöôøng ñôn,

ñöôøng ñoâi, hay dextrin phaân töû lôùn). Löôïng tinh boät coøn laïi phaûn öùng maøu vôùi

iod. Xaùc ñònh löôïng tinh boät bò thuyû giaûi, töø ñoù suy ra hoaït ñoä amylase theo ñònh

nghóa:

Hoaït ñoä amylase ñöôïc bieåu thò laø soá mg tinh boät bò thuyû giaûi bôûi 1ml dòch

enzym (hay 1mg nguyeân lieäu chöùa enzym) trong 1 phuùt ôû ñieàu kieän chuaån laø 500C,

pH=6.

• Hoaù chaát

0,05M Dung dòch NaH2PO4

0,05M Dung dòch Na2HPO4

Dung dòch ñeäm phosphate 0,05M pH 6: troän 87,7ml dung dòch NaH2PO4

0,05M vaø 12,3ml dung dòch Na2HPO4 0,05M theâm 100ml nöôùc caát, ño laïi pH.

Dung dòch tinh boät 1% pha trong pH 6: laáy 50ml dung dòch ñeäm phosphate

0,05M pH 6 ñem ñun soâi. Caân 1g tinh boät tan, hoaø vaøo moät ít ñeäm, khuaáy ñeàu,

ñoå vaøo dung dòch ñeäm ñang soâi, vöøa khuaáy vöøa ñun soâi trong 3 phuùt cho ñeán khi

dung dòch trong suoát. Ñònh möùc tôùi 100ml baèng dung dòch ñeäm.

Dung dòch iod: 1g I2 vaø 2g KI, theâm nöôùc thaønh 100ml, baûo quaûn laïnh. Khi

duøng pha loaõng 500 laàn.

Dung dòch HCl 1N: 8,4ml HCl ñaäm ñaëc pha thaønh 100ml.

Dung dòch HCl 0,1N: pha loaõng töø dung dòch HCl 1N.

• Tieán haønh thí nghieäm

Döïng ñöôøng chuaån tinh boät

OÁng nghieäm 1 2 3 4 5 6

0 1 2 3 4 5 Tinh boät 1% (ml)

10 9 8 7 6 5 Dung dòch ñeäm (ml)

0 1 2 3 4 5 Haøm löôïng tinh boät (mg/ml)

- Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm, theâm vaøo 5ml dung dòch I2KI ñaõ

pha loaõng 500 laàn. Ñem so maøu ôû böôùc soùng 560nm.

-Veõ ñoà thò töông quan giöõa haøm löôïng tinh boät vaø giaù trò ΔOD.

Phaûn öùng enzym

Thöû thaät (3 oáng) Thöû khoâng (3 oáng)

5 5 Tinh boät 1% (ml)

0,5 0 Dung dòch enzym (ml)

Ñeå oån nhieät ôû 500C, 10 phuùt

5 5 Dung dòch HCl 0,1N (ml)

0 0,5 Dung dòch enzym (ml)

- Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm treân, theâm vaøo moãi oáng 5ml dung

dòch I2KI ñaõ pha loaõng.

- Laéc ñeàu, ñem ño OD taïi böôùc soùng 560nm.

=

• Coâng thöùc tính: hoaït ñoä α-amylase trong 1ml dòch enzym

** KVX vt *

HñA

Trong ñoù: X: soá mg tinh boät suy ra töø ñöôøng chuaån.

V: toång theå tích hoãn hôïp phaûn öùng enzym (10,5ml).

t: thôøi gian enzym phaûn öùng (10 phuùt).

v: theå tích enzym cho vaøo hoãn hôïp phaûn öùng enzym (0,5ml).

K: heä soá pha loaõng.

2.3.7. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu [5],

[12], [14], [20], [21], [45].

Khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh amylase khoâng chæ phuï thuoäc vaøo chuûng

gioáng VSV maø ñieàu kieän nuoâi caáy cuõng aûnh höôûng raát nhieàu. Do ñoù chuùng toâi

tieán haønh caùc thí nghieäm sau ñeå xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå chuûng

nghieân cöùu sinh tröôûng vaø sinh amylase toát nhaát.

2.3.7.1. Loaïi cô chaát

Tieán haønh nuoâi caáy chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng sinh toång hôïp

amylase coù chaát caûm öùng khaùc nhau: boät gaïo, boät myø, boät baép, tinh boät tan ôû

nhieät ñoä 37oC vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau moãi moác thôøi gian: 20h, 30h,

40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm

loaïi boû sinh khoái ôû 5000 v/p trong 15 phuùt laáy dòch enzym ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä

amylase theo phöông phaùp Heinkel. Choïn loaïi cô chaát vaø thôøi gian nuoâi caáy

thích hôïp thu amylase coù hoaït ñoä cao nhaát.

2.3.7.2. Noàng ñoä cô chaát

Nuoâi chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chöùa loaïi

cô chaát thích hôïp nhö ñaõ xaùc ñònh ôû thí nghieäm 2.3.7.1 vôùi noàng ñoä khaùc nhau:

0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% treân maùy laéc vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt ôû nhieät ñoä

37oC. Sau thôøi gian toái öu ñöôïc xaùc ñònh ôû muïc 2.3.7.1 ño OD620 xaùc ñònh khaû

naêng sinh tröôûng vaø ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Töø ñoù xaùc

ñònh ñöôïc noàng ñoä cô chaát toái öu cho khaû naêng sinh amylase cuûa chuûng ñang

nghieân cöùu .

2.3.7.3. Nhieät ñoä

Chuûng ñaõ choïn ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chöùa

loaïi cô chaát vôùi noàng ñoä thích hôïp nhö ñaõ xaùc ñònh ôû muïc 2.3.7.1 vaø 2.3.7.2 ôû

nhieät ñoä khaùc nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C treân maùy laéc

200 voøng/phuùt. Sau thôøi gian thích hôïp ño OD620 xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø ño

hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Töø ñoù suy ra nhieät ñoä toái öu cho

chuûng ñang nghieân cöùu sinh amylase.

2.3.7.4. pH ban ñaàu

Nuoâi chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù caùc ñieàu

kieän nuoâi caáy toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân, vôùi pH ban ñaàu khaùc

nhau: töø 5,0 ñeán 8,5 (moãi böôùc nhaûy laø 0,5) treân maùy laéc vôùi cheá ñoä 200

voøng/phuùt vôùi thôøi gian thích hôïp. Tieán haønh xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä

amylase. Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa hoaït ñoä amylase theo pH.

Suy ra pH ban ñaàu toái öu cho chuûng ñaõ choïn sinh amylase.

2.3.7.5. Ñoä hieáu khí

Chuûng vi khuaån ñaõ choïn ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp

amylase vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân

trong caùc bình tam giaùc 500ml vôùi dòch leân men coù theå tích khaùc nhau : 50, 75,

100, 150, 200, 250, 300ml treân cuøng maùy laéc vôùi cheá ñoä 200 voøng/phuùt, cuøng

thôøi gian thích hôïp. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase, keát quaû thí

nghieäm naøy cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc tæ leä theå tích dòch leân men vaø theå tích bình

nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc hoaït ñoä amylase cao nhaát.

2.3.7.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái

• Noàng ñoä NaCl

Nuoâi chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng caûm öùng sinh amylase vôùi caùc ñieàu

kieän toái öu, coù noàng ñoä muoái NaCl thay ñoåi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% treân

cuøng maùy laéc vôùi cheá ñoä 200 voøng/phuùt . Sau thôøi gian thích hôïp xaùc ñònh khaû

naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Suy ra noàng ñoä NaCl toái öu cho khaû naêng

sinh amylase.

• Noàng ñoä CaCl2

Chuûng nghieân cöùu ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng caûm öùng coù noàng ñoä muoái

CaCl2 khaùc nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% treân maùy laéc 200 voøng/phuùt vaø

caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân. Sau thôøi gian

phuø hôïp ño khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Töø ñoù keát luaän ñöôïc noàng

ñoä CaCl2 toái öu ñeå sinh amylase coù hoaït ñoä cao.

2.3.7.7. Noàng ñoä NaCl öùc cheá sinh tröôûng

Nuoâi chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng MPA coù noàng ñoä muoái NaCl khaùc

nhau: töø 1% ñeán 7% (moãi böôùc nhaûy 1%) vôùi ñieàu kieän nhieät ñoä, pH thích hôïp

treân maùy laéc 200 voøng/phuùt. Sau thôøi gian sinh tröôûng toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû

muïc 2.3.7.1 tieán haønh ño pH vaø söï sinh tröôûng OD620, so saùnh vôùi pH vaø OD620

cuûa moâi tröôøng MPA. Töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá söï

sinh tröôûng cuûa chuûng nghieân cöùu.

2.3.8. Phöông phaùp phaân loaïi ñeå xaùc ñònh loaøi cuûa chuûng ñaõ tuyeån choïn [20]:

söû duïng kyõ thuaät PCR

 Nguyeân taéc: Khueách ñaïi moät trình töï leân nhieàu laàn baèng moät caëp moài

chuyeân bieät. Phaûn öùng PCR laø moät chu kyø noái tieáp nhau, moãi chu kyø goàm 3 böôùc:

• Böôùc 1 (bieán tính): trong moät dung dòch ñaày ñuû thaønh phaàn cho söï sao

cheùp, DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao hôn Tmax cuûa phaân töû, thöôøng laø 94-

950C trong voøng 30s-1phuùt.

• Böôùc 2 (lai): nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp ñeå caùc moài baét caëp vôùi khuoân, nhieät

ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40-700C vaø keùo daøi 30s-1phuùt.

• Böôùc 3 (toång hôïp): nhieät ñoä ñöôïc naâng leân ñeán 720C ñeå DNA polymerase

hoaït ñoäng toát nhaát. Thôøi gian cuûa giai ñoaïn naøy phuï thuoäc vaøo ñoä daøi ngaén cuûa

trình töï DNA, thöôøng keùo daøi töø 30s ñeán vaøi phuùt.

 Giaûi trình töï caùc axit nucleic

Caùc phöông phaùp nhaèm xaùc ñònh trình töï axit nucleic ñeàu döïa vaøo 2

nguyeân taéc:

• Nguyeân taéc hoaù hoïc (phöông phaùp Maxam vaø Gilbert): döïa vaøo caùc phaûn

öùng thuyû giaûi hoaù hoïc ñaëc hieäu phaân töû DNA, taïo thaønh moät taäp hôïp nhieàu phaân

ñoaïn coù kích thöôùc cheânh nhau 1 nucleotide.

• Nguyeân taéc enzym hoïc (phöông phaùp Sanger vaø caùc phöông phaùp caûi

bieân): döïa vaøo söï toång hôïp maïch boå sung cho trình töï caàn xaùc ñònh nhôø DNA

polymerase. Vôùi vieäc toång hôïp theâm caùc dideoxynucleotide cuøng vôùi caùc

deoxynucleotide thoâng thöôøng, keát quaû toång hôïp cuõng laø söï hình thaønh moät taäp

hôïp nhieàu ñoaïn DNA coù kích thöôùc cheânh nhau 1 nucleotide.

ÔÛ caû 2 phöông phaùp treân, caùc phaân ñoaïn DNA seõ ñöôïc phaân taùch qua ñieän

di treân gel polyacrylamid. Neáu söû duïng ñaùnh daáu baèng ñoàng vò phoùng xaï thì keát

quaû trình töï caàn xaùc ñònh seõ ñöôïc ñoïc treân baûn phoùng xaï töï ghi töø baûn ñieän di.

2.3.9. Phöông phaùp nghieân cöùu ñoäng hoïc

Vôùi caùc ñieàu kieän toái öu ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ôû muïc 2.3.7 seõ tieán haønh nuoâi

caáy chuûng saûn – chuûng ñaõ tuyeån choïn coù hoaït ñoä enzym α - amylase cao nhaát -

trong bình leân men tam giaùc 1lít. Chuùng toâi seõ nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình

sinh toång hôïp α – amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase.

Qua caùc moác thôøi gian: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70h tieán haønh ño pH, ño

OD620 khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm taùch sinh khoái ñeå ño hoaït ñoä amylase theo

phöông phaùp Heinkel.

2.3.10. Phöông phaùp thu dòch chieát α – amylase thoâ töø moâi tröôøng nuoâi caáy

[7], [11].

Sau khi thu nhaän ñöôïc dòch nuoâi caáy vi khuaån, ñem ly taâm 5000 voøng/

phuùt trong 15 phuùt ñeå loaïi boû sinh khoái, thu nhaän phaàn dòch beân treân, dung dòch

naøy ñöôïc söû duïng nhö dòch enzym α – amylase thoâ vaø ñöôïc baûo quaûn ôû 40C.

2.3.11. Phöông phaùp thu nhaän cheá phaåm enzym (CPE) α - amylase töø dòch

chieát enzym thoâ baèng caùc taùc nhaân tuûa [4], [11]

Caùc taùc nhaân taïo tuûa enzym thöôøng ñöôïc söû duïng laø caùc dung moâi höõu cô:

etanol, aceton; muoái trung tính (NH4)2SO4 ñeå thu nhaän cheá phaåm enzym töø dòch

chieát enzym thoâ. Töø ñoù so saùnh vaø choïn taùc nhaân gaây tuûa thích hôïp.

 Nguyeân taéc: döïa vaøo tính hoaø tan cuûa protein. Trong phaân töû protein coù

ñoàng thôøi caùc nhoùm kî nöôùc (goác alkyl) laøm cho protein khoâng tan trong nöôùc,

vaø nhoùm öa nöôùc (-COOH, -OH,…) laøm cho protein tan trong nöôùc. Caùc taùc nhaân

tuûa enzym coù theå aûnh höôûng ñeán tính hoaø tan cuûa protein nhö sau:

• Dung moâi höõu cô: chuùng coù theå hoaø tan hoaëc gaây tuûa protein. Ví duï khi

theâm nhöõng chaát laøm taêng haèng soá ñieän moâi cuûa nöôùc nhö glycin, laøm taêng khaû

naêng ion hoaù töø ñoù taêng ñoä hoaø tan cuûa protein. Ngöôïc laïi, neáu theâm chaát laøm

giaûm haèng soá ñieän moâi cuûa nöôùc nhö etanol, aceton,…seõ laøm giaûm tính hoaø tan

cuûa protein.

• Muoái trung tính: noàng ñoä muoái quaù cao seõ laøm giaûm ñoä hoaø tan cuûa protein.

Toùm laïi, nguyeân nhaân gaây tuûa protein laø do lôùp hydrate bao phuû protein bò

taùc nhaân gaây tuûa giaønh laáy. Caùc protein bò maát voû hydrate seõ keát hôïp vôùi nhau

vaø keát tuûa xuoáng. Do ñoù, ñöa taùc nhaân tuûa daàn daàn vaøo dung dòch enzym thoâ

theo töøng noàng ñoä khaùc nhau ñeå thu nhaän töøng loaïi protein.

 Caùch tieán haønh

• Ñoái vôùi caùc taùc nhaân tuûa laø etanol 96o, aceton

Duøng 600 ml dòch enzym thoâ, chia laøm hai phaàn baèng nhau, moät phaàn tuûa

vôùi etanol, phaàn coøn laïi tuûa vôùi aceton. Dòch chieát enzym vaø caùc dung moâi höõu

cô ñeàu ñöôïc giöõ laïnh khoaûng 4oC. Cho töø töø etanol 96o hoaëc aceton vaøo dòch

chieát enzym vôùi tæ leä theå tích dung moâi vaø dòch chieát enzym laø 3:1. Khuaáy ñeàu

hoãn hôïp vaø ñeå yeân trong ñieàu kieän laïnh khoaûng 1h, sau ñoù ñem ly taâm vôùi 5000

voøng/phuùt trong 15 phuùt. Thu laáy phaàn caën tuûa, saáy khoâ baèng caùch thoåi quaït gioù

ôû < 40oC (vì nöôùc toàn taïi trong ñoù seõ laøm giaûm hoaït ñoä enzym), caân troïng löôïng

cheá phaåm enzym, vaø baûo quaûn trong ñieàu kieän laïnh.

• Ñoái vôùi taùc nhaân tuûa laø muoái sunphat amon

Laáy 300 ml dòch enzym thoâ ñem tuûa vôùi muoái sunphat amon (47,2g/100ml

dòch enzym). Muoái sunphat amon ñöôïc cho töø töø löôïng nhoû vaøo dòch chieát enzym

vaø khuaáy ñeàu ôû nhieät ñoä phoøng. Thôøi gian tuûa laø 2 giôø, sau ñoù ñem ly taâm 5000

voøng/phuùt trong 15 phuùt ñeå laáy tuûa. Tuûa ñöôïc saáy khoâ ôû < 400C, caân troïng löôïng

roài cho vaøo tuùi dialise thaåm tích ñeå loaïi muoái trong nöôùc caát ôû ñieàu kieän laïnh.

Thu laáy phaàn coøn laïi trong tuùi ñem saáy khoâ, thoåi gioù < 400C, caân cheá phaåm

enzym vaø baûo quaûn laïnh.

- Caùch tieán haønh thaåm tích baèng tuùi dialise: caân troïng löôïng tuùi baùn thaám

dialise, vaø caân löôïng CPE ñöôïc tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 cho CPE vaøo tuùi baùn

thaám. Tieáp tuïc cho tuùi naøy vaøo moät coác thuyû tinh coù ñöïng nöôùc caát ñeå laïnh.

Khuaáy vaø thay nöôùc laïnh thöôøng xuyeân (5-6 laàn trong moät ngaøy ñeâm, tuùi naøy chæ

cho chaát coù phaân töû löôïng nhoû thaåm tích qua tuùi maø giöõ laïi nhöõng chaát coù phaân

töû löôïng lôùn nhö protein, enzym). Saáy quaït gioù laøm khoâ tuùi ôû < 400C, caân laïi

troïng löôïng tuùi.

Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi tuûa enzym

- Chuùng ta phaûi cho töø töø taùc nhaân tuûa vaøo dung dòch enzym thoâ baèng caùch söû

duïng pipet nhoû töøng gioït, muïc ñích laø traùnh hieän töôïng tuûa cuïc boä. Vì neáu theâm

vaøo moät löôïng lôùn taùc nhaân tuûa seõ taïo ra noàng ñoä quaù cao ngay taïi vuøng tieáp xuùc

trong dung dòch enzym, ñieàu ñoù seõ daãn ñeán tuûa cuïc boä taïi moät vò trí ñoù, vaø coù theå

laøm bieán tính baát thuaän nghòch.

- Khi theâm taùc nhaân tuûa vaøo caàn phaûi laéc ñeàu ñeå taêng ñoä khueách taùn vaøo

dung dòch enzym thoâ.

2.3.12. Xaùc ñònh hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase thu ñöôïc töø caùc taùc

nhaân tuûa [4]

Caân 0,1g CPE amylase töø moãi taùc nhaân tuûa pha vôùi 50ml nöôùc caát, roài tieáp

tuïc pha loaõng tôùi noàng ñoä thích hôïp. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông

phaùp Heinkel.

2.3.13. Xaùc ñònh ñoä beàn cuûa CPE amylase [12], [20], [33]

2.3.13.1. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase

Amylase ñöôïc giöõ trong dung dòch ñeäm coù pH 6, ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau

töø 30-1000C (moãi böôùc nhaûy 100C) trong 1 giôø. Sau ñoù xaùc ñònh hoaït ñoä amylase

theo phöông phaùp Heinkel. Ñoä beàn cuûa dòch enzym ñöôïc ñaùnh giaù baèng soá phaàn

traêm hoaït ñoä coøn laïi trong caùc dòch ñaõ xöû lyù nhieät ñoä, maãu ñoái chöùng laø hoaït ñoä

amylase cuûa dòch enzym khoâng xöû lyù nhieät ñoä vaø giöõ ôû 40C.

2.3.13.2. Ñoä beàn pH cuûa amylase

Dòch amylase ñöôïc giöõ trong dung dòch ñeäm coù pH khaùc nhau töø 4,0-8,0

(moãi böôùc nhaûy laø 0,5) trong 1 giôø ôû 300C theo tæ leä 1:1. Xaùc ñònh hoaït ñoä

amylase theo phöông phaùp Heinkel. Ñoä beàn cuûa dòch enzym ñöôïc ñaùnh giaù baèng

soá phaàn traêm hoaït ñoä coøn laïi trong caùc dòch ñaõ xöû lyù pH, maãu ñoái chöùng laø hoaït

ñoä amylase cuûa dòch enzym khoâng xöû lyù pH vaø giöõ ôû pH 6.

2.3.14. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu thöïc nghieäm [4].

Söû duïng caùch tính toaùn thoáng keâ ñeå xöû lyù caùc soá lieäu thöïc nghieäm thu ñöôïc.

• Xaùc ñònh giaù trò trung bình

n

i x

=

x

Giaù trò trung bình cuûa caùc soá lieäu laø toång giaù trò thöïc cuûa moãi laàn ño chia

n

cho soá laàn ño:

ix : giaù trò cuûa moät laàn ño

Trong ñoù: x : giaù trò trung bình

n : soá laàn ño

Neáu thöïc hieän söï ño ñaïc laëp laïi nhieàu laàn treân moät maãu thí nghieäm thì

chuùng ta coù theå tieäm caän ñeán moät giaù trò trung bình thaät. Ñeå giaù trò trung bình cuûa

caùc laàn ño nhö laø moät giaù trò gaàn ñuùng vôùi giaù trò trung bình thaät, ta phaûi duøng

phöông phaùp thoáng keâ ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä chính xaùc cuûa caùc laàn ño.

• Tính toaùn ñoä leäch maãu vaø ñoä leäch chuaån

o Ñoä leäch maãu (Sample deviation): Laø söï khaùc bieät giöõa giaù trò cuûa moät laàn

ño vôùi giaù trò trung bình.

Ñoä leäch maãu = xi - x

Trong ñoù: xi : giaù trò cuûa moät laàn ño.

x : giaù trò trung bình.

o Ñoä leäch chuaån (Standard deviation): söï sai soá coù theå coù trong moät laàn ño

)2

−

x

= 

S

( x i − 1n

ix : giaù trò cuûa moät laàn ño

x : giaù trò trung bình

Vôùi S : ñoä leäch chuaån

n : soá laàn ño

Sx ±

Vaäy giaù trò trung bình coù theå dieãn ñaït nhö sau:

Ñoä leäch chuaån coù theå chuyeån ñoåi thaønh ñoä leäch chuaån cuûa giaù trò trung

bình hay coøn goïi laø sai soá chuaån ñöôïc kyù hieäu laø Sm.

S: ñoä leäch chuaån; n: soá laàn ño.

S= n

Sm

Coâng thöùc treân cho thaáy, soá laàn ño caøng lôùn (n caøng lôùn) thì ñoä leäch

chuaån cuûa giaù trò trung bình (Sm) caøng nhoû, hay möùc ñoä chính xaùc cuûa laàn ño

ñaïc caøng cao.

Chương III: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN

3.1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng tröïc khuaån coù hoaït tính amylase cao

Töø maãu coû khoâ vaø ñaát vöôøn chuùng toâi tieán haønh phaân laäp theo phöông

phaùp ôû muïc 2.3.1, thu ñöôïc 17 chuûng thuaàn. Tieáp tuïc xaùc ñònh hoaït tính amylase

theo phöông phaùp ñuïc loã treân ñóa thaïch nhö ôû muïc 2.3.5. Töø keát quaû ño ñöôøng

kính voøng phaân giaûi tinh boät chuùng toâi choïn 3 chuûng coù hoaït tính amylase cao,

kyù hieäu: CK1, CK2, CK3. Keát quaû trình baøy ôû baûng 3.1 vaø hình 3.1

Baûng 3.1. Ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK

Chuûng D-d (mm)

20 CK1

22 CK2

25 CK3

Hình 3.1. Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK

CK1

CK2

CK3

3.2. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK ñaõ choïn

3.2.1. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK

Chuùng toâi tieán haønh nuoâi moãi chuûng trong moâi tröôøng MPA loûng treân maùy

laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C. Tieán haønh ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng

cuûa moãi chuûng theo moãi moác thôøi gian: 20,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giôø. Keát

quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.2 vaø ñoà thò 3.1.

Baûng 3.2. Söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK

Thôøi gian (h)

20 CK 1 0,575 OD620 CK 2 0,711 CK 3 0,637

30 0,868 0,855 0,679

35 1,242 1,128 0,808

40 0,955 1,483 1,320

45 1,468 1,284 1,126

50 1,436 1,217 1,104

CK1

CK2

CK3

55 60 70 1,051 0,985 0,847 1,355 1,224 1,113 1,149 0,986 0,829

1.6

1.4

0 2 6 D O

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

20

30

35

40

45

50

55

60

70

Thôøi gian (h)

Ñoà thò 3.1. So saùnh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK

Töø keát quaû treân cho thaáy caû 3 chuûng CK ñeàu sinh tröôûng toát, tuy nhieân

chuûng CK2 coù khaû naêng sinh tröôûng cao hôn, vaø thôøi gian sinh tröôûng cao nhaát

cuûa CK2 vaøo luùc 40h.

3.2.2. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK

Chuùng toâi tieán haønh nuoâi moãi chuûng trong moâi tröôøng caûm öùng sinh

amylase daïng loûng treân maùy laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C. Sau thôøi gian khoaûng 45-

50 giôø chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp

Heinkel. Keát quaû nhö sau:

Baûng 3.3. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK

Chuûng Hoaït ñoä amylase (UI/ml)

10,398 ± 0,239 CK1

CK2 16,168 ± 0,147

9,119 ± 0,089 CK3

) l

18

m

/ I U

16

(

14

12

e s a l y m a

ä

10

ï

8

o ñ t a o H

6

4

2

0

CK1

CK2

CK3 Chuûng

Bieåu ñoà 3.1. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK

Qua keát quaû treân thì chuûng CK2 cho hoaït ñoä amylase cao nhaát. Vaäy töø 3

chuûng treân chuùng toâi choïn chuûng CK2 coù khaû naêng sinh tröôûng vaø taïo amylase

coù hoaït ñoä cao ñeå tieáp tuïc nghieân cöùu.

3.3. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2

3.3.1. Ñaëc ñieåm hình thaùi khuaån laïc

Chuùng toâi tieán haønh caáy daøn chuûng CK2 leân beà maët thaïch moâi tröôøng

MPA cuûa ñóa petri. Sau ñoù ñeå vaøo tuû aám 340C trong 24 giôø ñeå thu caùc khuaån laïc

rieâng bieät. Keát quaû ñöôïc neâu trong hình 3.2

Hình 3.2. Hình thaùi khuaån laïc chuûng CK2

Qua quan saùt chuùng toâi nhaän thaáy khuaån laïc chuûng CK2 coù ñaëc ñieåm laø:

khuaån laïc khoâ, maøu traéng ñuïc, maët khuaån laïc mòn, meùp nhaên, baùm vaøo moâi tröôøng thaïch.

3.3.2. Ñaëc ñieåm hình thaùi teá baøo chuûng CK2

Sau 24 giôø nuoâi caáy chuùng toâi tieán haønh laøm tieâu baûn soáng chuûng CK2 vaø

quan saùt döôùi kính hieån vi ôû vaät kính 40X, nhaän thaáy chuûng CK2 coù teá baøo hình

que, ngaén, nhoû, ñöùng rieâng reõ. Nhuoäm Gram vaø quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi ñoä

phoùng ñaïi 100X, chuùng toâi nhaän thaáy chuûng CK2 baét maøu tím. Ñieàu ñoù chöùng toû

chuûng naøy laø vi khuaån Gram döông. Keát quaû thu ñöôïc ôû hình 3.3

Hình 3.3. Hình thaùi teá baøo chuûng CK2

3.3.3. Khaû naêng hình thaønh baøo töû cuûa chuûng CK2

Nuoâi chuûng CK2 treân moâi tröôøng MPA ôû tuû aám 340C, sau 5 ngaøy nhuoäm

baøo töû theo phöông phaùp nhö ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.3. Keát quûa quan saùt döôùi

kính hieån vi chuùng toâi nhaän ñöôïc hình 3.4

Hình 3.4. Baøo töû cuûa chuûng CK2

Vaäy chuûng CK2 coù khaû naêng hình thaønh noäi baøo töû (baøo töû baét maøu ñoû).

3.3.4. Nghieân cöùu khaû naêng sinh enzym catalase

Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 treân beà maët thaïch moâi tröôøng MPA,

trong tuû aám ôû 340C. Sau 24 giôø khi thaáy xuaát hieän khuaån laïc nhoû leân khuaån laïc 1

gioït H2O2 10% thì thaáy xuaát hieän boït khí, chöùng toû chuûng CK2 coù khaû naêng sinh

catalase enzym catalase: H2O2 H2O + O2↑. Phaân töû oxy sinh ra laøm

phaûn öùng taïo ra boït khí, vaäy chuûng CK2 laø vi khuaån hieáu khí.

 Toùm taét moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2

Baûng 3.4. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2

Ñaëc ñieåm Chuûng CK2

Khoâ, maøu traéng ñuïc, maët khuaån laïc mòn, Hình thaùi khuaån laïc meùp hôi nhaên, baùm vaøo moâi tröôøng thaïch.

Hình que, ngaén, nhoû, ñöùng rieâng reõ Hình thaùi teá baøo

+ Phaân giaûi tinh boät

+ Gram

+ Hình thaønh noäi baøo töû

+ Khaû naêng phaân giaûi H2O2

+ Nhu caàu veà oxy

3.4. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh toång hôïp α –

amylase cuûa chuûng CK2.

3.4.1. Loaïi cô chaát

Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 trong moâi tröôøng loûng sinh toång

hôïp enzym α – amylase coù chaát caûm öùng khaùc nhau: boät gaïo, boät myø, boät baép,

tinh boät tan ôû nhieät ñoä 37oC vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau moãi moác thôøi

gian: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giôø ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng,

vaø ly taâm loaïi boû sinh khoái ôû 5000 v/p trong 15 phuùt ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä amylase

theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.5 vaø ñoà thò 3.2.

Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Cô chaát OD620 Thôøi gian (h)

0,672 2,221 ± 0,05 Boät gaïo

0,655 3,819 ± 0,045 Boät myø 20 0,798 3,920 ± 0,034 Boät baép

0,841 4,913 ± 0,034 Tinh boät tan

0,734 4,172 ± 0,017 Boät gaïo

0,711 5,131 ± 0,073 Boät myø 30 0,943 6,326 ± 0,089 Boät baép

1,055 7,403 ± 0,067 Tinh boät tan

1,203 6,477 ± 0,045 Boät gaïo

1,121 6,545 ± 0,034 Boät myø 40 1,286 8,059 ± 0,061 Boät baép

10,263 ± 0,045 Tinh boät tan 1,502

1,155 8,311± 0,045 Boät gaïo

1,100 7,672 ± 0,077 Boät myø 45 1,206 10,212 ± 0,073 Boät baép

1,488 Tinh boät tan 14,890 ± 0,058

1,045 8,227 ± 0,077 Boät gaïo

0,962 7,537 ± 0,034 Boät myø 50 1,131 10,128 ± 0,061 Boät baép

1,374 14,654 ± 0,073 Tinh boät tan

0,964 8,008 ± 0,034 Boät gaïo

0,902 7,453 ± 0,017 Boät myø 55 1,067 9,960 ± 0,045 Boät baép

1,228 14,419 ± 0,034 Tinh boät tan

0,876 7,722 ± 0,077 Boät gaïo

0,844 7,319 ± 0,058 Boät myø 60 0,981 9,186 ± 0,058 Boät baép

1,163 13,796 ± 0,089 Tinh boät tan

0,711 7,134 ± 0,089 Boät gaïo

0,689 6,578 ± 0,045 Boät myø

70 0,843 8,446 ± 0,017 Boät baép

0,936 12,517 ± 0,050 Tinh boät tan

Bột gạo

Bột mỳ

Bột bắp

Tinh bột tan

Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase (tieáp theo)

16

14

) l

12

m

/ I

U

10

8

( e s a l y m a

6

ộ đ

4

t ạ o H

2

0

20

30

40

45

50

55

60

70

Thời gian (h)

Ñoà thò 3.2. AÛnh höôûng caùc loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase

Chuûng CK2 ñaõ choïn khi nuoâi caáy vôùi caùc loaïi cô chaát khaùc nhau ñeàu sinh

tröôûng toát nhaát vaøo thôøi gian laø 40h. Tuy nhieân vôùi cô chaát laø tinh boät tan thì

chuûng CK2 sinh tröôûng cao hôn haún laø 1,502, vaø cuõng loaïi cô chaát naøy thì hoaït

ñoä amylase cuõng cao nhaát khi thôøi gian nuoâi caáy ñöôïc 45 - 50h. Töø keát quaû treân

coù theå thaáy nguoàn cô chaát thích hôïp cho chuûng CK2 sinh tröôûng vaø sinh enzym

amylase ñöôïc saép xeáp theo thöù töï nhö sau: Tinh boät tan > boät baép > boät gaïo >

boät myø. Vaäy chuûng CK2 coù thôøi gian sinh tröôûng cao nhaát luùc nuoâi caáy ñöôïc 40h

vaø hoaït ñoä amylase cao nhaát luùc 45-50h.

3.4.2. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan

Töø keát quaû treân cho thaáy tinh boät tan laø nguoàn cô chaát thích hôïp nhaát ñeå

chuûng CK2 sinh amylase coù hoaït ñoä cao. Tuy nhieân noàng ñoä khaùc nhau cuûa cô

chaát cuõng aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán hoaït ñoä amylase. Vì theá chuùng toâi tieán haønh

nuoâi chuûng CK2 trong moâi tröôøng caûm öùng coù chaát caûm öùng laø tinh boät tan vôùi

noàng ñoä khaùc nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% treân maùy laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C.

Sau 40h tieán haønh ño söï sinh tröôûng OD620 vaø sau 45-50h ño hoaït ñoä amylase

theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.6 vaø bieåu ñoà 3.2

Baûng 3.6. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase

OD620 Noàng ñoä tinh boät (%) Hoaït ñoä amylase (UI/ml)

1,185 9,354 ± 0,034 0,5

1,584 13,359 ± 0,094 1,0

1,5 1,612 16,370 ± 0,061

1,622 14,200 ± 0,045 2,0

1,228 9,439 ± 0,050 2,5

20

) l

m

/ I U

15

( e s a l y m a

ä

10

ï

o ñ t a o H

5

0

0,5%

1%

1,5%

2%

2,5%

% Tinh boät tan

Bieåu ñoà 3.2. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase

Töø keát quaû treân coù theå thaáy noàng ñoä tinh boät tan trong moâi tröôøng thích

hôïp cho khaû naêng sinh enzym amylase cuûa chuûng CK2 töø 1% - 2%. Ñaëc bieät vôùi

noàng ñoä tinh boät tan laø 1,5% cho hoaït ñoä amylase cao nhaát (16,37 UI/ml).

3.4.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä

Vi khuaån Bacillus haàu heát laø loaøi öu nhieät trung bình vôùi nhieät ñoä dao

ñoäng töø 25 – 45oC. Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán

khaû naêng sinh amylase chuûng CK2 theo phöông phaùp nhö ñaõ trình baøy ôû muïc

2.3.7.3. Keát quaû ôû baûng 3.7 vaø bieåu ñoà 3.3.

Baûng 3.7. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase

Nhieät ñoä (0C) Hoaït ñoä amylase(UI/ml) OD620

1,248 13,981 ± 0,058 25-28

20,829 ± 0,061 1,395 30-33

31,983 ± 0,045 35-37 1,653

28,383 ± 0,073 1,505 38-40

24,025 ± 0,058 1,342 40-42

18,827 ± 0,101 1,143 42-45

35

30

) l

m

/ I

U

25

20

15

( e s a l y m a ộ đ t ạ o H

10

5

0

25-28

30-33

38-40

40-42

42-45

35-37

Nhiệt độ (oC)

Bieåu ñoà 3.3. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase

Nhieät ñoä thích hôïp cho chuûng CK2 sinh tröôûng vaø sinh enzym amylase töø

30-420C; toát nhaát ôû 35-370C. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vì caùc chuûng Bacillus laø

caùc chuûng VSV öa aám.

3.4.4. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu

pH cuõng laø moät trong nhöõng taùc nhaân quan troïng aûnh höôûng ñeán khaû naêng

sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase ñöôïc toång hôïp. Thí nghieäm nhaèm xaùc ñònh pH

toái öu giuùp VSV sinh enzym amylase coù hoaït ñoä cao nhaát. Thí nghieäm ñöôïc tieán

haønh theo muïc 2.3.7.4 chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû ôû baûng 3.8 vaø bieåu ñoà 3.4.

Baûng 3.8. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase

OD620 1,021 1,148 1,202 1,437 1,588 1,602 1,531 1,350 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 1,144 ± 0,045 1,615 ± 0,058 8,900 ± 0,017 14,907 ± 0,135 24,009 ± 0,094 27,609 ± 0,077 15,63 ± 0,045 4,963 ± 0,073 pH 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5

30

) l

m

/ I

U

25

20

15

( e s a l y m a ộ đ t ạ o H

10

5

0

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5 pH

Bieåu ñoà 3.4. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase

pH ban ñaàu thích hôïp cho söï sinh tröôûng cuõng nhö sinh amylase cuûa chuûng

CK2 töø 7,0-7,5; maïnh nhaát ôû pH = 7,5. pH ngaõ veà axit hoaëc kieàm ñeàu khoâng toát

cho hoaït ñoäng cuûa chuûng CK2. Vaäy moâi tröôøng trung tính thuaän lôïi hôn cho

chuûng naøy sinh tröôûng vaø sinh enzym amylase.

3.4.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí

Caùc chuûng Bacillus ñeàu laø VSV hieáu khí, tuy nhieân vôùi möùc ñoä hieáu khí

thích hôïp thì chuùng môùi hoaït ñoäng toát nhaát.. Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng

CK2 theo phöông phaùp nhö ôû muïc 2.3.7.5. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.9 vaø

bieåu ñoà 3.5.

Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase

Hoạt độ amylase (UI/ml) OD620 Theå tích dòch nuoâi caáy (ml)

1,518 1,664 1,658 1,532 1,480 1,455 1,406 16,404 ± 0,050 22,326 ± 0,061 28,198 ± 0,034 16,538 ± 0,045 13,359 ± 0,034 10,734 ± 0,073 9,253 ± 0,034 50 75 100 150 200 250 300

30

) l

m

25

/ I U

20

15

10

( e s a l y m a oä ñ t aï o H

5

0

50

75

100

150

200

250

300

Theå tích dòch nuoâi caáy (ml)

Bieåu ñoà 3.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase

Qua thí nghieäm treân khi nuoâi chuûng CK2 trong bình tam giaùc 500ml thì theå

tích dòch nuoâi caáy 75ml cho söï sinh tröôûng cao nhaát. Nhöng enzym amylase laïi

coù hoaït ñoä cao khi theå tích dòch nuoâi caáy laø 100ml. Vì vaäy, chuùng toâi choïn tæ leä

theå tích dòch nuoâi caáy so vôùi theå tích bình nuoâi laø 100ml/500ml ñeå laøm caùc thí

nghieäm tieáp theo.

3.4.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái

Haàu heát caùc chuûng Bacillus ñeàu öu maën, neân muïc ñích cuûa thí nghieäm

nhaèm xaùc ñònh ñoä maën thích hôïp cuûa moâi tröôøng giuùp chuûng CK2 sinh tröôûng vaø

sinh enzym coù hoaït ñoä cao.

3.4.6.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl

Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh theo muïc 2.3.7.6. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû

baûng 3.10 vaø bieåu ñoà 3.6.

Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái NaCl ñeán hoaït ñoä amylase

Hoaït ñoä amylase(UI/ml) OD620 Nồng ñoä NaCl (%)

0,955 4,206 ± 0,061 0

1,268 11,760 ± 0,050 0,03

1,382 19,533 ± 0,050 0,05

40,665 ± 0,017 0,08 1,624

1,506 33,498 ± 0,061 0,1

40

0,12 1,470 26,532 ± 0,034

) l

m

35

/ I U

30

25

( e s a l y m a

ä

20

o ñ t aï o H

15

10

5

0

0

0.03

0.05

0.08

0.1

0.12 %NaCl

Bieåu ñoà 3.6. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl ñeán hoaït ñoä amylase

Do caùc chuûng Bacillus ñeàu thuoäc nhoùm chòu maën neân khi moâi tröôøng nuoâi

caáy khoâng coù NaCl thì hoaït ñoä amylase raát thaáp (4,206 UI/ml). Caøng taêng noàng

ñoä muoái NaCl thì khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase caøng taêng, noàng ñoä

thích hôïp laø 0,08-0,1% NaCl, toát nhaát laø 0,08% vaø vöôït quaù möùc naøy thì hoaït ñoä

amylase caøng giaûm.

3.4.6.2. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái CaCl2

Vai troø cuûa ion canxi ñoái vôùi enzym amylase laø voâ cuøng quan troïng, ñaëc

bieät laø ñoái vôùi α-amylase. Vì söï coù maët ion naøy trong caáu truùc ñaëc hieäu baäc 3,

baäc 4 cuûa α-amylase giuùp cho caáu truùc cuûa enzym naøy ñöôïc oån ñònh, beàn vöõng

ñaëc bieät laø döôùi taùc duïng cuûa trypsin vaø nhöõng protease khaùc cuûa oáng tieâu hoaù.

Ñieàu naøy khoâng nhöõng coù yù nghóa veà maët sinh hoïc maø coøn coù yù nghóa veà maët

thöïc tieãn, giuùp cho amylase hoaït ñoäng toát trong moâi tröôøng cuûa dòch tieâu hoaù.

Vaäy söï coù maët cuûa ion canxi trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñaõ goùp phaàn laøm taêng

hoaït ñoä cuûa amylase.

Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 theo muïc 2.3.7.6. Keát quaû theå

hieän ôû baûng 3.11 vaø bieåu ñoà 3.7.

Baûng 3.11. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït ñoä amylase

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) OD620 Nồng ñộ CaCl2 (%)

1,428 24,379 ± 0,058 0

28,568 ± 0,050 1,624 0,01

23,033 ± 0,045 1,496 0,015

20,475 ± 0,061 1,370 0,02

30

18,944 ± 0,073 1,314 0,025

) l

m

25

/ I U

20

( e s a l y m a

ä

15

ï

10

o ñ t a o H

5

0

0

0.01

0.02

0.025 % CaCl2

0.015

Bieåu ñoà 3.7. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït ñoä amylase

Töø keát quaû treân cho thaáy noàng ñoä CaCl2 toái öu laø 0,01%. Vaäy khi coù maët

ion Ca vôùi noàng ñoä toái öu ñaõ laøm taêng hoaït ñoä amylase.

3.4.7. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng

Ña soá Bacillus ñeàu thuoäc nhoùm öu maën trung bình, do ñoù noàng ñoä muoái

NaCl quaù cao seõ laøm cheát teá baøo. Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 theo

phöông phaùp ôû muïc 2.3.7.7 . Moâi tröôøng MPA coù pH = 6,0; OD620nm = 0,037. Sau

40-45h nuoâi caáy chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû ôû baûng 3.12 vaø bieåu ñoà 3.8.

Baûng 3.12. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng

pH OD620 Nồng ñộ NaCl (%)

0,886 7,77 1

0,625 7,45 2

0,413 7,03 3

0,261 6,84 4

0,108 6,65 5

0,052 5,55 6

1

0,035 5,38 7

)

0.8

m n 0 2 6 (

D O

0.6

0.4

0.2

0

1

2

3

4

5

6

7

% NaCl

Bieåu ñoà 3.8. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng

Theo keát quaû thu ñöôïc vôùi noàng ñoä NaCl laø 7% coù OD620 = 0,035 maø

OD620 cuûa moâi tröôøng = 0,037. Ñieàu ñoù coù nghóa noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá

sinh tröôûng laø 7%. Vaäy khaû naêng chòu maën cuûa chuûng CK2 naøy töông ñoái cao.

3.5. Xaùc ñònh teân cuûa chuûng CK2 ñaõ tuyeån choïn

Töø nhöõng ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 nhö ñaõ trình baøy ôû baûng 3.4,

chuùng toâi ñi ñeán keát luaän: chuûng CK2 laø moät loaøi thuoäc chi Bacillus. Vaø ñeå xaùc

ñònh chính xaùc laø loaøi naøo chuùng toâi döïa vaøo keát quaû phaân tích trình töï 16S-

rARN, vaø trình töï naøy do phoøng xeùt nghieäm NK-BIOTEK cuûa Coâng ty Nam

Khoa xaùc ñònh. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû hình 3.5

Hình 3.5. Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2

CATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAAC TCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCG CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTG ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2 ñöôïc so saùnh vôùi trình töï 16S-rARN

cuûa loaøi chuaån ñaõ ñöôïc ñònh loaïi trong ngaân haøng gen BLAST. Keát quaû cho thaáy

möùc ñoä gioáng nhau cuûa chuûng CK2 vôùi loaøi Bacillus subtilis laø 100%. Keát quaû

naøy cho pheùp keát luaän chuûng CK2 ñaõ phaân laäp ñöôïc laø Bacillus subtilis vaø chuùng

toâi goïi chuûng naøy laø Bacillus subtilis CK2.

3.6. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men trong bình tam giaùc 1 lít.

Qua caùc keát quaû nghieân cöùu ôû muïc 3.4, chuùng toâi ñaõ coù keát luaän veà caùc

ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå chuûng Bacillus subtilis CK2 ñaõ phaân laäp ñöôïc sinh

amylase coù hoaït ñoä cao nhaát nhö sau: moâi tröôøng söû duïng chaát caûm öùng laø tinh

boät tan vôùi noàng ñoä 1,5%; pH ban ñaàu = 7,5; nhieät ñoä nuoâi caáy töø 35-370C; ñoä

hieáu khí vôùi tæ leä 100ml dòch nuoâi caáy/500ml theå tích bình; noàng ñoä toái öu cuûa

caùc loaïi muoái: NaCl 0,08%; CaCl2 0,01%.

Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men chuûng

Bacillus subtilis CK2 theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.9. Keát quaû ñöôïc

trình baøy ôû baûng 3.13 vaø ñoà thò 3.3.

Baûng 3.13. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men Bacillus subtilis CK2

Thôøi gian (h) pH Hoạt ñộ amylase (UI/ml) OD620

6,86 0,943 19,516 ± 0,045 20

1,176 21,367 ± 0,061 7,21 30

25,523 ± 0,061 7,27 1,353 35

32,354 ± 0,077 7,32 40 1,688

44,585 ± 0,084

7,58 7,55 1,676 1,630 44,147 ± 0,102 45 50

7,54 1,597 43,020 ± 0,089 55

7,48 1,524 40,513 ± 0,160 60

Sinh trưởng

Hoạt độ

7,40 1,458 38,091 ± 0,094 70

2.0

50

45

) l

0 2 6 D O

m

40

/ I

1.5

U

35

30

1.0

25

( e s a l y m a

20

15

0.5

10

ộ đ t ạ o H

5

0.0

0

20

30

35

40

45

50

55

60

70

Thời gian (h)

Ñoà thò 3.3. Ñoäng hoïc quaù trình nuoâi caáy B. subtilis CK2 sinh α-amylase

Chuùng toâi nhaän thaáy keát quûa ở baûng 3.13 phuø hôïp vôùi nhöõng keát quaû ñaõ

thu ñöôïc ôû treân. Cuï theå laø Bacillus subtilis CK2 sinh tröôûng cao nhaát vaøo thôøi

gian 40 giôø sau khi nuoâi caáy, vaø hoaït ñoä amylase cao nhaát luùc 45 giôø. Khi leân

men vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu thì hoaït ñoä amylase cao hôn haún so vôùi khi

khaûo saùt töøng ñieàu kieän nuoâi caáy.

3.7. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy, xaùc ñònh hoaït ñoä vaø ñoä beàn cuûa enzym

3.7.1. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy vôùi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau

Sau khi nghieân cöùu ñoäng hoïc thu ñöôïc amylase coù hoaït ñoä cao, chuùng toâi

tieán haønh taùch amylase nhôø caùc taùc nhaân tuûa nhö: etanol 960C, aceton, sulphate

amon theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.11. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû

baûng 3.14 vaø bieåu ñoà 3.9.

Baûng 3.14. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase töø caùc taùc nhaân tuûa

Taùc nhaân tuûa Hieäu suaát thu nhaän enzym (g/100ml)

Etanol 960C 1,23

Aceton 1,85

Sulphate amon 0,87

2.0

) l

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

ä

0.8

m 0 0 1 / g ( e s a l y m a E P C n a h n

0.6

á

0.4

u h t t a u s

0.2

u eä i H

0.0

Taùc nhaân tuûa

Etanol

Aceton

Sunfate am on

Bieåu ñoà 3.9. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase bôûi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau

Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy hieäu suaát thu nhaän CPE amylase ñaït giaù trò cao

khi duøng taùc nhaân tuûa laø aceton. Do aceton laø dung moâi khoâng phaân cöïc, coù haèng

soá ñieän moâi nhoû neân ngaên caûn söï phaân taùn cuûa caùc protein trong dung dòch. Vì

theá trong moâi tröôøng coù moät löôïng lôùn aceton ñaõ laøm keát tuûa caùc enzym, protein

vaø caùc taïp chaát phaân töû lôùn khaùc.

3.7.2. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa

Caân 0,1g CPE amylase töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau pha vôùi 50ml nöôùc

caát, roài tieáp tuïc pha loaõng vôùi noàng ñoä thích hôïp. Tieán haønh thí nghieäm xaùc ñònh

hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.15

vaø bieåu ñoà 3.10.

Baûng 3.15. Hoaït ñoä CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa

Taùc nhaân tuûa Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE)

Etanol 960 10902,28 ± 21,86

8525,82 ± 15,17 Aceton

3974,79 ± 19,27 Sulphate amon

12000

) g / I U

10000

8000

6000

ä

4000

ï

( e s a l y m a E P C o ñ t a o H

2000

0

Taùc nhaân tuûa

Etanol

Sulphate amon

Aceton

Bieåu ñoà 3.10. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa

Keát quaû theå hieän ôû baûng 3.15 cho thaáy khi duøng taùc nhaân tuûa laø etanol 960

thì hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc cao hôn so vôùi khi duøng taùc nhaân tuûa laø

aceton, sulphate amon. Vaäy chuùng toâi seõ duøng CPE amylase ñöôïc tuûa bôûi etanol

960C ñeå laøm caùc thí nghieäm tieáp theo.

3.7.3. Xaùc ñònh ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase

Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nhö phöông phaùp ôû muïc 2.3.13.1. Keát quaû

ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.16 vaø bieåu ñoà 3.11.

Baûng 3.16. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase

Nhiệt ñộ (oC) Hoaït ñoä CPE amylase (UI/g CPE) Hoaït ñoä coøn laïi (%)

11032,67 ± 41,43 4 100

11024,25 ± 15,17 30 99,92

10691,97 ± 15,17 96,91 40

10225,09 ± 11,13 92,68 50

9699,32 ± 18,33 87,91 60

8790,80 ± 8,41 70 79,68

3974,79 ± 19,27 80 36,03

88,33 ± 12,62 90

0,00 0,80 0,00 100

)

100

%

90

ï

( i a l

80

ø

70

60

50

40

30

ä

20

ï

10

n o c e s a l y m a E P C o ñ t a o H

0

Nhiệt độ (0C)

4

30

40

50

60

70

80

90

100

Bieåu ñoà 3.11. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase

Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy nhieät ñoä caøng cao thì hoaït ñoä cuûa amylase

caøng giaûm; ñaëc bieät laø töø 80-1000C: hoaït ñoä giaûm maïnh ôû 800C vaø gaàn nhö maát

khaû naêng hoaït ñoäng ôû 900C trôû leân. ÔÛ nhieät ñoä töø 30-700C CPE amylase hoaït

ñoäng töông ñoái toát. Vaäy CPE amylase cuûa chuûng Bacillus subtilis CK2 töông ñoái

beàn nhieät.

Nhöõng amylase beàn nhieät coù yù nghóa raát lôùn trong thöïc teá saûn xuaát vaø baûo

quaûn saûn phaåm sau naøy. Vì nhieät ñoä khoâng nhöõng aûnh höôûng ñeán thôøi gian baûn

quaûn saûn phaåm maø coøn aûnh höôûng ñeán caùch thöùc taïo cheá phaåm. Neáu chuùng ta

neùn saûn phaåm thaønh vieân ta coù theå baûo quaûn chuùng deã daøng hôn laø daïng boät

hoaëc daïng dòch loûng. Nhöng neáu ôû daïng vieân neùn thì phaûi xöû lyù ôû 1000C trong

voøng 30 phuùt, maø caùc amylase thu ñöôïc ôû treân seõ maát hoaït tính ôû 1000C neân

chuùng chæ thích hôïp baûo quaûn ôû daïng boät hoaëc daïng loûng.

Ngoaøi ra, caùc enzym beàn nhieät coøn coù nhieàu lôïi theá trong quaù trình xöû lyù

thöùc aên tröôùc khi cho vaät nuoâi aên. Thöùc aên ñöôïc uû ôû nhieät ñoä cao trong voøng vaøi

giôø maø vaãn khoâng laøm giaûm hoaït ñoä nhieàu maø coøn taêng toác ñoä phaûn öùng. Hôn nöõa

vieäc troän enzym vaøo thöùc aên ôû nhieät ñoä cao tröôùc khi cho vaät nuoâi aên coøn coù taùc

duïng laøm giaûm söï taïp nhieãm VSV coù haïi thöôøng phaùt trieån ôû nhieät ñoä 30-400C.

3.7.4. Xaùc ñònh ñoä beàn pH cuûa CPE amylase

pH laø yeáu toá aûnh höôûng nhieàu leân hoaït ñoäng cuûa enzym noùi chung vaø cuûa

amylase noùi rieâng. Vì theá chuùng toâi ñaõ tieán haønh xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa pH leân

ñoä beàn cuûa CPE amylase theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.13.2. Keát quaû

thu ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.17 vaø bieåu ñoà 3.12

Baûng 3.17 . Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase

pH Hoaït ñoä CPE amylase (UI/ g CPE) Hoaït ñoä amylase coøn laïi (%)

715,04 ± 8,41 4,0 6,27

4206,13 ± 11,13 4,5 36,89

8361,78 ± 8,41 5,0 73,33

10183,03 ± 14,57 5,5 89,30

11402,81 ± 8,41 6,0 100

10670,94 ± 15,17 6,5 93,58

9291,33 ± 11,13 7,0 81,48

8408,04 ± 15,17 7,5 73,74

5850,72 ± 18,33 8,0 51,31

)

100

%

ï

( i a l

80

ø

60

40

ä

20

ï

n o c e s a l y m a E P C o ñ t a o H

0

4,0

4,5

5,0

5,5

6,5

7,0

7,5

8,0 pH

6,0

Bieåu ñoà 3.12. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase

CPE amylase töông ñoái beàn ôû pH töø 5,0 ñeán 7,5; ngoaøi möùc pH naøy thì

CPE amylase hoaït ñoäng yeáu vaø chuùng hoaït ñoäng toát ôû pH = 6.

Chương IV: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ

 KEÁT LUAÄN

Töø nhöõng keát quaû ôû treân, chuùng toâi ñöa ra moät soá keát luaän nhö sau:

1. Töø maãu ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ chuùng toâi ñaõ phaân laäp ñöôïc 17

chuûng thuaàn (kyù hieäu laø CK). Trong ñoù tuyeån choïn ñöôïc 3 chuûng laø CK1,

CK2, CK3 coù khaû naêng sinh enzym amylase coù hoaït tính cao (vôùi D-d laàn

löôït laø: 20, 22 vaø 25mm). Tieáp tuïc nghieân cöùu khaû naêng sinh tröôûng (ño

OD620) vaø xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel, chuùng toâi

choïn ñöôïc chuûng CK2 vöøa coù khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh amylase maïnh

2. Töø nhöõng ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 maø chuùng toâi ñaõ trình baøy ôû

nhaát.

baûng 3.4, chuùng toâi ñi ñeán keát luaän: chuûng CK2 laø moät loaøi thuoäc chi

Bacillus. Ñoàng thôøi chuûng naøy cuõng ñöôïc ñònh danh ñeán loaøi baèng kyõ

thuaät di truyeàn phaân töû ñaõ cho keát luaän chuûng naøy laø Bacillus subtilis

(chuùng toâi ñaët teân laø Bacillus subtilis CK2).

3. Caùc ñieàu kieän toái öu cho hoaït ñoäng sinh tröôûng vaø sinh amylase coù hoaït

ñoä cao cuûa chuûng Bacillus subtilis CK2 laø:

 Cô chaát: chuûng naøy sinh tröôûng vaø sinh amylase maïnh nhaát khi nuoâi

caáy trong moâi tröôøng coù cô chaát laø tinh boät tan. Ñaëc bieät vôùi noàng ñoä tinh

boät tan laø 1,5% thì chuûng naøy sinh tröôûng maïnh nhaát (OD620 = 1,612) vaø

 Nhieät ñoä toái öu ñeå nuoâi caáy laø: 35 - 370C.

 pH ban ñaàu thích hôïp cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy laø pH = 7,0 - 7,5.

cho amylase coù hoaït ñoä cao nhaát (16,370 UI/ml) .

 Ñoä hieáu khí: tæ leä theå tích dòch nuoâi caáy/theå tích bình nuoâi laø:

100ml/500ml.

 Noàng ñoä caùc loaïi: muoái NaCl thích hôïp laø 0,08%; CaCl2: 0,01%.

4. Khi nuoâi caáy vôùi taát caû caùc ñieàu kieän toái öu thì chuûng naøy cho amylase coù

hoaït ñoä cao hôn so vôùi khi nghieân cöùu töøng ñieàu kieän nuoâi caáy. Chuùng toâi

tieán haønh taùch amylase nhôø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau, keát quaû cho thaáy

aceton cho amylase vôùi haøm löôïng cao, coøn etanol 960 laïi cho amylase coù

hoaït ñoä cao. Neân chuùng toâi quyeát ñònh söû duïng etanol 960 laøm taùc nhaân

tuûa ñeå taùch amylase.

5. CPE amylase thu ñöôïc töø taùc nhaân tuûa laø Etanol 960 töông ñoái beàn nhieät,

hoaït ñoäng toát vôùi nhieät ñoä 30–700C, ñoàng thôøi chòu ñöôïc pH vôùi ngöôõng

 KIEÁN NGHÒ

roäng töø 5,0 - 8,0.

Treân ñaây laø nhöõng keát quaû nghieân cöùu böôùc ñaàu, ñeå taêng hieäu quaû öùng

duïng cuûa ñeà taøi naøy, chuùng toâi ñeà nghò tieáp tuïc nghieân cöùu theâm caùc höôùng sau:

1. Nghieân cöùu qui trình saûn xuaát amylase ôû quy moâ lôùn hôn vôùi caùc thieát bò

leân men chìm ñeå thu nhaän amylase coù haøm löôïng vaø hoaït ñoä cao.

2. Nghieân cöùu toái öu hoaù caùc yeáu toá aûnh höôûng nhaèm naâng cao hoaït ñoä vaø

ñoä beàn cuûa amylase.

3. Tinh saïch CPE amylase coù hoaït ñoä cao ñeå öùng duïng coù hieäu quaû vaøo

saûn xuaát.

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

Tieáng Vieät

1. Nguyeãn Höõu Chaán (1996), Enzym vaø xuùc taùc sinh hoïc, NXB Y hoïc.

2. GS.TSKH. Phaïm Thò Traân Chaâu, PGS.TS. Phan Tuaán Nghóa, Coâng

ngheä sinh hoïc taäp ba – Enzym vaø öùng duïng, NXB Giaùo duïc.

3. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty (2003), Vi sinh

vaät hoïc, NXB Giaùo Duïc.

4. Leâ Thò Hoaøng Haïnh (2006), Nghieân cöùu caùc ñaëc tính vaø öùng duïng cuûa

amylase töø vi sinh vaät daïng hoaø tan, daïng coá ñònh, Luaän vaên Thaïc só

Sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Tp. Hoà Chí Minh.

5. Cao Thò Haïnh (2007), Nghieân cöùu nuoâi vi khuaån Bacillus thu sinh khoái

ñeå saûn xuaát cheá phaåm EMINA duøng trong chaên nuoâi vaø baûo veä moâi

tröôøng, Khoaù luaän toát nghieäp, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng nghieäp I – Haø

Noäi.

6. Tröông Phöôùc Thieân Hoaøng (2007), Khaûo saùt hoaït tính moät soá heäenzym

thuyû phaân amylase, cellulase, pectinase thu töø ba chuûng

Trichoderma phaân laäp töø mieàn Ñoâng Nam Boä, Luaän vaên Thaïc só

Sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân Tp. Hoà Chí Minh.

7. PGS.TS. Phaïm Thò Aùnh Hoàng, Taøi lieäu thöïc taäp kyõ thuaät sinh hoaù,

Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân Tp. Hoà Chí Minh.

8. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (chuû bieân), Cao Cöôøng, Nguyeãn Aùnh Tuyeát, Leâ

Thò Thuyû Tieân, Huyønh Ngoïc Oanh, Nguyeãn Thuyù Höông, Phan Thò

Huyeàn, Taï Thu Haèng (2004), Coâng ngheä enzym, NXB Ñaïi hoïc

Quoác gia Tp. Hoà Chí Minh,.

9. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh taäp 2 – Vi sinh vaät hoïc coâng

nghieäp, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Tp. Hoà Chí Minh.

10. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2002), Vi sinh vaät coâng nghieäp, NXB Ñaïi hoïc

Quoác gia Tp. Hoà Chí Minh.

11. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Phan Thò Huyeàn, Nguyeãn Aùnh Tuyeát (2003), Thí

nghieäm vi sinh vaät hoïc, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia Tp. Hoà Chí Minh.

12. Traàn Ñình Maán, Löông Ñöùc Phaåm, Leâ Vaên Nhöông (2001), Taùch saïch

α-amylase chòu nhieät töø chuûng vi khuaån 3BT2 vaø S168M

[PHV33BLAMY.BSPR], Hoäi thaûo quoác teá Sinh hoïc.

13. Löông Ñöùc Phaåm (2004), Coâng ngheä vi sinh vaät, NXB Noâng nghieäp.

14. Nguyeãn Quyeát (2004), Nghieân cöùu caùc ñaëc tính vaø öùng duïng cuûa

α-amylase daïng hoaø tan vaø daïng coá ñònh thu nhaän töø vi khuaån

Bacillus subtilis, Luaän vaên Thaïc só khoa hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa

hoïc Töï nhieân Tp. Hoà Chí Minh.

15. Ñoàng Thò Thanh Thu (2004), Giaùo trình sinh hoaù cô baûn, Tuû saùch

Tröôøng Ñaïi hoïc Töï nhieân, Tp. Hoà Chí Minh.

16. Ñaëng Thò Thu, Leâ Ngoïc Tuù, Toâ Kim Anh, Phaïm Thu Thuyû, Nguyeãn

Xuaân Saâm (2004), Coâng ngheä enzym, NXB Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät.

17. Nguyeãn Thò Huyeàn Thu (2007), Nghieân cöùu, phaân laäp vaø tuyeån choïn

caùc chuûng Bacillus sinh enzym thuyû phaân töø ñaát vöôøn, Khoaù luaän toát

nghieäp, Vieän Ñaïi hoïc Môû Haø Noäi.

18. Traàn Linh Thöôùc, Nguyeãn Ñöùc Hoaøng, Phan Thò Phöôïng Trang, Phaïm

Thò Hoàng Töôi, Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia

Tp. Hoà Chí Minh.

19. Traàn Linh Thöôùc, Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät trong nöôùc, thöïc

phaåm vaø myõ phaåm, NXB Giaùo duïc.

20. Ñoaøn Vaên Thöôïc (2005), Tuyeån choïn vaø nghieân cöùu moät soá chuûng vi

sinh vaät coù khaû naêng sinh amylase treân baõ saén pheá thaûi ñeå saûn xuaát

enzym cho chaên nuoâi gia suùc, Luaän vaên Thaïc só Khoa hoïc Sinh hoïc,

Tröôøng Ñaïi hoïc Sö Phaïm Haø Noäi.

21. Laïi Thanh Tuøng (2003), Nghieân cöùu tuyeån choïn vi sinh vaät öa maën, öa

kieàm coù hoaït tính sinh hoïc phaân laäp töø nöôùc bieån ven bôø bieån Baéc

boä, Luaän vaên Thaïc só Sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân

Haø Noäi.

22. Ñaøo Thò Thanh Xuaân (2008), Nghieân cöùu söû duïng nhoùm vi khuaån

Bacillus taïo cheá phaåm sinh hoïc xöû lyù moâi tröôøng nöôùc nuoâi thuyû saûn,

Luaän vaên Thaïc só Sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc Sö Phaïm Haø Noäi.

Tieáng nöôùc ngoaøi

23. Arie Altman (1998), Agricutural biotechnology, Marcel Dekker, Inc,

New York. Basel. HongKong, pp.263-275.

24. Dertz, E. A.; Xu, J.; Stintzi, A.; Raymond, K. N. (2006), Bacillibactin-

Mediated Iron Transport in Bacillus subtilis, J. Am. Chem. Soc.

25. George A. Wistreich (1984), Microbiology laboratory, Macmillan

publishing.

26. Gerhartz. W. (1992). Enzyme in Industry. Production and Applications.

V. H. C. Weiheim. New York.

27. Gupta, R.; Gigras, P.; Mohapatra, H. (2003), Microbial amylase: a

biotechnological perspectiye, Process Biochemistry.

28. Harold E. Swaisgood (1991), Immobilized Enzym: Applications to

Bioprocessing of Food, Department of Food Scien, University

Biotechnology Program, USA, pp. 309 – 313.

29. Horikoshi Koki (1999), Alkaliphiles:Some applications of their products

for biotechnology, Microbiology and molecular biology reviews.

30. Harry Seeley, Jonh Lee (1994), Laboratory manual of Microbiology, pp

437.

31. Haq, I.; Ashraf, H.; Iqbal, J. (2003), Production of alpha-amylase by

Bacillus licheniformis using an economical medium, Bioresource

Technology.

32. K. Mathews, K.E Van Holde (1995), Biochemistry, The Benjamin/

Cummings, pp. 229-231.

33. Nam Sun Wang (2001), Starch hydrolysis by amylase, Department of

Chemical Engineering, University of Maryland.

37. Pandey A. et. Al (2000), Advences in microbial amylase, Biotechnology

and Applied Biochemistry.

38. Sonenshein, A. L.; Hoch, J. A.; Losick, R. (1993), Bacillus subtilis and

other Gram-positive Bacteria: biochemistry physiology and

molecular genetics, American Society for Microbiology.

39. Todar, K. Ph. D (2008), Bacillus and related endospore-forming

bacteria, Todar’s online textbook of bacteriology.

Ñòa chæ truy caäp Internet

43. http://www.bookrags.com/wiki/Amylase.

44. http://monava.vn/web.php?search=%C4%91%E1%BB%81+t%C3%A0i

+enzyme+alpha+amylase vi+khu%E1%BA%A9n+Bacillus&zone=vn.

45. http://www.rhodes.edu/biology/Biology.

46. http://seafood.ucdavis.edu/organize/rapid.html.

47. http://www.epa.gov/OGWDW/certlab/labfront.html#toc.

48. http://www.siue.edu/~cbwilso/250graphics00.html.

49. http://en.wikipedia.org/wiki/amylase.html

50. www.glue.umd.edu/~nsw/ench485/lab5.html.

PHUÏ LUÏC

PHOØNG XEÙT NGHIEÄM NK-BIOTEK 793/58 TRAÀN XUAÂN SOÏAN, P. TAÂN HÖNG, Q.7, TP. HCM ÑT: (848) 7715818, 8328, 8329 Fax: (848) 7750583, 2250 Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com, namkhoa.biotek@gmail.com GP soá: 41G8005341

Theo ñònh höôùng ISO 15189

48779/0409/DVTN

Soá:

KEÁT QUAÛ THÍ NGHIEÄM

Nôi gôûi maãu:

THOÂNG TIN VEÀ MAÃU THÖÛ

Trường Đại Học Sư Phạm TPHCM

Maãu thöû:

Chuûng CK

Yeâu caàu:

Ñònh danh baèng phöông phaùp giaûi trình töï gen 16S rRNA

PHÖÔNG PHAÙP THÖÏC HIEÄN

Keát quaû nhuoäm Gram

Tröïc khuaån Gram (+) Keát quaû caáy treân thaïch maùu

 Giaûi trình töï gen 16S rRNA vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH

Keát quaû giaûi trình töï gen 16S rRNA CATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGA CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGG AAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAA AAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTT GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGT GATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTG AGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT ACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC TAACTACGTGCCA

Keát quaû tra cöùu treân BLAST SEARCH

gb|FJ263034.1| Bacillus subtilis strain RC22 16S ribosomal RNA gene,

> partial

sequence Length=1465 Score = 874 bits (473), Expect = 0.0 Identities = 473/473 (100%), Gaps = 0/473 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 CATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 26 CATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT 85 Query 61 AACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 86 AACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG 145 Query 121 GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 146 GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA 205 Query 181 TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 206 TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTA 265 Query 241 GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 266 GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG 325 Query 301 AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 326 AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG 385 Query 361 TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 386 TGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAAT 445 Query 421 AGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA 473 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 446 AGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA 498

KEÁT LUAÄN

Bacillus subtilis

TP. Hoà Chí Minh, ngaøy 17 thaùng 04 naêm 2009

TRÖÔÛNG PHOØNG

Baûng 1.1. Döïng ñöôøng chuaån tinh boät

1. ÑOÀ THÒ CHUAÅN TINH BOÄT ÑEÅ XAÙC ÑÒNH HOAÏT ÑOÄ AMYLASE (THEO PHÖÔNG PHAÙP HEINKEL)

OÁng soá 1 2 3 4 5 6

löôïng tinh boät 0 1 2 3 4 5 Haøm (mg/ml)

0,002 0,044 0,086 0,126 0,171 0,208 OD (560nm)

6

0 0,042 0,084 0,124 0,169 0,206 Delta OD

) l

5

m / g m

y = 24.035x R2 = 0.9996

ä

4

3

ï

( t o b h n i t g n ô ö

l

2

ø

m a H

1

0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Delta OD

Ñoà thò 1.1. Söï töông quan giöõa ΔOD560nm vaø haøm löôïng tinh boät (mg/ml)

2. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Baûng 2. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK

Soá laàn ño Sai soá Chuûng Trung bình 1 2 3

Delta OD 0,208 0,197 0,213 0,206 0,005

CK 1 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,999 4,735 5,119 4,951 0,114

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,50 9,94 10,75 10,398 0,239

Delta OD 0,321 0,315 0,325 0,320 0,003

CK 2 Löôïng tinh boät(mg/ml) 7,715 7,571 7,811 7,699 0,070

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,20 15,90 16,40 16,168 0,147

Delta OD 0,184 0,178 0,18 0,181 0,002

CK 3 Löôïng tinh boät(mg/ml) 4,422 4,278 4,326 4,342 0,042

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 9,29 8,98 9,09 9,119 0,089

3. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh toång hôïp α – amylase cuûa chuûng CK2. Baûng 3.1. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät gaïo ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Thôøi gian (h)

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,045 1,082 0,042 1,009 0,045 1,082 0,044 1,058 0,001 0,024 20

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 2,271 2,120 2,271 0,050 2,221

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,083 1,995 0,082 1,971 0,083 1,995 0,083 0,0003 0,008 1,987 30

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 4,189 4,139 4,189 0,017 4,172

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,128 3,076 0,127 3,052 0,130 3,125 0,128 3,084 0,001 0,021 40

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 6,461 6,410 6,562 0,045 6,477

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,166 3,990 0,165 3,966 0,163 3,918 0,165 3,958 0,001 0,021 45

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,379 8,328 8,227 0,045 8,311

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,160 3,846 0,165 3,966 0,164 3,942 0,163 3,918 0,002 0,037 50

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,076 8,328 8,278 0,077 8,227

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,160 3,846 0,158 3,798 0,158 3,798 0,159 3,814 0,001 0,016 55

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 8,076 7,975 7,975 0,034 8,008

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,151 3,629 0,152 3,653 0,156 3,749 0,153 3,677 0,002 0,037 60

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,621 7,672 7,874 0,077 7,722

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,144 3,461 0,138 3,317 0,142 3,413 0,141 3,397 0,002 0,042 70

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 7,268 6,965 7,167 0,089 7,134

Baûng 3.2. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät myø ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Thôøi gian (h)

20

30

40

45

50

55

60

70

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,077 1,851 3,886 0,099 2,379 4,997 0,131 3,149 6,612 0,151 3,629 7,621 0,150 3,605 7,571 0,148 3,557 7,470 0,147 3,533 7,420 0,132 3,173 6,663 0,074 1,779 3,735 0,102 2,452 5,148 0,129 3,101 6,511 0,155 3,725 7,823 0,148 3,557 7,470 0,147 3,533 7,420 0,143 3,437 7,218 0,130 3,125 6,562 0,076 1,827 3,836 0,104 2,500 5,249 0,129 3,101 6,511 0,150 3,605 7,571 0,150 3,605 7,571 0,148 3,557 7,470 0,145 3,485 7,319 0,129 3,101 6,511 0,001 0,076 0,021 1,819 0,045 3,819 0,001 0,102 0,035 2,444 0,073 5,131 0,001 0,130 0,016 3,117 0,034 6,545 0,002 0,152 0,037 3,653 0,077 7,672 0,001 0,149 0,016 3,589 0,034 7,537 0,148 0,0003 0,008 3,549 0,017 7,453 0,001 0,145 0,028 3,485 0,058 7,319 0,001 0,130 0,021 3,133 0,045 6,578

Baûng 3.3. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø boät baép ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Thôøi gian (h)

20

30

40

45 0,078 1,867 3,920 0,125 3,012 6,326 0,160 3,838 8,059 0,202 4,863 0,077 1,851 3,886 0,122 2,932 6,158 0,159 3,822 8,025 0,205 4,927

50 0,199 4,783 0,201 4,823

55

60

70

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,079 0,077 0,001 1,899 1,851 0,016 3,987 3,886 0,034 0,126 0,128 0,002 3,028 3,076 0,042 6,360 6,461 0,089 0,158 0,162 0,001 3,798 3,894 0,029 7,975 8,177 0,061 0,202 0,200 0,001 0,035 4,807 4,855 10,196 10,347 10,095 10,212 0,073 0,001 0,203 0,200 4,807 0,029 4,879 10,095 10,044 10,246 10,128 0,061 0,197 0,001 0,199 0,197 0,196 0,021 4,711 4,735 4,743 4,783 0,045 9,893 10,044 9,960 9,943 0,001 0,182 0,180 0,184 0,182 0,028 4,374 4,326 4,422 4,374 0,058 9,085 9,287 9,186 9,186 0,167 0,0003 0,167 0,167 0,168 0,008 4,022 4,014 4,014 4,038 0,017 8,429 8,429 8,480 8,446

Baûng 3.4. AÛnh höôûng loaïi cô chaát laø tinh boät tan ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình Thôøi gian (h)

20

30

40 0,097 2,339 4,913 0,147 3,525 7,403 0,203 3,469 2 0,096 2,307 4,845 0,148 3,557 7,470 0,205 3,485

45 0,297 4,422 0,295 4,374

50 0,290 6,970 0,290 6,978

55 0,285 6,850 0,286 6,866

60 0,273 6,570 0,274 6,586

70 0,248 5,961 0,249 5,985

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 3 1 0,001 0,098 0,098 0,016 2,355 2,355 0,034 4,946 4,946 0,001 0,148 0,144 0,032 3,557 3,461 0,067 7,470 7,268 0,001 0,203 0,202 3,461 0,008 3,461 10,196 10,347 10,246 10,263 0,045 0,001 0,295 0,293 4,374 0,028 4,326 14,789 14,991 14,890 14,890 0,058 0,001 0,293 0,288 0,035 7,042 6,922 14,536 14,637 14,789 14,654 0,073 0,001 0,287 0,285 0,016 6,898 6,850 14,385 14,385 14,486 14,419 0,034 0,276 0,002 0,270 0,042 6,489 6,634 13,931 13,830 13,628 13,796 0,089 0,001 0,249 0,246 5,913 0,024 5,985 12,416 12,568 12,568 12,517 0,050

Baûng 3.5. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3

noàng ñoä tinh boät tan (%)

0,5

1,0 0,186 4,471 9,388 0,266 6,393 0,185 4,454 9,354 0,265 6,361

1,5 0,326 7,835 0,324 7,795

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,281 6,762 0,283 6,802

2,0 Hoaït ñoä amylase (UI/ml)

2,5

Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,185 4,446 9,338 0,001 0,186 0,184 0,016 4,471 4,422 0,034 9,388 9,287 0,002 0,261 0,267 6,417 0,045 6,273 13,476 13,426 13,174 13,359 0,094 0,001 0,325 0,322 7,739 0,029 7,811 16,252 16,454 16,404 16,370 0,061 0,001 0,280 0,281 6,754 0,021 6,730 14,183 14,284 14,133 14,200 0,045 0,001 0,188 0,188 0,024 4,519 4,519 9,489 9,489 0,050 0,187 4,495 9,439

Baûng 3.6. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Nhieät ñoä (0C)

Delta OD 0,279 0,277 0,275 0,277 0,001

Löôïng tinh boät(mg/ml) 6,706 6,658 6,610 6,658 0,028 25-28

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 14,082 13,981 13,880 13,981 0,058

Delta OD 0,411 0,415 0,412 0,413 0,001

30-33 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,878 9,975 9,902 9,918 0,029

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 20,745 20,947 20,795 20,829 0,061

Delta OD 0,632 0,635 0,634 0,634 0,001

35-37

Löôïng tinh boät(mg/ml) 15,190 15,262 15,238 15,230 0,021 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 31,899 32,051 32,000 31,983 0,045

Delta OD 0,565 0,560 0,562 0,562 0,001

38-40 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,580 13,460 13,508 13,516 0,035

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,518 28,265 28,366 28,383 0,073

0,474 0,476

40-42

42-45 0,377 9,061 0,371 8,917 0,373 8,965 0,371 8,917

0,476 0,001 0,478 Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 11,441 11,393 11,489 11,441 0,028 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,025 23,924 24,126 24,025 0,058 0,002 Delta OD 0,048 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 18,726 18,726 19,029 18,827 0,101

Baûng 3.7. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu

pH Sai soá

5,0

5,5

6,0

6,5 Trung bình 0,023 0,545 1,144 0,032 0,769 1,615 0,176 4,238 8,900 0,295 7,098 Soá laàn ño 2 0,024 0,577 1,211 0,030 0,721 1,514 0,177 4,254 8,934 0,298 7,162 1 0,021 0,505 1,060 0,032 0,769 1,615 0,176 4,230 8,883 0,298 7,162 3 0,023 0,553 1,161 0,034 0,817 1,716 0,176 4,230 8,883 0,290 6,970

0,472 0,478 0,477

7,0 0,476 11,465 11,489 11,345 11,433

0,547 0,546

7,5

8,0 0,310 7,451 0,308 7,403 0,310 7,443 0,311 7,475

8,5

0,098 2,355 4,946 0,096 2,307 4,845 0,001 Delta OD 0,021 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,045 0,001 Delta OD 0,028 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,058 0,000 Delta OD 0,008 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,017 0,003 Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,064 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 15,041 15,041 14,637 14,907 0,135 0,002 Delta OD 0,045 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,076 24,126 23,823 24,009 0,094 Delta OD 0,002 0,550 0,545 13,099 13,123 13,219 13,147 0,037 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 27,508 27,559 27,760 27,609 0,077 Delta OD 0,001 0,021 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 15,697 15,546 15,647 15,630 0,045 0,001 Delta OD 0,035 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,073 0,098 2,363 4,963

0,101 2,428 5,098

Baûng3.8. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase

Soá laàn ño

Trung bình Sai soá 1 2 3

Theå tích dòch nuoâi caáy (ml)

50 0,327 7,859 0,324 7,787 0,324 7,787 0,325 7,811

0,443 0,442

75

0,001 Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,024 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,505 16,353 16,353 16,404 0,050 0,001 Delta OD 0,444 0,440 Löôïng tinh boät(mg/ml) 10,575 10,648 10,672 10,631 0,029 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 22,208 22,360 22,410 22,326 0,061 0,001 Delta OD 0,558 0,560 0,559 0,558

100 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,412 13,460 13,412 13,428 0,016

150 0,328 7,883 0,329 7,908 0,328 7,875 0,326 7,835

200 0,264 6,345 0,266 6,393 0,265 6,361 0,264 6,345

250 0,213 5,119 0,213 5,111 0,215 5,168 0,210 5,047

300

0,184 4,422 9,287 0,184 4,422 9,287 0,182 4,374 9,186 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,164 28,265 28,164 28,198 0,034 0,001 Delta OD Löôïng tinh boät(mg/ml) 0,021 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 16,606 16,555 16,454 16,538 0,045 0,001 Delta OD 0,016 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 13,325 13,325 13,426 13,359 0,034 0,001 Delta OD 0,035 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 10,852 10,599 10,751 10,734 0,073 0,001 Delta OD 0,016 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,034 0,183 4,406 9,253

Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl

Sai soá NaCl (%) Trung bình

0

0,03 Soá laàn ño 2 0,085 2,043 4,290 0,234 5,624 3 0,084 2,019 4,240 0,234 5,624 1 0,081 1,947 4,088 0,231 5,552 0,083 2,003 4,206 0,233 5,600

0,05 0,388 9,326 0,385 9,253 0,387 9,302 0,388 9,326

0,001 Delta OD 0,029 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,061 0,001 Delta OD 0,024 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 11,659 11,811 11,811 11,760 0,050 Delta OD 0,001 0,024 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,584 19,432 19,584 19,533 0,050 0,000 Delta OD 0,806 0,806 0,806 0,805

0,08 Löôïng tinh boät(mg/ml) 19,372 19,348 19,372 19,364 0,008

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 40,682 40,631 40,682 40,665 0,017

Delta OD 0,662 0,666 0,663 0,664 0,001

0,1 Löôïng tinh boät(mg/ml) 15,911 16,007 15,935 15,951 0,029

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 33,413 33,615 33,464 33,498 0,061

Delta OD 0,525 0,527 0,525 0,526 0,001

0,12

Löôïng tinh boät(mg/ml) 12,618 12,666 12,618 12,634 0,016 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 26,499 26,600 26,499 26,532 0,034

Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä CaCl2

%CaCl2 Trung bình Sai soá

Soá laàn ño 2 0,485

0

3 1 0,481 0,483 0,001 0,483 Delta OD 11,561 11,657 11,609 11,609 0,028 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 24,278 24,480 24,379 24,379 0,058 0,566 0,001 Delta OD 0,565 0,568 0,565

0,01 Löôïng tinh boät(mg/ml) 13,652 13,580 13,580 13,604 0,024

0,458

0,015

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 28,669 28,518 28,518 28,568 0,050 Delta OD 0,456 0,001 0,456 0,455 10,936 11,008 10,960 10,968 0,021 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 22,965 23,117 23,016 23,033 0,045 0,406 0,001 Delta OD 0,404 0,405 0,408

0,02 Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,710 9,734 9,806 9,750 0,029

Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 20,391 20,442 20,593 20,475 0,061

Delta OD 0,378 0,373 0,375 0,375 0,001

0,025 8,965 9,013 9,085

Löôïng tinh boät(mg/ml) 9,021 0,035 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,079 18,827 18,928 18,944 0,073

4. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men chuûng CK2 trong bình tam giaùc 1 lít. Baûng 4. Hoaït ñoä amylase trong quaù trình nghieân cöùu ñoäng hoïc

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Thôøi gian (h)

20 0,387 9,302 0,388 9,326

0,425

30

0,508

35

0,640

40

0,885 0,885 0,001 0,387 0,385 Delta OD 0,021 9,294 9,253 Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 19,432 19,584 19,533 19,516 0,045 0,421 0,001 0,423 0,424 Delta OD 10,119 10,215 10,191 10,175 0,029 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 21,249 21,451 21,401 21,367 0,061 0,504 0,001 0,506 0,505 Delta OD 12,114 12,210 12,138 12,154 0,029 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 25,439 25,641 25,489 25,523 0,061 0,002 0,641 0,644 0,639 Delta OD 15,358 15,382 15,479 15,406 0,037 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 32,253 32,303 32,505 32,354 0,077 0,002 0,883 0,880 Delta OD

45 21,151 21,271 21,271 21,231 0,040

0,875

50

0,853

55

0,803

60

0,756

70

Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 44,417 44,669 44,669 44,585 0,084 0,871 0,002 0,875 0,878 Delta OD 20,934 21,031 21,103 21,023 0,049 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 43,962 44,164 44,316 44,147 0,102 0,849 0,002 0,852 0,855 Delta OD 20,406 20,502 20,550 20,486 0,042 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 42,852 43,054 43,155 43,020 0,089 0,797 0,003 0,803 0,808 Delta OD 19,156 19,300 19,420 19,292 0,076 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 40,227 40,530 40,783 40,513 0,160 0,751 0,002 0,755 0,757 Delta OD 18,050 18,170 18,194 18,138 0,045 Löôïng tinh boät(mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 37,906 38,158 38,208 38,091 0,094

5. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa Baûng 5. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase (UI/g CPE) thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Taùc nhaân tuûa

0,861 0,867 0,864 0,864 0,002

20,694 20,838 20,766 20,766 0,042

etanol 960C

10864 10940 10902 10902,28 21,86

0,678 0,675 0,674 0,676 0,001

16,296 16,224 16,200 16,240 0,029 aceton

8555,3 8517,4 8504,8 8525,82 15,17

0,314 0,318 0,313 0,315 0,002

7,547 7,6431 7,523 7,571 0,037

sulphate amon

3962,2 4012,6 3949,6 3974,79 19,27 Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE)

6. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Baûng 6. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase

Soá laàn ño

Sai soá Trung bình 1 2 3 Nhiệt ñoä (0C)

0,876 0,879 0,868 0,874 0,003

21,055 21,127 20,862 21,015 0,079 4

11053,70 11091,55 10952,75 11032,67 41,43

0,873 0,872 0,876 0,874 0,001

20,983 20,959 21,055 20,999 0,029 30

11015,84 11003,22 11053,70 11024,25 15,17

0,848 0,849 0,845 0,847 0,001

20,382 20,406 20,310 20,366 0,029 40

10700,38 10713,00 10662,53 10691,97 15,17

0,809 0,812 0,81 0,810 0,001

19,444 19,516 19,468 19,476 0,021 50

10208,27 10246,12 10220,88 10225,09 11,13

0,766 0,769 0,771 0,769 0,001

18,411 18,483 18,531 18,475 0,035 60

9665,68 9703,53 9728,77 9699,32 18,33

70 Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD 0,696 0,698 0,696 0,697 0,001

Löôïng tinh boät 16,728 16,776 16,728 16,744 0,016

(mg/ml)

8782,39 8807,63 8782,39 8790,80 8,41

0,313 0,318 0,314 0,315 0,002

7,523 7,6431 7,547 7,571 0,037 80

3949,55 4012,64 3962,17 3974,79 19,27

0,009 0,006 0,006 0,007 0,001

0,216 0,1442 0,1442 0,168 0,024 90

113,57 75,71 75,71 88,33 12,62 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE)

0 0 0 0 0,00 100 Delta OD

7. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase Baûng 7. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase

Soá laàn ño pH Sai soá Trung bình 1 2 3

0,056 0,056 0,058 0,057 0,001

1,346 1,346 1,394 1,362 0,016 4,0

706,63 706,63 731,87 715,04 8,41

0,333 0,332 0,335 0,333 0,001

8,004 7,980 8,052 8,012 0,021 4,5

4201,92 4189,30 4227,16 4206,13 11,13

5,0 0,662 0,664 0,662 0,663 0,001

15,911 15,959 15,911 15,927 0,016 Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml)

8353,36 8378,60 8353,36 8361,78 8,41

0,805 0,809 0,807 0,807 0,001

19,348 19,444 19,396 19,396 0,028 5,5

10183,03 14,57

10157,7 9 0,903 10208,2 7 0,905 10183,0 3 0,903 0,904 0,001

21,704 21,752 21,704 21,720 0,016 6,0

11402,81 8,41

11394,3 9 0,848 11419,6 3 0,845 11394,3 9 0,844 0,846 0,001

20,382 20,310 20,286 20,326 0,029 6,5

10670,94 15,17

10700,3 8 0,736 10662,5 3 0,738 10649,9 1 0,735 0,736 0,001

17,690 17,738 17,666 17,698 0,021 7,0

9287,12 9312,36 9274,51 9291,33 11,13

0,664 0,668 0,667 0,666 0,001

15,959 16,055 16,031 16,015 0,029 7,5

8378,60 8429,07 8416,46 8408,04 15,17

0,464 0,461 0,466 0,464 0,001

11,152 11,080 11,200 11,144 0,035 8,0

5854,93 5817,07 5880,16 5850,72 18,33 Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Delta OD Löôïng tinh boät (mg/ml) Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE)

Lôøi Caûm Ôn

დ Toâi xin chaân thaønh baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán:

PGS.TS. Löông Ñöùc Phaåm ñaõ taän tình höôùng daãn, luoân ñoäng vieân

დ Toâi xin gôûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán:

vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy.

TS. Traàn Thanh Thuyû vaø caùc Caùn boä phoøng thí nghieäm Vi sinh -

Sinh hoaù – Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm TP. HCM.

Quyù Thaày, Coâ tröïc tieáp giaûng daïy.

Phoøng Khoa hoïc Coâng ngheä Sau ñaïi hoïc - Tröôøng Ñaïi hoïc Sö

phaïm TP. HCM.

Ban Giaùm hieäu – Tröôøng THPT Nguyeãn Traõi vaø Tröôøng THPT

chuyeân Leâ Quyù Ñoân – tænh Ninh Thuaän.

Caùc Caùn boä phoøng thí nghieäm Sinh hoaù – Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa

hoïc Töï nhieân.

Vaø caùc baïn beø, ñoàng nghieäp.

Ñaõ truyeàn ñaït kieán thöùc, chia seû, ñoäng vieân tinh thaàn vaø taïo moïi

ñieàu kieän giuùp ñôõ toâi trong thôøi gian hoïc taäp vaø thöïc hieän ñeà taøi.

დ Cuoái cuøng toâi xin ghi nhaän tình caûm yeâu thöông cuûa nhöõng ngöôøi

thaân trong gia ñình, luoân uûng hoä, ñoäng vieân toâi vöôït qua nhöõng khoù

khaên trong cuoäc soáng cuõng nhö trong coâng taùc.

NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI

CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT TRONG LUAÄN VAÊN

B. subtilis Bacillus subtilis :

CPE : Cheá phaåm enzym

ÑVHÑ : Ñôn vò hoaït ñoä

OD : Giaù trò maät ñoä quang

Delta OD : Hieäu soá giaù trò maät ñoä quang

VSV : Vi sinh vaät

DANH MUÏC CAÙC BAÛNG

Trang

Baûng 1.1. Ñoä beàn nhieät cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau…………………………. 17

Baûng 3.1. Ñöôøng kính phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK…………….…………………………44

Baûng 3.2. Söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK………………………………………………………….………...45

Baûng 3.3. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK…………………………………………………46

Baûng 3.4. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2…………………………………………………49

Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase……………………………………..……50

Baûng 3.6. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase…………………..…….52

Baûng 3.7. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase………………………………………….………53

Baûng 3.8. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase………………………………….….……54

Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase……………………….………..55

Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái NaCl ñeán hoaït ñoä amylase…….………..57

Baûng 3.11. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït tính amylase……………………………….58

Baûng 3.12. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng…………………………………….………59

Baûng 3.13. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men Bacillus subtilis CK2……….61

Baûng 3.14. Thu nhaän cheá phaåm enzym (CPE) amylase töø caùc taùc nhaân tuûa…….62

Baûng 3.15. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase khi duøng caùc taùc nhaân tuûa……….………….…63

Baûng 3.16. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase………………………………………………………….…………..…...64

Baûng 3.17 . Ñoä beàn pH cuûa amylase………………………..………………………………………………………66

DANH MUÏC CAÙC HÌNH, ÑOÀ THÒ VAØ BIEÅU ÑOÀ

Trang

Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase……………………………………………………………………………..16

Hình 3.1. Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK……………………….…………………………..44

Hình 3.2. Hình thaùi khuaån laïc chuûng CK2……………………………………………………………………..47

Hình 3.3. Hình thaùi teá baøo chuûng CK2…………………………………………………………………………….48

Hình 3.4. Baøo töû cuûa chuûng CK2……………………………………………………………………………………….48

Hình 3.5. Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2……………………………………………………………..60

Ñoà thò 3.1. So saùnh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK…………………………………………………….45

Ñoà thò 3.2. AÛnh höôûng caùc loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase………………………………..51

Ñoà thò 3.3. Ñoäng hoïc quaù trình nuoâi caáy B. subtilis CK2 sinh α-amylase…….…….61

Bieåu ñoà 3.1. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK…………………………………….…….46

Bieåu ñoà 3.2. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase…………..………53

Bieåu ñoà 3.3. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase………………………………..….………54

Bieåu ñoà 3.4. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase…………………………….…….…55

Bieåu ñoà 3.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase………………….….……..56

Bieåu ñoà 3.6. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl ñeán hoaït ñoä amylase………………………..57

Bieåu ñoà 3.7. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït tính amylase…………………………….58

Bieåu ñoà 3.8. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng…………………………………….……59

Bieåu ñoà 3.9. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase bôûi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau……….62

Bieåu ñoà 3.10. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase khi duøng caùc taùc nhaân tuûa…………….….…63

Bieåu ñoà 3.11. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase…………………………………………………………………………64

Bieåu ñoà 3.12. Ñoä beàn pH cuûa amylase………………………….…………………………………………………66

MUÏC LUÏC

Trang

Trang phuï bìa

Lôøi caùm ôn

Muïc luïc

Caùc chöõ vieát taét trong luaän vaên

Danh muïc caùc baûng

Danh muïc caùc hình veõ, ñoà thò vaø bieåu ñoà

Môû ñaàu……………………..…………………………………………………………………………………………………….……………1

Chöông 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU…………………………………………………………….……………….4

1.1. Giống vi khuaån Bacillus ………………………………………………………………………………….……………..4

1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym ………………………………………………………………………….………………..8

1.2.1. Enzym caûm öùng. ………………………………………………………………………….………………….………9

1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym. ……………………………………………………………….….………9

1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym……………………………………………………….………….……….10

1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym……………………………………………………….………….………11

1.2.5. Caáu truùc enzym. ……………………………………………………………….….……………………………….11

1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym…………………………………………….…………….……….…………11

1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym……………………………..12

1.3. Heä enzym amylase………………………………………………………………………….………………………………15

1.3.1. Giôùi thieäu enzym α – amylase. ……………………………………………………………………….15

1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase……………………………………………………………………….18

1.3.3 Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh toång hôïp amylase cuûa VSV……….…19

1.3.4. Taùch chieát enzym töø caùc nguoàn nguyeân lieäu…………………….……………………….22

1.3.5 ÖÙng duïng cuûa amylase trong thöïc teá saûn xuaát vaø ñôøi soáng …………….……23

Chương II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU……………………….27

2.1 Vaät lieäu……………………………………………………………………………………………………………………………….27

2.2. Caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng.………………………………………………………………………………28

2.3. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu………………………………………………………………………………….28

2.3.1. Phöông phaùp phaân laäp caùc chuûng Bacillus töø ñaát vöôøn qua coû khoâ….28

2.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng caáy chuyeàn……………………………………….….………………...29

2.3.3. Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa Bacillus…….29

2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh söï sinh tröôûng theo maät ñoä quang……………………..32

2.3.5. Phöông phaùp nghieân cöùu khaû naêng phaân huyû tinh boät……………………………32

2.3.6. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä α- amylase theo Heinkel, 1956………….33

2.3.7. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy………………….35

2.3.8. Phöông phaùp phaân loaïi ñeå xaùc ñònh loaøi ……………………………………….….……….37

2.3.9. Phöông phaùp nghieân cöùu ñoäng hoïc……………………………………….….………………….38

2.3.10. Phöông phaùp thu nhaän dòch chieát enzym amylase töø moâi tröôøng…….39

2.3.11. Phöông phaùp thu nhaän CPE α – amylase……………………………………………………39

2.3.12. Xaùc ñònh hoaït ñoä CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa……………41

2.3.13. Xaùc ñònh ñoä beàn cuûa CPE amylase……………………………………….….…………………41

2.3.14. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu thöïc nghieäm……………………………………….……………42

CHƯƠNG III: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN………………………………………………………..46

3.1. Phaân laäp, tuyeån choïn caùc chuûng coù hoaït tính amylase cao…………………..….44

3.2. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK……………..…45

3.3. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2…………………………………………………..……47

3.4. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän sinh toång hôïp amylase…………….……………………………49

3.4.1. Loaïi cô chaát …………………………………………………………………………………………………………..49

3.4.2. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan………………………………………………………………………52

3.4.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä …………………………………………………………………………………..53

3.4.4. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu.……………………………………….…………………………………….54

3.4.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí……………………………………………………………………………….55

3.4.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái……………………………………………………………………………56

3.4.7. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng………………………………………………..59

3.5. Xaùc ñònh teân cuûa chuûng CK2 ñaõ tuyeån choïn……………………………………………………60

3.6. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men…………………………………………………..60

3.7. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy, xaùc ñònh hoaït ñoä vaø ñoä beàn cuûa enzym…62

3.7.1. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy vôùi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau…………….62

3.7.2. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa…………………….63

3.7.3. Xaùc ñònh ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase…………………………………………..……….64

3.7.4. Xaùc ñònh ñoä beàn pH cuûa CPE amylase……………………………………………………..…65

Chương IV: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ……………………………………………………….…..67

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO…………………………………………………………………………………………….…..69

PHUÏ LUÏC…………………………………………………………………………………………………………………………………73