Nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư ở bệnh nhân ung thư vú tại Bệnh viện K

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết đánh giá hiện tượng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư bao gồm BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A; đồng thời chỉ ra mối tương quan của dấu ấn methyl hóa với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư vú tại Bệnh viện K.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư ở bệnh nhân ung thư vú tại Bệnh viện K

GIẢI PHẪU BỆNH - SINH HỌC PHÂN TỬ NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ TẠI BỆNH VIỆN K NGUYỄN NGỌC QUANG1, VƯƠNG DIỆU LINH2, TRƯƠNG VĂN LONG3, TẠ VĂN TỜ4 TÓM TẮT Ung thư vú là loại ung thư phổ biến ở phụ nữ, gây ra do nhiều yếu tố khác nhau như tiền sử gia đình (đột biến các gen BRCA1, BRCA2), chế độ dinh dưỡng, tuổi tác và những biến đổi của di truyền ngoại gen, trong đó methyl hóa các đảo CpG với sự bất hoạt của các gen đóng vai trò rất quan trọng. Do đó, methyl hóa DNA trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư vú. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá hiện tượng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư bao gồm BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A; đồng thời chỉ ra mối tương quan của dấu ấn methyl hóa với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ung thư vú tại Bệnh viện K. Kết quả nghiên cứu mô tả cắt ngang 82 mẫu bệnh nhân UTV thể ống xâm nhập cho thấy 57/82 (69.5%), 44/82 (53.7%), 38/82 (46.3%), 29/82 (35.4%) và 47/82 (57.3%) trường hợp lần lượt bị methyl hóa BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A. Methyl hóa RASSF1A thể hiện mối tương quan với bệnh nhân trẻ tuổi, p
GIẢI PHẪU BỆNH - SINH HỌC PHÂN TỬ Di truyền ngoại gen bao gồm methyl hóa DNA, ống xâm nhập được chẩn đoán giải phẫu bệnh bằng biến đổi protein Histon và miRNA là một trong những phương pháp nhuộm Hematoxilin và Eosin (H&E). thay đổi phân tử phổ biến có sự liên quan mật thiết Bệnh phẩm được thu thập tại Trung tâm Giải phẫu đến sự hình thành tế bào ác tính và phát triển khối bệnh và Sinh học phân tử, Bệnh viện K trong giai u[3]. Thay đổi mức độ methyl hóa DNA tham gia kiểm đoạn 2018 - 2019. Thông tin bệnh nhân và giai đoạn soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen. Thực tế bệnh được ghi nhận tại các khoa lâm sàng, Bệnh cho thấy rất nhiều bệnh ung thư khác nhau có liên viện K. hệ với thay đổi mức độ methyl hóa promoter của các Tách chiết DNA tổng số gen ức chế khối u, làm bất hoạt các gen này. Ngoài ra, mức độ methyl hóa bất thường còn là dấu hiệu Bệnh phẩm UTV thể ống xâm nhập đúc trong tiên lượng bệnh tái phát hoặc di căn. Hoạt động của paraffin được cắt lát với độ dày 10µm. Mỗi mẫu gồm những gen liên quan đến tính nhạy cảm với hóa trị, 5 - 10 lát tùy vào độ lớn của mẫu được cho vào các xạ trị có thể bị thay đổi bởi sự methyl hay khử methyl ống eppendort 1.5ml. DNA từ mẫu đúc paraffin được dẫn đến tính kháng[2]. Do đó mức độ methyl hóa trên tiến hành tách chiết bằng bộ kit QIAmp DNA FFPE DNA trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng Tissue Kit (Qiagen) theo hướng dẫn cụ thể của hãng trong tiên lượng và chẩn đoán ung thư. sản xuất. Ung thư vú phát triển do các gen gây ung thư Xử lý bisulfite bị hoạt hóa hoặc do các gen ức chế khối u bị bất Xử lý bisulfite là chuỗi phản ứng hóa học của hoạt. Ở tế bào ung thư vú, methyl hóa DNA được sodium bisulfite xảy ra trên sợi đơn DNA ở nhiệt độ quan sát thấy ở gen tham gia sửa chữa sai hỏng cao và pH thấp. Kết quả của quá trình xử lý bíulfite DNA (BRCA1- breast cancer susceptibility gene, sẽ biến Cytosine thành Uracil, trong khi giữ nguyên MGMT- O-6-methylguanine-DNA methyltransferase), các Cytosine bị methyl hóa. Những mẫu sử dụng kiểm soát tự chết theo chương trình (RASSF1A - trong nghiên cứu được xử lý bisulfite bằng kit Epitect Ras association domain family 1A gene), điều hòa Bisulfite kit (48) (Qiagen). chu kỳ tế bào (p16 - cyclin dependent kinase inhibitor 2A), gen có chức năng khử các độc tố gây Kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa (Methyl ung thư (GSTP1- π-class glutathione S-transferase specific PCR (MS-PCR)) xác định tình trạng gene), gen mã thụ thể hormon (ER- estrogen methyl hóa gen BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và receptor gene, PR- progesterone receptor RASSF1A gene)…[13]. Điều đặc biệt, methyl hóa DNA không chỉ Kỹ thuật MS-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện thấy trong các tế bào khối u mà còn có ở khuếch đại trình tự DNA sau khi xử lý bisulfite. Để các tế bào biểu mô xung quanh khối u, tuy nhiên tần xác định mức độ methyl hóa của một gen cần hai suất DNA bị methyl hóa phát hiện ở các tế bào liền cặp mồi đặc hiệu: (1) Cặp mồi khuếch đại trình tự kề khối u tăng cùng với tiến triển của khối u nguyên DNA không methyl hóa, (2) cặp mồi khuếch đại trình phát. Bởi vậy, việc nghiên cứu phát triển dấu chuẩn tự DNA bị methyl hóa. Các cặp mồi sử dụng trong methyl hóa DNA, đặc biệt kết hợp nhiều dấu chuẩn nghiên cứu được thiết kế theo phần mềm methyl ở vùng promoter của các gen với nhau được MethPrimer 2.0. xem là nhiệm vụ cần thiết và cấp bách cho ngành Xử lý số liệu sinh y hiện đại. Với mong muốn đánh giá được chính xác mức độ methyl ở các gen phổ biến liên Tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen BRCA1, quan đến ung thư vú ở bệnh nhân người Việt Nam; MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A; tương quan giữa từ đó xác định dấu chuẩn thích hợp với người Việt methyl hóa promoter BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 Nam, chúng tôi lựa chọn 1 nhóm gồm 5 gen: và RASSF1A với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A với mục sàng bệnh nhân UTV thể ống xâm nhập được phân đích: (1) Đánh giá tần suất methyl hóa gen BRCA1, tích bằng phần mềm thống kê SPSS 20.0. MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A trên bệnh nhân KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ung thư vú thể ống xâm nhập; (2) Đánh giá mối tương quan giữa methyl hóa gen BRCA1, MGMT, Đặc điểm bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm GSTP1, p16 và RASSF1A với các đặc điểm lâm Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân nghiên sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân. cứu là 50.5 tuổi, trong đó bệnh nhân trẻ tuổi nhất là NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 tuổi và lớn tuổi nhất là 74 tuổi. Bệnh nhân trên và dưới độ tuổi trung bình có tỷ lệ xấp xỉ 1:1. Trong Nguyên liệu tổng số 82 mẫu, 2 mẫu bệnh phẩm thu thập có độ Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô học I, 43 mẫu độ II và 37 mẫu bệnh phẩm có độ mô tả cắt ngang trên 82 mẫu bệnh phẩm UTV thể III (Bảng 1). Bệnh nhân nghiên cứu có di căn hạch lympho là 37/82 trường hợp (45.1%). TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 181
GIẢI PHẪU BỆNH - SINH HỌC PHÂN TỬ Kết quả methyl hóa BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 76.9%, trong khi ở nhóm tuổi trên trung bình chỉ và RASSF1A trên bệnh nhân UTV thể ống xâm 39.5%. Như vậy, methyl hóa RASSF1A có xu hướng nhập xảy ra ở bệnh nhân trẻ tuổi. Trong khi đó, methyl RASSF1A và các yếu tố độ mô học và tình trạng DNA sau khi tách chiết được tiến hành xử lý di căn hạch lympho không cho thấy sự khác biệt (p > bisulfite theo hướng dẫn của Epitech Bisulfite Kit 0.05). (Qiagen). Chất lượng DNA trước và sau khi xử lý bisulfite được đánh giá qua phản ứng PCR khuếch Tiếp đó, chúng tôi phân tích mối tương quan đại gen đơn bản β-globin (kết quả không hiển thị). giữa methyl hóa các gen còn lại trong nghiên cứu DNA đạt chất lượng được dùng để phân tích methyl với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh hóa. Phản ứng MS-PCR phát hiện methyl hóa nhân UTV thể ống xâm nhập. Kết quả cho thấy methyl hóa BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và methyl hóa BRCA1, GSTP1 và p16 có sự khác biệt RASSF1A sử dụng các cặp mồi được thiết kế đặc có ý nghĩa với độ mô học và tình trạng di căn hạch hiệu cho trình tự DNA methyl hóa và DNA không lympho của khối u, với p < 0.05. Methyl hóa BRCA1, methyl hóa. Kết quả nghiên cứu 82 mẫu UTV thể GSTP1 và p16 có tỷ lệ tăng dần cùng sự tiến triển ống xâm nhập cho thấy tần suất methyl hóa gen độ mô học. Cụ thể, tần suất methyl hóa BRCA1, BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A lần lượt GSTP1 và p16 trên nhóm bệnh nhân UTV thể ống là 69.5%, 53.7%, 46.3%, 35.4% và 57.3% mẫu ung xâm nhập độ I, II và III lần lượt là 1/2 (50.0%), thư có sự methyl hóa (57/82, 44/82, 38/82, 29/82 và 24/43(55.8%), 32/37 (86.5%); 0/2 (0%), 12/43 47/82) (Bảng 1). Đặc biệt, 76/82 (92.7%) trường hợp (27.9%), 26/37 (70.3%); 0/2 (0%), 14/43 (32.6%), bị methyl hóa ít nhất 1 trong 4 gen ức chế khối u 15/37 (40.5%). Bên cạnh đó, methyl hóa BRCA1, nghiên cứu. GSTP1 và p16 có tương quan thuận với tình trạng di căn hạch lympho. Methyl hóa BRCA1, GSTP1 và Đánh giá tương quan giữa methyl hóa gen p16 ở bệnh nhân di căn hạch lympho cao hơn so với BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A với các trường hợp không di căn hạch (83.8% so với 57.8%; đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng 81.1% so với 17.8%; 48.6% so với 24.4 với p0.05 (Bảng 1). mối liên hệ chặt chẽ (p 50 ≤ 50 I II III Có Không me 57 (69.5) 29 28 0.669 1 24 32 0.01 31 26 0.01 BRCA1 un 25 (30.5) 14 11 1 19 5 6 19 me 38 (46.3) 23 15 0.173 0 12 26 1E-07 30 8 1E-05 GSTP1 un 44 (53.7) 20 24 2 31 11 7 37 me 29 (35.4) 13 16 0.307 0 14 15 0.023 18 11 0.02 p16 un 53 (64.6) 30 23 2 29 22 19 34 me 44 (53.7) 27 17 0.103 1 17 26 0.433 22 22 0.339 MGMT un 38 (46.3) 16 21 1 26 11 15 23 me 47 (57.3) 17 30
GIẢI PHẪU BỆNH - SINH HỌC PHÂN TỬ chỉ rõ sai lệch chỉ một nucleotide hoặc mất đoạn, GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi-1) là một thêm đoạn hay đảo đoạn DNA... đều có thể là yếu tố gen khử độc tố, mã hóa cho enzym Glutathione quyết định tính trạng mới cũng như là nguyên nhân S - transferase P, tham gia xúc tác cho các phản của ung thư. Bên cạnh thông tin di truyền, di truyền ứng oxi hóa khử xảy ra trong tế bào bằng cách kết ngoại gen qui định bởi cách thức methyl hóa DNA hợp Glutathione (GSH) với các phức hợp là các tác và biến đổi Histon, miRNA cũng có vai trò đặc biệt nhân gây ung thư, từ đó điều hòa quá trình tăng sinh quan trọng[3]. Trong đó, thay đổi mức độ methyl hóa tế bào và chết theo chương trình. Tần suất methyl DNA là một trong những biến đổi di truyền ngoại gen hóa GSTP1 ở UTV đã được công bố trong các báo tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của cáo từ 13 - 30%, có thể lên đến 50%[4]. Phân tích gen. Thực tế cho thấy biểu hiện lâm sàng của nhiều liên hệ với các yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng, bệnh thần kinh, thiểu năng trí tuệ, đặc biệt là các nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra methyl hóa GSTP1 bệnh ung thư khác nhau có liên quan mật thiết đến có tương quan chặt chẽ với đặc điểm độ mô học và thay đổi mức độ methyl hóa ở vùng promoter. Do đó tình trạng di căn hạch lympho của khối u, phù hợp mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn với công bố của Lasabova Z. và cs. (2010) trên bệnh phân tử đầy tiềm năng trong tiên lượng một số bệnh nhân UTV người Châu Âu[4]. di truyền nói chung và trong chẩn đoán ung thư nói p16 (p16INK4A) là một đích phổ biến trong phát riêng[8]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành sinh ung thư ở người. p16 mất chức năng do methyl phân tích tình trạng methyl hóa gen BRCA1, MGMT, hóa DNA dẫn đến giảm hoặc không bộc lộ protein GSTP1, p16 và RASSF1A trên 82 bệnh nhân UTV p16 được quan sát trong nhiều loại ung thư, trong đó thể ống xâm nhập. Kết quả cho thấy 57/82 (69.5%), có UTV[13]. Phân tích 82 mẫu bệnh phẩm UTV thể 44/82 (53.7%), 38/82 (46.3%), 29/82 (35.4%) và ống xâm nhập, tỷ lệ methyl hóa p16 là 29/82 trường 47/82 (57.3%) trường hợp lần lượt bị methyl hóa hợp, đạt 35.4%; tương đồng với báo cáo của BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A. Mohammad R. và cs. (2009) trên người Ấn Độ, và BRCA1 là gen ức chế khổi u có vai trò quan khác biệt so với nghiên cứu của Li S. và cs. (2006) trọng trong bệnh sinh ung thư vú, tham gia điều hòa và Tao M.H. và cs. (2009) trên người Trung Quốc [10]. hoạt hóa phiên mã, sửa chữa sai hỏng DNA, kiểm Tương tự BRCA1 và GSTP1, chúng tôi nhận thấy soát chu kỳ tế bào, quá trình chết theo chương trình methyl hóa p16 có mối liên hệ có ý nghĩa với độ mô và ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể[13]. Tỷ lệ methyl học và tình trạng di căn hạch lymho của khối u. hóa BRCA1 trên bệnh nhân UTV ở Châu Á nằm Tuy nhiên, Mohammad R. và cs. (2009) chi ra methyl trong khoảng 30 - 90%[7]. Phân tích tổng hợp các hóa p16 là hoàn toàn ngẫu nhiên với các đặc điểm nghiên cứu khẳng định methyl hóa BRCA1 có ý của bệnh nhân[10]. Điều này gợi ý rằng p16 có thể có nghĩa tiên lượng bệnh, liên quan đến khả năng sống vai trò quan trọng trong khởi đầu và tiến triển ung sót kém của bệnh nhân UTV[14]. Trong nghiên cứu thư, tham gia vào quá trình chuyển đổi từ tế bào này, chúng tôi đưa ra tần suất methyl hóa BRCA1 bình thường sang dạng bất thường. trên bệnh nhân UTV thể ống xâm nhập người Việt RASSF1A là protein quan trọng trong điều Nam là 69.5%. Bên cạnh đó, phân tích cũng chỉ ra khiển quá trình chết theo chương trình của tế bào. mối liên hệ có ý nghĩa giữa methyl hóa BRCA1 với RASSF1A được biểu hiện trong các tế bào vú bình độ mô học và tình trạng di căn hạch lympho. Cụ thể, thường trong khi bị bất hoạt trong các khối u vú do bệnh nhân có độ mô học càng cao và có di căn hạch quá trình methyl hóa DNA đảo CpG với tần suất có lympho thì tỷ lệ methyl hóa BRCA1 càng tăng. Kết thể lên đến 60%, tùy thuộc vào yếu tố chủng tộc, quả hoàn toàn phù hợp với các báo cáo đã được vùng địa lý và các bệnh nhân UTV người Châu Á công bố cho rằng methyl hóa BRCA1 gắn liền với sự thường có xu hướng bị methyl hóa RASSF1A cao tiến triển bệnh. hơn các chủng tộc khác[5]. Tần suất methyl hóa MGMT tham gia vào quá trình sữa chữa DNA bị RASSF1A ở bệnh nhân UTV thể ống xâm nhập alkyl hóa. Methyl MGMT trong UTV ở các nghiên người Việt Nam trong nghiên cứu này là 47/82 cứu khác nhau ở Châu Á từ 10 - 60%[1]. Phân tích trường hợp, đạt 57.3%; thấp hơn nghiên cứu của 82 bệnh phẩm UTV thể ống xâm nhập, chúng tôi Hagrass H.A. và cs. (2014) và Richter A.M. và cs. nhận thấy 44/82 (53.7%) trường hợp có methyl hóa (2016); cao hơn báo cáo của Hoque M.O. và cs. MGMT, tương đương với báo cáo ở người Ấn Độ (2006) và Kim J.H. và cs. (2010)[5,11]. Đặc biệt, (năm 2015) và cao hơn so với người Trung Quốc nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra methyl hóa (năm 2016) hay người Nhật Bản (năm 2013)[1]. RASSF1A và yếu tố độ tuổi có tương quan có ý Methyl hóa MGMT là ngẫu nhiên với yếu tố: độ tuổi, nghĩa, khác biệt so với báo cáo tổng hợp của Li M. độ mô học và tình trạng di căn hạch lympho và cs. (2019) cho thấy methyl hóa RASSF1A có mối (p > 0.05), tương đồng so với các nghiên cứu đã liên hệ chặt chẽ với UTV có độ mô học cao và có di được công bố[1]. căn hạch lympho. TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 183
GIẢI PHẪU BỆNH - SINH HỌC PHÂN TỬ Methyl hóa DNA là một trong các cơ chế điều Associated With Rates of False-Positive and hòa gen. Methyl hóa bất thường liên kết với phát False-Negative Results From Digital sinh ung thư. Tìm hiểu mối liên hệ giữa methyl hóa Mammography Screening: An Analysis of DNA với các yếu tố liên quan là đánh giá có ý nghĩa Registry Data. Ann Intern Med., 164, 226 - 235. trong lâm sàng. Đánh giá methyl hóa các gen 7. Nindrea, R.D., Harahap, W.A., Aryandono, T., BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và RASSF1A trong and Lazuardi, L., (2018), Association of BRCA1 UTV thể ống xâm nhập gợi ý rằng methyl hóa các Promoter Methylation with Breast Cancer in gen này thể hiện mức độ ác tính của khối u cũng Asia: A Meta - Analysis. Asian Pac J Cancer như tiên lượng tiến triển bệnh cho bệnh nhân. Ngoài Prev, 19, 885 - 889. ra, dấu chuẩn methyl hóa DNA xuất hiện sớm trong quá trình phát sinh bệnh thư, có thể được xem như 8. Qureshi, S.A., Bashir, M.U., and Yaqinuddin, A., một công cụ cho sàng lọc ung thư nói chung và ung (2010), Utility of DNA methylation markers for thư vú thể ống xâm nhập nói riêng. diagnosing cancer. International Journal of Surgery, 8, 194 - 198. KẾT LUẬN 9. Radpour, R., Barekati, Z., Kohler, C., Lv, Q., Qua phân tích 82 mẫu UTV thể ống xâm nhập Bürki, N., Diesch, C., Bitzer, J., Zheng, H., tại Bệnh viện K, chúng tôi thu được kết quả như sau: Schmid, S., and Zhong, X.Y., (2011), 57/82 (69.5%), 44/82 (53.7%), 38/82 (46.3%), 29/82 Hypermethylation of tumor suppressor genes (35.4%) và 47/82 (57.3%) trường hợp lần lượt bị involved in critical regulatory pathways for methyl hóa BRCA1, MGMT, GSTP1, p16 và developing a blood-based test in breast cancer. RASSF1A. Methyl hóa RASSF1A thể hiện mối PLoS One., 6, e16080. tương quan với độ tuổi bệnh nhân (p