Nghiên cứu tính tương hợp sinh học của keo HA/PVPA trên mô hình chuột

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÍNH TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA KEO HA/PVPA<br /> TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT<br /> Hồ Văn Hai*, Nguyễn Thị Hiệp*, Lê Quốc Tuấn**, Nguyễn Thị Lệ**, Bùi Chí Bảo**, Võ Văn Tới*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Kiểm tra tính tương hợp sinh học của keo sinh học được tổng hợp từ Hyaluronan (HA) và<br /> polyvinyl phosphonic acid (PVPA).<br /> Phương pháp: Bằng phương pháp este hóa keo HA/PVPA được tạo ra theo nhiều nồng độ khác nhau, sau đó<br /> keo được làm khô phương pháp đông khô lạnh. Keo được gia công thành hình tròn đường kính 1cm và độ dày<br /> 1mm. Mẫu keo sau khi tạo hình được cấy lên trên lưng chuột sau đó khả năng làm lành vết thương được quan sát<br /> bằng dữ liệu bằng hình ảnh vết thương qua từng ngày (cho đến ngày thứ 14 sau khi cấy mẫu). Khu vực da được<br /> cấy vật liệu sẽ được tách ra khỏi vật chủ sau 14 ngày và sử dụng phương pháp cắt lát và nhuộm H&E để xác định<br /> mức độ phát triển của mô bên trong khu vực đã được xử lý bằng keo.<br /> Kết quả: Kết quả cho thấy keo có khả năng kết dính và hỗ trợ hồi phục vết thương cao ngay tuần đầu tiên.<br /> Ngoài ra, kết quả nhuộm H&E cho thấy có mạch máu phát triển và mô mới hình thành. Tuy nhiên, tế bào phát<br /> triển tập trung dày ở khu vực được cấy mẫu và cấu trúc mô chưa ổn định. Có thể kết luận rằng, keo tính tương<br /> hợp sinh học cao.<br /> Kết luận: Kết quả từ những thí nghiệm trên đã chỉ ra rằng vật liệu nền tạo ra từ keo HA/PVPA có khả năng<br /> hỗ trợ hồi phục vết thương và có độ tương hợp sinh học cao, thích hợp cho tế bào phát triển khi sử dụng cho vết<br /> thương trên da.<br /> Từ khóa: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA).<br /> ABSTRACT<br /> IN-VIVO STUDIES OF HA/PVPA GEL USING MICE MODEL<br /> Ho Van Hai, Nguyen Thi Hiep, Le Quoc Tuan, Nguyen Thi Le, Bui Chi Bao, Vo Van Toi<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 53 - 58<br /> <br /> Objective: To investigate the biocompatibility of hyaluronan (HA) and polyvinyl phosphonic acid (PVPA)<br /> hydrogel.<br /> Method: HA/PVPA was fabricated by cross-linking between HA with PVPA in various PVPA<br /> concentration, then the gel was hydrated by using freeze-drying method in order to make scaffolds. Scaffolds were<br /> shaping by surgery blade with 1cm diameter and 1mm thickness. Scaffolds were implanted on mouse dorsal and<br /> monitored for 14 day. The implanted zoneswere extracted after implanting 14 days and stained by H&E staining<br /> method to observe tissue formation.<br /> Result: The results showed that scaffolds were adhesive with skin wound and accelerate the wound healing<br /> process. H&E staining results showed that scaffolds were excellent biocompatible materials and provided a matrix<br /> for cell regeneration.<br /> Conclusion: HA/PVPA hydrogel can be used as bioglue because it’s adhesive properties and excellent<br /> biocompatibility.<br /> Key words: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA).<br /> <br /> <br /> * Đại Học Quốc Tế - Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược TP.HCM<br /> Địa chỉ liên hệ : TS. Nguyễn Thị Hiệp ĐT: 0983888700 Email: nthiep@hcmiu.edu.vn<br /> Khoa học Cơ bản 53<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ hyaluronan chiếm thành phần cao. Do đó, HA là<br /> 1 polyme nhiều tiềm năng với những tính chất<br /> Cho đến thời điểm hiện tại, nhu cầu y tế đối thích hợp để tái tạo mô mềm, đặc biệt là tái tạo<br /> với các loại vật liệu và thuốc để chữa trị các bệnh da(6).<br /> mãn tính gây tổn thương sâu hoặc khiếm khuyết<br /> Polyvinyl phosphonic axit (PVPA) là 1<br /> da, các tai nạn gây tổn thương sâu cho da như<br /> phosphonate tổng hợp thường được dùng trong<br /> bỏng nhiệt, bỏng hóa chất, mất da do tai nạn<br /> tái tạo xương. Trong nghiên cứu này, PVPA đã<br /> hoặc do lấy da để cấy ghép cho các phần khác,<br /> được kết hợp với HA nhằm tạo ra keo HA-<br /> đang rất cao(1,2). Hiện đã có nhiều biện pháp để<br /> PVPA có tương hợp sinh học cao và có lỗ xốp<br /> chữa trị cho những tổn thương đã kể ra ở trên ví<br /> rộng cho phép tế bào di chuyển vào và phát triển<br /> dụ như: cấy ghép da từ những bộ phận khác, tế<br /> trên chúng(7). Quá trình tạo keo cũng như các<br /> bào gốc, thuốc mỡ trị bỏng… Tuy nhiên những<br /> tính chất tương hợp tế bào đã được nghiên cứu<br /> biện pháp trên vẫn còn tồn tại nhiều điểm hạn<br /> trong một nghiên cứu trước đây của chúng tôi.<br /> chế như sự hạn hẹp của da ở nguồn bộ phận lấy<br /> Trong bài này, chúng tôi sẽ khảo sát khả năng<br /> da để cấy ghép và dễ bị đào thải hoặc hoại tử, tế<br /> tương thích keo HA-PVPA trên mô hình chuột.<br /> bào gốc thường không ổn định và chi phí cao do<br /> khó bảo quản và qui trình chiết tách phức ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> tạp….Do đó, nhu cầu đối với 1 loại vật liệu sinh Đối tượng nghiên cứu<br /> học có đầy đủ những ưu điểm cần thiết và dễ sử Nghiên cứu tính tương hợp sinh học của keo<br /> dụng, tính tương hợp sinh học cao là rất cao(3). sinh học HA/PVPA trên mô hình da chuột. Vì<br /> Polymer sinh học nguồn tự nhiên hoặc tổng hợp muốn xem tính chất tương hợp của hỗn hợp keo<br /> là 1 lĩnh vực nghiên cứu nhiều hứa hẹn để có thể cho nên keo dùng trong thí nghiệm này là keo đã<br /> thỏa mãn tất cả những yêu cầu y tế ở trên đối với được lấy nước hoàn toàn bằng phương pháp<br /> chữa trị tổn thương da, thậm chí còn có thể tốt đông khô.<br /> hơn mong đợi. Do đó 1 loại keo sinh học đã được<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> tạo ra từ Hyaluronan (HA) và polyvinyl<br /> phosphonic axit (PVPA) với tính cơ lí, tương hợp Keo sinh học được tạo ra bằng cách trộn đều<br /> sinh học, hỗ trợ cho sự phát triển tế bào đã được dung dịch HA 0,1% với PVPA 30% sau đó trung<br /> tạo ra nhằm ứng dụng để chữa trị những tổn hòa tính acid của hỗn hợp keo sinh học bằng<br /> thương trên da, kết dính tốt với khu vực tổn NaOH, chuẩn độ sao cho pH của keo vào<br /> thương và tạo thành 1 lớp bảo vệ ngăn cách bụi khoảng 7,0-7,04 nhằm tạo môi trường trung tính,<br /> bẩn/vi khuẩn tiếp xúc với vết thương và 1 mặt không gây độc cho tế bào. Trong thí nghiệm này,<br /> hỗ trợ cho tế bào mới phát triển và làm lành vết có 5 mẫu đợc tạo ra bằng cách thay đổi nồng độ<br /> thương nhan(4). PVPA. Cụ thể hơn như thể tích của PVPA 30%<br /> được tăng dần từ 10, 20, 30, 40, 50µL vào từng<br /> Hyaluronan có chứa glycosaminoglycan<br /> ống nghiệm có chứa 0,1 mL HA 0,1%. Các ống<br /> (GAG) và glucuronic axit là các thành phần<br /> nghiệm có chứa keo sinh học sau đó được chuẩn<br /> chính của tổ hợp ma trận ngoại bào có trong liên<br /> độ để điều chỉnh pH về mức 7-7,04 bằng NaOH<br /> kết của hầu hết biểu mô, các mô thần kinh. HA<br /> 0,1 M. Các ống nghiệm chứa mẫu sau đó được<br /> là nonsulfated glycosaminoglycans duy nhất<br /> đánh số từ 1-5 tương ứng với từng tỉ lệ nồng độ<br /> được hình thành ở màng tế bào thay vì Golgi,<br /> PVPA (Xem bảng 1).<br /> với khối lượng phân tử rất lớn. Là một trong<br /> những thành phần chính của ma trận ngoại bào, Những ống nghiệm chứa mẫu keo sinh học<br /> hyaluronan góp phần đáng kể vào sự chuyển sau đó được cho vào máy đông khô nhằm loại<br /> dời tế bào và tăng sinh tế bào(5). Trong da, bỏ tất cả các phân tử nước có trong keo trước khi<br /> tiến hành cấy trên da chuột. Hình 1 là hình ảnh<br /> <br /> <br /> 54 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> keo sau 48 giờ xử lí bằng phương pháp đông thế bằng mẫu keo. Quá trình vết thương lành<br /> khô. Keo dạng khô có dạng trụ tròn xốp có được theo dõi từng ngày cho tới ngày thứ 14.<br /> đường kính 1cm. Các hình trụ này sẽ được cắt Bảng 1: Tỉ lệ nồng độ của từng mẫu keo sinh học và<br /> thành khoanh tròn có độ dày 2 mm cho quá trình độ pH tương ứng của các mẫu.<br /> cấy mẫu lên động vật. Mẫu HA 1%(mL) PVPA 30% NaOH 2M pH<br /> 15 con chuột bạch (20-26 g) dùng trong thí (mL) (uL)<br /> nghiệm được mua về từ viện Pasteur sẽ được 1 0,1 0,01 15 6,5<br /> nuôi 1 tuần trước khi phân thành 5 nhóm dùng 2 0,1 0,02 35 6,5-7<br /> trong thí nghiệm. Lông chuột ở khu vực lưng 3 0,1 0,03 50 7<br /> được làm sạch, sau đó 1 vết thương hình tròn<br /> 4 0,1 0,04 60 7<br /> đường kính 1cm tương đương được tạo ra bằng<br /> 5 0,1 0,05 70 7<br /> dao mổ. Vùng khuyết do bị cắt da sẽ được thay<br /> <br /> A B C<br /> 1cm 1cm<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: A) Hình dạng mẫu keo khô, B) vết thương nhân tạo trên lưng chuột, C) vết thương được cấy mẫu.<br /> Mẫu da quanh khu vực được cấy mẫu sẽ dính tốt vào mô, trong khi mẫu 5 dính vào vết<br /> được cắt ra khỏi cơ thể chuột và xử lí phọc-môn thương là nhờ vào lỗ xốp rộng, đủ để hút thấm<br /> trước khi nhuộm H&E để quan sát sự phát triển máu và dính vào vết thương.<br /> của tế bào bên trong mẫu. Độ hồi phục của vết thương cho đến ngày<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN thứ 7 sau khi cấy mẫu<br /> Qua kết quả quan sát các vết thương cho<br /> Độ kết dính của mẫu và vết thương ngay<br /> thấy ngay ngày thứ nhất và thứ hai sau khi cấy<br /> sau khi cấy mẫu không có hiện tượng loại thải xảy ra, không<br /> Nhằm khảo sát khả năng bám dính mô, keo gây kích ứng và không quan sát thấy ửng đỏ<br /> khô được phủ lên vết thương. Theo như kết quả xung quanh vết thương.<br /> thu được sau thí nghiệm cấy mẫu lên vết<br /> Qua quan sát nhóm vết thương không qua<br /> thương, chỉ có mẫu số 2 và số 5 dính tốt với toàn<br /> xử lí bằng keo cho thấy, cho đến ngày thứ 7 sau<br /> bộ khu vực vết thương, mẫu số 0 và mẫu số 1 bị<br /> khi cấy, vết thương vẫn chưa ổn định dễ bị rách.<br /> vỡ và rã thành những mảnh nhỏ nên không bám<br /> Với nhóm chuột có vết thương được xử lí với<br /> dính lên trên khu vực vết thương. Mẫu số 3 và số<br /> keo sinh học mẫu số 2 và số 5 cho thấy vết<br /> 4 có độ chắc và cứng nhưng không đủ độ dẻo để<br /> thương khô nhanh và không còn chảy nước hay<br /> kết dính hoàn toàn với vết thương nên đã bị rơi<br /> máu sau ngày thứ 2 sau khi cấy, vết thương thu<br /> ra ngay sau khi cấy. Việc bám dính tốt của mẫu 2<br /> hẹp nhanh hơn khi so sánh với vết thương chưa<br /> và mẫu 5 có thể giải thích rằng: mẫu 2 là mẫu tốt<br /> qua xử lí bằng keo. Từ ngày thứ 3 trở đi vết<br /> nhất, có phản ứng vừa đủ giúp cho mẫu bám<br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 55<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> thương khô và không có hiện tượng viêm hay mẫu keo số 2 và số 5 đã lành, khu vực xung<br /> mưng mủ, mẫu keo được cấy đã liên kết chắc quanh vết thương được cấy mẫu mọc nhiều lông<br /> chắn và tạo thành lớp vỏ bọc ngăn cách tốt vết và gần như có hình thái bình thường so với<br /> thương với bụi bẩn và môi trường bên ngoài. trước khi cạo để tạo vết thương.<br /> Cho đến ngày thứ 7, vết thương được xử lí với<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh của vết thương ngay sau khi cấy, và được quan sát sau các ngày thứ 2,3,4 và ngày thứ 7 với<br /> các mẫu không xử lý bằng keo và các mẫu có xử lý bằng keo.<br /> Quan sát tiêu bản bố đồng đều. Vùng da xung quang vết thương<br /> đã hình thành lại lỗ chân lông và phân lớp các<br /> Qua quan sát tiêu bảng mẫu da được xử lí<br /> mô hoàn chỉnh.<br /> với mẫu keo số 2 cho thấy, tế bào đã di chuyển<br /> và hình thành một lớp mô mới bù vào lớp da đã Tiêu bản mang mẫu keo số 5 cho kết quả<br /> bị cắt đi, hình ảnh cho thấy: mô xung quanh vết quan sát bằng kính hiển vi gần như tương đồng<br /> thương liên kết tốt với mô mới hình thành trong với mẫu số 2 nhưng mạch máu bên trong khu<br /> vết thương, quan sát kỹ cho thấy có mạch máu vực xử lí bằng keo phát triển mạnh hơn và mật<br /> nhỏ xung quanh khu vực cấy mẫu, các mô đã tái độ tế bào tập trung nhiều hơn. Tuy nhiên, nhìn<br /> tạo có hình thái tương đối hoàn chỉnh. Tuy chung thì mô mới hình thành trong mẫu số 5<br /> nhiên, khu vực cấy mẫu cho thấy mô chưa tái chưa hoàn thiện bằng mẫu số 2.<br /> tạohoàn chỉnh, tế bào tập trung dày đặc và phân<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 56 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> A<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 500µm<br /> <br /> <br /> <br /> B<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 500µm<br /> <br /> Hình 3: Sự phát triển của tế bào bên trong vết thương đã được xử lí bằng keo số 2(A), và keo số 5(B).<br /> KẾT LUẬN tính chất trên, keo số 2 thích hợp để ứng dụng<br /> cho chữa trị vết thương trên da và kích thích vết<br /> Nhằm tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất của các chất thương da phục hồi nhanh.<br /> tham gia trong keo HA/PVPA căn cứ vào kết<br /> quả khảo sát tính tương hợp sinh học trên mô TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Burdick JA and Prestwich GD (2011). Hyaluronic acid hydrogels for<br /> hình chuột, chúng tôi đã cấy các mẫu này trên biomedical applications. Advanced Materials, 23, H41-H56.<br /> cùng một loại chuột với cùng kích thước. Kết quả 2. Nguyen DT, Orgill DP, Murphy GF (2009). Chapter 4: The<br /> Pathophysiologic Basis for Wound Healing and Cutaneous<br /> cho thấy keo số 2 là keo tốt nhất, có thể ứng<br /> Regeneration. Biomaterials For Treating Skin Loss, p. 32.<br /> dụng điều trị vết thương da vì keo có tính bám 3. Nguyen MK and Lee DS (2010). Injectable biodegradable<br /> dính mô rất tốt, tính bám dính này giúp bảo vệ hydrogels. Macromolecular Bioscience, 10, 563-579.<br /> 4. Shah DN, Recktenwall-Work SM and Anseth KS (2008). The<br /> da khỏi sự tấn công của vi khuẩn bên ngoài, effect of bioactive hydrogels on the secretion of extracellular<br /> ngoài ra keo số 2 còn có tính tương hợp sinh học matrix molecules by valvular interstitial cells. Biomaterials, 29,<br /> caogiúp cho tế bào kết dính và phát triển. Với các 2060-2072.<br /> <br /> <br /> <br /> Khoa học Cơ bản 57<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016<br /> <br /> 5. Nguyen Thi Hiep, Kim YH, Song HY, Lee BT (2011). Nano Ag 7. Zheng SX, et al (2004) In situ crosslinkable hyaluronan<br /> loaded PVA nano-fibrous mats for skin applications. Applied hydrogels for tissue engineering. Biomaterials, 25, 1339-1348.<br /> Biomaterials, 968(2): p. 8.<br /> 6. Trần Văn Tiến (2011). Đánh giá hiệu quả của thuốc bôi<br /> Ngày nhận bài báo: 24/11/2015<br /> DAIVONEX trong điều trị bệnh vảy nến thể thông thường.<br /> Tạp chí khoa học công nghệ. 89(01/2): 3 - 7 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 58 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng<br />