Nghiên cứu tổng hợp acid kojic, kẽm kojic và tác dụng ức chế tyrosinase

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày việc phân lập chủng Aspergillus oryzae, tổng hợp acid kojic, phức kẽm kojic. Tiến hành thử nghiệm tác động trên enzym tyrosinase với hy vọng sẽ tạo ra một hợp chất kết hợp tác dụng làm trắng acid kojic và tác dụng đẹp da của kẽm, làm giảm kích ứng tăng tính ổn định của acid kojic.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tổng hợp acid kojic, kẽm kojic và tác dụng ức chế tyrosinase

Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh *Tập 24 * Số 2 * 2020 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ACID KOJIC, KẼM KOJIC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE Trương Phương*, Hoàng Thị Hoài Thương*, Nguyễn Quốc Thái*, Trần Cát Đông*, Nguyễn Tri Thành**, Đặng Thị Loan* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Acid kojic có khả năng ức chế hoạt động tyrosinase trong quá trình tổng hợp melanin và được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm. Tuy nhiên, acid kojic có nhược điểm là độ ổn định thấp trong chế phẩm và gây kích ứng cho da. Nghiên cứu hướng đến tổng hợp dẫn xuất của acid kojic để khắc phục nhược điểm trên. Các phức chelat của acid kojic với các ion kim loại được báo cáo là có nhiều đặc tính nổi bật. Ngoài ra, kẽm được biết là có nhiều tác dụng có lợi cho da như thúc đẩy tái tạo da, chữa lành vết thương, chống lại tác dụng oxy hóa do tia cực tím. Trong nghiên cứu, chúng tôi phân lập chủng Aspergillus oryzae, tổng hợp acid kojic, phức kẽm kojic. Tiến hành thử nghiệm tác động trên enzym tyrosinase với hy vọng sẽ tạo ra một hợp chất kết hợp tác dụng làm trắng acid kojic và tác dụng đẹp da của kẽm, làm giảm kích ứng tăng tính ổn định của acid kojic. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tiến hành thu thập mẫu từ tự nhiên ở những vị trí, điều kiện sống khác nhau ở thành phố Hồ Chí Minh. Phân lập và nuôi cấy Aspergillus oryzae. Thu acid kojic từ môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae. Tổng hợp phức kẽm kojic. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc phức kẽm kojic. xác định cấu trúc bằng kỹ thuật phổ MS, NMR, phân tích nguyên tố, X-ray, AAS. Thử tác dụng trên tyrosinase theo phương pháp Dopachrom. Kết quả: Thu thập mẫu, phân lập và định danh A. oryzae. Khảo sát và xây dựng qui trình tổng hợp acid kojic từ A. oryzae. Tổng hợp phức kẽm kojic. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc phức kẽm kojic. Thử tác dụng trên tyrosinase cho thấy acid kojic và kẽm kojic có tác dụng ức chế tyrosinase trong đó kẽm kojic mạnh gẩp 3 lần acid kojic. Kết luận: Từ Aspergillus oryzae được phân lập từ nguồn trong nước đã tạo được acid kojic. Acid kojic thu được phản ứng với kẽm acetat tạo phức kẽm kojic. Các quá trình được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và chọn những điều kiện phù hợp nhất với điều kiện phòng thí nghiệm và có thể triển khai sản xuất ở qui mô lớn hơn. Kẽm kojic được nghiên cứu tác dụng trên tyrosinase so sánh với acid kojic. Kẽm kojic ức chế tyrosinase mạnh hơn acid kojic 3 lần. Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng trong các chế phẩm mỹ phẩm của sản phẩm tổng hợp. Từ khóa: kẽm kojic, Aspergillus oryzae, acid kojic, kẽm acetat, tyrosinase, trắng da ABSTRACT RESEARCH ON THE PREPARATION OF KOJIC ACID, ZINC KOJIC AND TYROSINASE INHIBITORY ACTIVITY Truong Phuong, Hoang Thi Hoai Thuong, Nguyen Quoc Thai, Tran Cat Dong, Nguyen Tri Thanh, Dang Thi Loan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 184 - 192 Background: Kojic acid is widely used in cosmetics due to its tyrosinase-inhibitory activity in melanin synthesis, unfortunely, it is unstable and rather skin-irritative, whereas kojic chelate complexes with metal ions show to attenuate these disadvantages, on the other hand, zinc owns many skincare benefits such as promoting * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ** Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương 25 Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Phương ĐT: 0938525157 Email: tphuongdhyd@yahoo.com.vn 184 B – Khoa học Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu skin regeneration, healing wounds, protecting the skin from ultraviolet radiation, …. zinc-kojic chelate complex was synthesized from kojic acid, which is produced by the Aspergillus oryzae strain isolated from Ho Chi Minh City’s environment. The process was optimized for laboratory scale and larger, as well. For the tyrosinase inhibitory activty, the obtained zinc-kojic chelate complex proved 3 times stronger than kojic acid itself, potential for use in cosmetics. Materials and methods: Collecting samples from nature in different locations in Ho Chi Minh City. Isolation and culture of Aspergillus oryzae. Kojic acid is acquired from A. oryzae culture medium. Then from kojic acid, kojic zinc complex is synthesized, checked purity and determined structure by MS, NMR, elemental analysis techniques, X-ray, AAS, tested effects on tyrosinase by Dopachrom method Results: Through screening Ho Chi Minh city’s environment A. oryzae was isolated and identify. Establishing and optimizing process synthesis kojic acid from A. oryzae with high yield. From kojic acid and zinc actate in pH 6.5 buffer complex of zinc kojic was obtained. Purity and structure of zinc kojic complex were determined. Testing on tyrosinase showed that kojic acid and zinc kojic strong inhibited tyrosinase. Conclusion: From Aspergillus oryzae isolated, kojic acid was created. Kojic acid reacts with zinc acetate to form zinc kojic complex. The processes are investigated the influencing factors and choose the most suitable conditions for laboratory conditions and can deploy production on a larger scale. On tyrosinase, zinc kojic inhibits tyrosinase 3 times stronger than kojic. This shows the potential for use in cosmetic preparations of synthetic products. Key word: zinc kojic, aspergillus oryzae, kojic acid, zinc acetate, tyrosinase, whitening ĐẶTVẤNĐỀ cho 3 sản phẩm: Sàng lọc được chủng A. oryzae ở Việt Nam, acid kojic và kẽm kojic cho công Acid kojic là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp nghiệp dược. của nhiều loài nấm như Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, A. parasiticus, Penicillium ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU dalea(1). Trong đó, Aspergillus oryzae rất phổ biến Đối tượng nghiên cứu trong tự nhiên, acid kojic có khả năng ức chế Phân lập A. oryzae từ các mẫu mốc bánh mỳ. hoạt động tyrosinase trong quá trình tổng hợp Nuôi cấy A. oryzae và điều chế acid kojic. melanin và được sử dụng rộng rãi trong mỹ Tổng hợp kẽm kojic. phẩm(2). Tuy nhiên, acid kojic có nhược điểm là độ ổn định thấp trong chế phẩm và gây kích ứng Thử tác dụng trên tyrosinase. cho da(3). Các phức chelat của acid kojic với các Nguyên liệu ion kim loại được báo cáo là có nhiều đặc tính Nguyên liệu lên men: glucose, cao nấm men, nổi bật(4). Ngoài ra, kẽm được biết là có nhiều tác pepton casein. dụng có lợi cho da như thúc đẩy tái tạo da, chữa Môi trường: Czapek-Dox, PDA, CCA. lành vết thương, chống lại tác dụng oxy hóa do Hóa chất: NH4NO3, K2HPO4, MgSO4, FeCl3, tia cực tím(5). agar, nước cốt dừa Chaokoh (Thái Lan). Trong nghiên cứu, chúng tôi phân lập chủng Chủng gốc A. oryzae ATCC 22788 (công ty Aspergillus oryzae, tổng hợp acid kojic, phức kẽm HVBIOTEK). Glucose, K2HPO4, MgSO4, FeCl3, kojic. Tiến hành thử nghiệm tác động trên Agar, NaCl, Tween 80, aceton, HCl, enzym tyrosinase với hy vọng sẽ tạo ra một hợp Zn(CH3COO)2, CH3COOH, CH3COONa, chất kết hợp tác dụng làm trắng acid kojic và tác C2H5OH, NaH2PO4.2H2O, Than hoạt, H2SO4, dụng đẹp da của kẽm, làm giảm kích ứng tăng EDTA, Đen eriocrom T, Amoniac đậm đặc, tính ổn định của acid kojic. Đề tài hoàn thành sẽ HNO3 (Trung Quốc) tinh khiết hóa học. Pepton B – Khoa học Dược 185
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh *Tập 24 * Số 2 * 2020 casein, acid kojic chuẩn (Merck). Tyrosinase từ DMSO-d6). nấm Agaricus bisporus, L – DOPA (Sigma – Tổng hợp phức kẽm kojic. Aldrich) tinh khiết phân tích. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc Phương pháp nghiên cứu phức kẽm kojic. Thu thập mẫu, phân lập và định danh Thử tác dụng trên tyrosinase theo phương Thu thập mẫu từ tự nhiên ở những vị trí, pháp Dopachrom. điều kiện sống khác nhau ở thành phố Hồ Chí KẾT QUẢ Minh. Tiến hành phân lập bằng cách pha loãng các mẫu nhiễm mốc trong NaCl 8,5% có Thu thập mẫu, phân lập, định danh bổ sung tween 80 nồng độ 0,1%. quan sát đặc Từ 40 mẫu cơm, bánh mì ban đầu, phân lập điểm khuẩn lạc và hình thể dưới kính hiển vi, được 20 chủng A. oryzae. Kết quả các chủng phân so sánh với chủng A. oryzae chuẩn, định danh lập được (Bảng 1). theo khóa phân loại của Raper và Fennell(5). Bảng 1. Địa điểm thu thập mẫu Khảo sát khả năng sinh aflatoxin bằng Số lượng Địa điểm Các chủng phân lập được phương pháp nuôi cấy trên CCA (Coconut mẫu Quận Bình Thạnh 10 mẫu 1D1, 1D2, 2G, 3D, 4F cream agar): Sau khi cấy 3-4 ngày, quan sát mặt Quận Gò Vấp 10 mẫu 5D, 6F, 7E2, 7F1, 9D trái của khuẩn lạc nấm dưới UV 365 nm, chủng Quận 1 10 mẫu 10D2, 10E1, 11D2, 11G1, 12C1 nào có sinh aflatoxin sẽ cho vòng phát quang Quận Thủ Đức 10 mẫu 12C2, 13D2, 13D3, 13F1, 14 màu xanh. Khả năng sinh aflatoxin của các chủng A. oryzae Khảo sát khả năng sinh acid kojic. Trong 20 chủng phân lập được, có 11 Thành phần môi trường nuôi cấy: glucose chủng không sinh aflatoxin, chủ yếu tập trung 100 g/l, cao nấm men 2,5 g/l, K2HPO4 1,0 g/l và ở các chủng thu thập ở quận Bình Thạnh. Do MgSO4 0,5 g/l. địa điểm lấy mẫu được chọn ngẫu nhiên và Điều kiện lên men: nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc không có khảo sát về đặc điểm môi trường nơi 200 vòng/phút, thời gian 14-16 ngày. mỗi ngày lấy mẫu nên chưa thể kết luận khả năng sinh lấy mẫu định lượng nồng độ acid kojic trong môi aflatoxin có liên quan đến nguồn gốc của trường, đồng thời, ly tâm thu sinh khối, sấy khô chủng hay không. ở 70oC đến khi trọng lượng không đổi. Khả năng sinh acid kojic của các chủng phân Định lượng acid kojic bằng phản ứng với Fe3+ lập được tạo phức màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại Tiến hành lên men với các điều kiện đã trình λmax = 495 nm. bày trong phần phương pháp nghiên cứu. Ghi Thu acid kojic bằng cách lọc bỏ sinh khối, thu nhận nồng độ acid kojic tối đa trong dịch lên dịch lọc chứa sản phẩm, cô quay ở 80oC còn 1/20 men mà chủng đó đạt được (Bảng 2). thể tích ban đầu, để acid kojic kết tinh ở 25oC, Bảng 2. Khả năng sinh acid kojic của các chủng phân thu được sản phẩm thô. Acid kojic được tinh chế lập được bằng ethanol và aceton. Chủng Nồng độ acid Chủng Nồng độ acid kojic (g/l) kojic (g/l) Kiểm nghiệm acid kojic bằng SKLM, đo 1D1 16,81 6F 28,43 nhiệt độ nóng chảy, phổ UV-Vis (máy 1D2 17,69 7F1 0,52 Shimadzu MPC-2200), phổ IR (máy FTIR 8101 2G 19,48 9D 5,87 Shimadzu, với kỹ thuật dập viên KBr), phổ MS 3D 14,61 11D2 25,52 (máy Quattro Micro API, kỹ thuật ESI), phổ 4F 36,25 12C1 7,60 NMR (máy Bruker 500 MHz, dung môi 5D 22,87 ATCC 22788 3,70 186 B – Khoa học Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu Phần lớn các chủng phân lập được đều có của A. oryzae 4F được trình bày trong Hình 1. khả năng sinh acid kojic tương đối cao. Ngoại - Giai đoạn 1 (khoảng 3 ngày đầu): Acid kojic trừ chủng 7F1, các chủng còn lại đều sinh nhiều chưa được sinh ra hoặc chỉ mới lượng nhỏ acid kojic hơn chủng gốc ATCC. - Giai đoạn 2 (từ ngày thứ 3 trở đi): sinh Khảo sát đường cong sinh trưởng của chủng tổng hợp acid kojic tăng mạnh và đạt cực đại vi nấm đã chọn vào khoảng ngày thứ 14. Kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng Hình 1. Sự biến thiên nồng độ acid kojic và lượng sinh khối khô (SKK) của chủng A. oryzae 4F theo thời gian Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng 4f Bảng 3. Kết quả khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng Từ điều kiện và môi trường lên men ban (n = 3) Điều kiện cụ Nồng độ acid đầu, lần lượt thay đổi từng yếu tố nhiệt độ, loại TT Yếu tố thể kojic (g/l) nguồn nitơ, loại nguồn carbon, nồng độ nguồn 25 20,19 o * nitơ, nồng độ nguồn carbon, thời gian lên men 1 Nhiệt độ ( C) 30 36,25 37 30,34 để khảo sát ảnh hưởng của chúng trên khả năng NH4NO3 9,45 sinh acid kojic (Bảng 3). Cao nấm men 33,71 2 Loại nguồn nitơ * Pepton casein 41,77 Thu nhận và tinh chế acid kojic Pepton thịt 26,02 * Từ 100 ml dịch lên men, lọc bỏ sinh khối và Glucose 39,95 cô dịch lên men thu được 5,49 g acid kojic thô. Fructose 7,62 3 Loại nguồn carbon Sucrose 31,99 Kết quả tinh chế bằng ethanol hoặc aceton. Lactose 6,89 Trong đó tinh chế bằng aceton có hiệu quả hơn 1,5 26,89 * so với ethanol (Bảng 4). 2,5 40,29 Nồng độ pepton 4 casein (g/l) 3,5 33,85 Kiểm nghiệm 4,5 29,94 5,5 16,32 Sắc ký lớp mỏng: Hòa tan sản phẩm thu 50 18,64 được trong methanol, tiến hành SKLM trong 3 100 * 39,48 Nồng độ glucose hệ dung môi khác nhau. 5 (g/l) 150 38,95 200 34,35 Hệ 1: ethyl acetat - methanol (15:1) 300 11,63 Hệ 2: aceton – cloroform (7:3) 12 30,47 13 32,18 Hệ 3: methanol – cloroform (1:1) 14 37,59 * Kết quả ở cả 3 hệ đều được 1 vết duy nhất, 6 Thời gian (ngày) 15 40,59 16 39,61 chứng tỏ sản phẩm tinh khiết. 17 34,49 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, 18 26,33 NMR, MS (Bảng 5). * Điều kiện thích hợp được lựa chọn B – Khoa học Dược 187
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh *Tập 24 * Số 2 * 2020 Nhận xét: nồng độ acid kojic cũng tăng tương ứng, đạt cực Đối với chủng 4F, nhiệt độ thích hợp cho đại, rồi giảm dần. quá trình lên men là 30oC. Kết quả này phù Khi tăng thời gian lên men, nồng độ acid hợp với lý thuyết và kết quả thực nghiệm của kojic tăng dần, nhưng khi vượt quá 15 ngày, các nghiên cứu khác. nồng độ sản phẩm lại giảm. Khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ, thu được Bảng 4. Hiệu suất tinh chế acid kojic với ethanol và lượng sản phẩm ít hơn so với dùng nguồn nitơ aceton hữu cơ. Nguyên nhân có thể là do trong nguồn Nồng độ acid Hiệu suất tinh chế Hiệu suất tinh chế nitơ hữu cơ còn có chứa các loại khoáng chất, kojic (%) với ethanol (%) với aceton (%) 2 68 81 vitamin, giúp cho sự phát triển của vi nấm. 4 64 78 Sử dụng glucose, nồng độ acid kojic thu 6 51 58 được là cao nhất (39,95 g/l), tiếp đến là sucrose 8 52 33 (31,99 g/l). 10 30 20 Khi tăng nồng độ nguồn carbon hoặc nitơ, Bảng 5. Kết quả xác định tính chất và cấu trúc của acid kojic o 1 13 CTCT t chảy UV IR H-NMR C-NMR MS o -1 ( C) (nm) (cm ) ( ppm) ( ppm) m/z 1 268 3172,7 νOH 9,05 (s, 1H, OH) 173,91 (C4) 6 O 2 216 1660,6 νC=O 8,02 (s, 1H, H6) 168,07 (C2) OH 153 5 1610,5 νC=C 6,33 (s, 1H, H3) 145,69 (C5) 142,94 3 5,653-5,677 (t, J=6 Hz, 1H, CH2-OH) 139,24 (C6) HO 4 4,279-4,291 (d, J=6Hz, 2H, -CH2-) 109,83 (C3) O 59,47 (-CH2-) Nhận xét: Các kết quả kiểm nghiệm cho thấy Xác định cấu trúc sản phẩm sản phẩm thu nhận được của giai đoạn lên men Quang phổ hồng ngoại (IR) có tính chất, cấu trúc phù hợp với dự kiến. Do Phổ IR của sản phẩm kẽm kojic có các nhóm đó, ta kết luận sản phẩm này là acid kojic. chức đặc trưng (Bảng 6). Tổng hợp kẽm kojic Bảng 6. Các nhóm chức đặc trưng của kẽm kojic Trong cốc có t mỏ 250 ml, hòa tan 0,85 g Acid kojic Kẽm kojic Nhóm chức acid kojic (0,006 mol), vào 100 ml 3172,7 cm -1 3047 cm -1 O-H (CH2OH) -1 -1 ethanol/nước (1:1). Hòa tan 0,66 g 1660,6 cm 1622 cm C=O -1 -1 Zn(CH3COO)2. 2H2O (0,003 mol), trong dung 1584 cm 1560 cm C=C môi tương tự. Trộn dung dịch acid kojic và Phân tích thành phần nguyên tố cacbon và hydro kẽm acetat trong bình cầu 250 ml, khuấy Bảng 7. Kết quả xác định thành phần nguyên tố đều. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng ở 60 oC, Nguyên tố Lý thuyết (%) Thực tế (%) trong vòng 2 giờ. Sản phẩm kết tủa. Lọc lấy cacbon 41,5 43,2 tủa. Hòa tủa vào nước, để loại tạp tan trong hidro 2,88 3,21 nước như acid acetic, acid kojic dư, lọc thu Kết quả phân tích thu được, tỉ lệ cacbon và lấy tủa. Hòa sản phẩm vào cồn 90o, để loại hydro gần với tỉ lệ của công thức dự đoán (Bảng 7). đi các tạp tan trong cồn, lọc lấy tủa. Sấy sản Định lượng thành phần nguyên tố kẽm bằng phẩm ở 60 oC trong 4 giờ. Thu được 0,703 phương pháp complexon (g). Hiệu suất 67,5%. Nhận xét: Kẽm acetat, Phương pháp complexon định lượng thành acid kojic khó hòa tan trong dung môi cồn phần kẽm gần với tỉ lệ dự đoán (Bảng 8). nước. Hiệu suất phản ứng thấp. 188 B – Khoa học Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu Bảng 8. Kết quả phân tích nguyên tố kẽm bằng complexon Kết quả: mcân = 1,0075 (g); Cx =0,43 ppm; %Zn mcân (g) Trilon B chuẩn Trilon B chuẩn độ %mZn (%) = 17,8 %, giống với công thức dự đoán. độ mẫu thử (ml) mẫu trắng (ml) Thực Lý Xác định cấu trúc tinh thể bằng nhiễu xạ tia X V1 V2 Vtb V’ 1,0075 tế thuyết Kết quả phổ nhiễu xạ tia X (Hình 3). 5,45 5,4 5,425 0 17,5 18,7 Định lượng thành phần nguyên tố kẽm bằng phổ hấp thu nguyên tử Bảng 9. Kết quả độ hấp thu của các mẫu thử chứa kẽm (n = 3) Mẫu 1 2 3 4 5 6 Mẫu thử Nồng độ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Cx (ppm) Độ hấp thu 0 0,082 0,136 0,202 0,272 0,340 0,148 A Hình 3. Kết quả phổ nhiễu xạ tia X Từ kết quả phổ nhiễu xạ tia X dự đoán công thức phân tử dựa trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng dữ liệu Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh. Phức kẽm kojic không có trong ngân hàng dữ liệu, dựa trên kết quả phổ, 3 cấu trúc giống với sản Hình 2. Sự phụ thuộc độ hấp thu A theo nồng độ phẩm tổng hợp đề xuất như sau: C10H8O6Zn.6H2O (giống 72 %) C10H18O4Zn.2H2O ( giống 65 %) Zn2[C6H2O2(COO2)2](H2O)2 (giống 50 %) O O 2 Zn O Zn O O O O O 2 O O Zn Kẽm Pentanoat O O O O O .2H 2 O O Zn Kẽm Isophtalat Kẽm quinondicarboxylat Hình 4. Cấu trúc các chất có trong ngân hàng nhiễu xạ tia X tương tự chất tổng hợp Nhận xét: Công thức 1 và 2, thể hiện liên kết kẽm và oxi, chất thứ 3 thể hiện cấu trúc chelat. Từ những kết quả này, nhận thấy kẽm kojic có công thức cấu tạo dạng chelat. Kết hợp với các kết quả kiểm nghiệm trên, chúng tôi có thể kết luận rằng, sản phẩm thu được là kẽm bikojic (Hình 4). Hình 5. Cấu trúc chất tổng hợp Kẽm bi Công thức phân tử: (C6H5O4)2Zn (Hình 5). (3-benzyloxy-4-pyron-6-carboxylat) kẽm bi kojic B – Khoa học Dược 189
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh *Tập 24 * Số 2 * 2020 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng Khảo sát pH Thay đổi dung môi phản ứng Cố định các điều kiện phản ứng: Nhiệt độ Cố định các điều kiện: Nhiệt độ phản ứng: phản ứng: 60 oC; thời gian phản ứng: 2 giờ; tỷ lệ 60 C; thời gian phản ứng: 2 giờ; tỷ lệ mol acid o mol acid kojic và kẽm acetat: 2:1; dung môi nước. kojic và kẽm acetat: 2:1. Tiến hành thí nghiệm Thay đổi pH từ 1 - 9 (Bảng 10). khảo sát dung môi phản ứng là nước. Thu được Nhận xét: Không tạo tủa ở pH 1. Ở pH cao 0,824 g sản phẩm. Hiệu suất: 79,15%. (pH 8; 9) xuất hiện tủa Zn(OH)2 là tạp, không xác Nhận xét: Hiệu suất phản ứng khi sử dụng định được lượng sản phẩm, không chọn. Ở dung môi nước cất cao hơn đáng kể so với dung pH=5, hiệu suất phản ứng là cao nhất. môi cồn nước, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng sau trong dung môi là nước cất. Bảng 10. Kết quả khảo sát pH (n = 3) Hệ đệm HCl/KCl CH3COOH/ CH3COONa pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 msản phẩm (g) 0 0,62 0,70 0,82 0,94 0,90 0,79 1,24 1,24 Hiệu suất ( %) 0 59,6 67,3 78,8 90,3 86,4 75,9 Không xác định Khảo sát tỉ lệ mol phản ứng do acid kojic bị phân hủy nên chọn thời gian phản ứng là 2 giờ. Cố định các điều kiện phản ứng: Nhiệt độ phản ứng: 60oC; thời gian phản ứng: 2 giờ; dung Bảng 12. Hiệu suất phản ứng theo thời gian tiến môi nước pH 5. Thay đổi tỉ lệ mol Zn(CH3COO)2: hành phản ứng (n = 3) Acid kojic (Bảng 11). Thời gian phản ứng (giờ) 2 3 4 5 6 7 msản phẩm thực tế (g) 0,84 0,80 0,74 0,82 0,82 0,74 Bảng 11. Kết quả khảo sát tỉ lệ mol phản ứng (n = 3) Hiệu suất (%) 80,7 76,8 71 78,8 78,8 71,1 Thí Tỉ lệ mol Kẽm acetat acid m sản Hiệu nghiệm Kẽm acetat: (g) kojic phẩm suất Khảo sát nhiệt độ phản ứng A.kojic (g) (g) (%) Cố định thời gian phản ứng: 2 giờ; dung môi 1 1:2 0,66 0,85 0,80 76,8 nước pH 5, tỉ lệ mol Zn(CH3COO)2 - acid kojic là: 2 1:1 0,66 0,43 0,45 86,5 1:2. Khảo sát nhiệt độ phản ứng là nhiệt độ 3 1,5:1 0,99 0,43 0,41 78,8 4 1,7:1 1,12 0,43 0,45 86,5 phòng và 60oC (Bảng 13). 5 2:1 1,31 0,43 0,43 82,7 Bảng 13. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng (n = 3) Nhận xét: Tỉ lệ mol Zn(CH3COO)2 : Acid Thí Nhiệt độ phản o Khối lượng Hiệu suất (%) nghiệm ứng ( C) thực tế (g) kojic cho lượng sản phẩm cao nhất là tỉ lệ (1: 1) 1 25 0,83 79,6 và (1,7 :1). Tuy nhiên khi kiểm nghiệm thì đó là 2 60 0,85 81,4 hỗn hợp giữa kẽm bikojic và mono kojic. Chỉ ở tỷ Nhận xét: Tiến hành ở nhiệt độ phòng có thể lệ 1: 2 sản phẩm gần với lý thuyết nhất. Do đó, cho hiệu suất thấp hơn ở 60oC một chút, tuy chọn tỉ lệ mol kem acetat: acid kojic là 1:2. nhiên khi tiến hành ở nhiệt độ phòng sẽ giúp Khảo sát thời gian phản ứng đơn giản hóa quá trình phản ứng. Cố định các điều kiện phản ứng: Nhiệt độ Từ kết quả khảo sát, chọn điều kiện: Dung phản ứng: 60oC; dung môi nước pH 5, tỉ lệ mol môi phản ứng: nước cất pH 5 (hệ đệm Zn(CH3COO)2: acid kojic là: 1:2. Thay đổi thời CH3COOH/ CH3COONa); tỉ lệ mol chất tham gia gian phản ứng như Bảng 12. kẽm acetat- acid kojic là 1: 2; thời gian phản ứng: Nhận xét: Phản ứng đạt hiệu suất cao nhất ở 2 giờ; nhiệt độ phòng. Do hiệu suất đã đạt 81% 2 giờ. Khi tăng thời gian, hiệu suất giảm, có thể nên không tiếp tục tối ưu hóa. 190 B – Khoa học Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu Thử tác dụng trên tyrosinase – phương pháp Dopachrom Kết quả: Nếu tốc độ phản ứng quá nhanh, sẽ Chọn bước sóng khảo sát bị sai số lớn trong khi khảo sát. Ngược lại, nếu enzym phản ứng chậm, sẽ gây ảnh hưởng đến Dopachrom có đỉnh hấp thu duy nhất tại 480 chất lượng enzym. Chọn nồng độ enzym nm. Điều kiện máy ELISA tại phòng thí nghiệm tyrosinase trong giếng là 15 U/ml. chỉ có bước sóng cố định 495 nm là gần với đỉnh hấp thu nhất, nên chọn bước sóng 495 nm. Sự ảnh hưởng của dung môi trợ tan Phức kẽm kojic chỉ tan trong đệm acetat (pH 6). Môi trường thử nghiệm là đệm phosphat pH 6,5. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi trợ tan lên hoạt tính của enzym tyrosinase (Bảng 14), đo độ hấp thu ở bước sóng 495 nm mỗi 10 giây trong 10 phút. Kết quả: Dung môi ức chế 5,80 % hoạt tính enzym tyrosinase, không đáng kể có thể bỏ qua. Bảng 14. Thành phần các giếng khảo sát sự ảnh Hình 4. Sự phụ thuộc nồng độ sản phẩm hưởng của dung môi trợ tan theo thời gian phản ứng Thành phần Trắng Chứng Thử Khảo sát khả năng ức chế tyrosinase của kẽm kojic Đệm phosphat 50mM; pH 6,5 (µl) 120 90 80 Dung môi trợ tan : Đệm acetat Giai mẫu dung dịch mẹ các chất thử dùng - - 10 50mM; pH 6 (µl) trong thử nghiệm: Acid kojic: 0,3 M; 0,03 M; Tyrosinase 100U/ml (µl) - 30 30 0,003M; 3.10-4 M; 3.10-5 M; 3.10-6 M; Kẽm kojic: Ủ 10 phút L-DOPA 10mM (µl) 80 80 80 0,03M; 0,003M; 3.10-4 M; 3.10-5 M; 3.10-6 M; 3.10-7 M. Mẫu khảo sát có thành phần như bảng 16. Nồng độ cơ chất L – DOPA Đo độ hấp thu ở bước sóng 495 nm mỗi 10 giây Dựa vào biểu thức Michaelis – Menten, nồng trong 10 phút. Từ tốc độ xúc tác tính toán khả độ cơ chất L-DOPA chọn sao cho vận tốc xúc tác năng ức chế tyrosinase TI (%). gần vận tốc tối đa và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Chọn CM L-DOPA = 4 mM. Bảng 16. Thành phần trong giếng khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase Nồng độ enzym tyrosinase Thành phần Trắng Chứng Kẽm kojic Acid kojic Tiến hành khảo sát các mẫu khảo sát có Đệm phosphat 50mM; 120 90 80 80 thành phần như Bảng 15. Đo độ hấp thu ở bước pH 6,5 (µl) Chất khảo sát theo sóng 495 nm mỗi 30 giây trong 45 phút. Vẽ đồ thị giai mẫu dd mẹ (µl) - - 10 10 sự phụ thuộc độ hấp thu A theo thời gian. Tyrosinase 100 U/ml - 30 30 30 (µl) Bảng 15. Thành phần các giếng khảo sát nồng độ Ủ 10 phút enzym thử nghiệm L-DOPA 10 mM (µl) 80 80 80 80 Thử Thành phần Trắng 5 10 15 Kết quả: IC50 kẽm kojic = 17,04 µM; IC50 acid (U/ml) (U/ml) (U/ml) kojic = 56,52 µM. Đệm phosphat 50mM; pH 6,5 (µl) 120 110 100 90 Nhận xét: IC50 acid kojic gấp khoảng 3 lần Tyrosinase 100U/ml (µl) - 10 20 30 IC50 kẽm kojic, cho thấy kẽm kojic có khả năng Ủ 10 phút ức chế enzym tyrosinase mạnh hơn gấp 3 lần L-DOPA 10mM (µl) 80 80 80 80 acid kojic. B – Khoa học Dược 191
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh *Tập 24 * Số 2 * 2020 BÀNLUẬN hiệu quả làm trắng da vượt trội của kẽm kojic, đây là một tiềm năng sử dụng trong các chế Nguồn nguyên liệu acid kojic được tổng hợp phẩm mỹ phẩm của sản phẩm tổng hợp. bằng cách lên men, điều kiện tối ưu của môi trường nuôi cấy gồm các thành phần: Glucose KẾTLUẬN (150 g/l); Pepton casein (3,5 g/l); K2HPO4 (1 g/l); Từ Aspergillus oryzae được phân lập từ nguồn MgSO4 (0,5 g/l) với mật độ chủng Aspergillus trong nước đã tạo được acid kojic. Acid kojic thu oryzae là 105 CFU/ml. Lên men trong nồi lên men được phản ứng với kẽm acetat tạo phức kẽm có sục khí oxi, khuấy với tốc độ 200 vòng/ phút, kojic. Các quá trình được khảo sát các yếu tố ảnh nhiệt độ 30oC, môi trường nuôi cấy pH 6,5 trong hưởng và chọn những điều kiện phù hợp nhất 15 ngày. Hiệu suất tạo acid kojic cao. Tuy nhiên với điều kiện phòng thí nghiệm và có thể triển trong nghiên cứu chúng tôi thấy chủng A. oryzae khai sản xuất ở qui mô lớn hơn. Sản phẩm kẽm sau thờ gian lưu trữ có thể thoái hóa dàn giảm kojic được tinh chế và xác định cấu trúc bằng các năng suất vì tế cần có những nghirên cứu để giữ phương pháp: Phân tích nguyên tố, định lượng và ổn định chủng nấm. Đây là một phương pháp kẽm bằng complexon, AAS và X–ray. Sản phẩm tổng hợp acid kojic khả quan để cung cấp tổng hợp là kẽm bikojic. Kẽm kojic được nghiên cứu tác dụng trên tyrosinase so sánh với acid nguyên liệu chi phí rẻ cho phản ứng tổng hợp kojic. Kẽm kojic ức chế tyrosinase mạnh hơn kẽm kojic. kojic 3 lần. Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng Phản ứng tạo kẽm kojic từ acid kojic dễ thực trong các chế phẩm mỹ phẩm của sản phẩm hiện, cho sản phẩm tinh khiết, hiệu suất cao. tổng hợp. Điều kiện tối ưu của phản ứng được khảo sát là TÀILIỆUTHAMKHẢO nhiệt độ phòng (25oC), dung môi là nước cất, pH 1. Mohamad R, Mohamed MS, Ariff AB, et al (2010). Kojic acid: 5 được kiểm soát bằng đệm acetat, tỉ lệ mol kẽm Applications and development of fermentation process for acetat: acid kojic là 1:2, phản ứng trong 2 giờ. Sản production. Biotechnololy & Molecular Biology Reviews, 5(2):24-37. 2. Saeedi M, Eslamifar M, Khezri K (2019). Kojic acid applications phẩm thu được có độ tinh khiết cao. Hiệu suất in cosmetic and pharmaceutical preparations. Biomedicine & khoảng 80%. Điều này giúp việc nghiên cứu Pharmacotherapy, 110:582-593. tổng hợp kẽm kojic trên quy mô công nghiệp dễ 3. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, et al (2010). Final report of the safety assessment of kojic acid as used in cosmetics. Int J dàng và thuận lợi hơn vì điều kiện phản ứng Toxicol, 29(6):244-273. đơn giản, chi phí thấp và sản phẩm thu được có 4. Murakami Y, Mera K (1966). Complexing behavior of kojic acid độ tinh khiết cao. with metal ions. III. Infrared studies of bivalent metal-kojate chelates. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 39(2):396-397. Thử tác dụng của kẽm kojic tổng hợp được 5. Ogawa Y, Kinoshita M, Shimada S, et al (2018). Zinc and skin trên tyrosinase và so sánh với acid kojic. Kết quả disorders. Nutrients, 10(2):199. cho thấy khả năng ức chế tyrosinase của kẽm kojic mạnh hơn gấp 3 lần acid kojic. Điều này có Ngày nhận bài: 28/11/2019 thể do phức kẽm kojic trong cấu trúc có 2 phân Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/12/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2020 tử acid kojic, khi gặp tyrosinase sẽ có ái lực tạo phức chelat với nguyên tử đồng của enzym mạnh mẽ, do đó làm bất hoạt enzym. Dẫn đến 192 B – Khoa học Dược