Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết này trình bày quá trình tổng hợp azathioprine qua 4 giai đoạn, hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 %. Azathioprine tồn tại ở dạng tinh thể, màu vàng sáng, điểm nóng chảy 243-245 oC. Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ IR, NMR, MS.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine

Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP AZATHIOPRINE Vũ Ngọc Toán1*, Nguyễn Minh Trí1, Đỗ Hữu Ân2, Đào Minh Đức2 Tóm tắt: Azathioprine được FDA phê duyệt để sử dụng trong điều trị chứng viêm khớp dạng thấp. Nó cũng được chấp thuận như là một liệu pháp bổ trợ để ngăn ngừa thải ghép thận. Bài báo này trình bày quá trình tổng hợp azathioprine qua 4 giai đoạn, hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 %. Azathioprine tồn tại ở dạng tinh thể, màu vàng sáng, điểm nóng chảy 243-245 oC. Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ IR, NMR, MS. Từ khóa: Azathioprine; Imidazole; Ức chế miễn dịch; Ghép tạng. 1. MỞ ĐẦU Ghép tạng là việc di chuyển nội tạng từ người này sang người khác hoặc từ vị trí này sang vị trí khác trên cùng một cơ thể người, nhằm thay thế nội tạng bị mất hoặc bị hư hỏng. Nội tạng và mô được cấy ghép trong cùng cơ thể được gọi là autograft. Việc cấy ghép nội tạng và mô được thực hiện trên hai cá thể cùng loài gọi là allograft [1, 2]. Sau ghép tạng, thải ghép là nguy cơ hàng đầu khiến các ca ghép tạng thất bại [2]. Kể từ khi thuốc ức chế miễn dịch ra đời, tỷ lệ thành công của các ca ghép tạng đã tăng lên đáng kể [4]. Thuốc ức chế miễn dịch được chia làm 3 nhóm lớn: Thuốc ức chế miễn dịch nhóm 1 bao gồm cyclosporine, tacrolimus, advagraf, glucocorticoid; thuốc ức chế miễn dịch nhóm 2 gồm basiliximab, daclizumab, sirolimus, rapamycine và thuốc ức chế miễn dịch nhóm 3 gồm azathioprine, mycophenolate mofetil [1, 4]. Azathioprine là một chất ức chế phân bào làm giảm sự tăng sinh của tế bào T và được sử dụng đầu tiên trong ghép tạng. Azathioprine hoạt động trên tế bào vào giai đoạn S của chu trình tế bào, nó có tác dụng phong bế hoạt động của acid inosinic [4]. Azathioprine được tổng hợp lần đầu tiên bởi Hitchings và cộng sự năm 1960 [3], tuy nhiên, phương pháp của Hitchings và cộng sự chỉ tiến hành một giai đoạn sử dụng nguyên liệu đầu 5- chloro-1-methyl-4-nitroimidazole là một tác nhân khá đắt và không có sẵn trên thị trường trong nước. Năm 2009, Yuan-Xiang Fu và cộng sự [6] đưa ra phương pháp tiến hành phản ứng tổng hợp azathioprine qua 4 giai đoạn với hiệu suất tổng cộng đạt 20 %. Trong bài báo này, trên cơ sở các nghiên cứu tối ưu hóa, azathioprine được tổng hợp qua 4 bước với hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 %. Cấu trúc, độ sạch của azathioprine và các sản phẩm trung gian được xác nhận bằng các phương pháp vật lý hiện đại như IR, NMR, MS, tonc. 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất Diethyl oxalate (99,0 %, Fischer) và dung dịch methylamine (40 %, Fischer) được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu. Phosphorus pentachloride (98,0 %), phosphoryl chloride (99,0 %), 6-mercaptopurine monohydrate (99,5 %), acid acetic (99,7 %) và dimethyl sulfoxide (99,8 %) được nhập của hãng hóa chất Fischer. Tất cả các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu có chất lượng đạt tinh khiết phân tích. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phổ hồng ngoại: Phổ IR được ghi trên thiết bị FT-IR Tensor II (Bruker, Đức) ở dạng ép viên với KBr. - Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H NMR và 13C NMR được đo trên máy phổ ADVANCE AV500 (Bruker, Đức) trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội là Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 9
Hóa học và Kỹ thuật môi trường TMS ở nhiệt độ phòng (300 K). Phổ 1H NMR được đo ở tần số máy 500,13 MHz và phổ 13 C NMR được đo ở tần số máy 125,76 MHz. - Phương pháp phổ khối lượng: Phổ ESI-MS được đo trên thiết bị LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Mỹ), dung môi methanol. - Phương pháp sắc ký bản mỏng: Sắc ký bản mỏng (TLC) được tiến hành trên tấm silicagel loại 60F254 No. 5715 (Merck, Đức), với hệ dung môi n-hexane:ethyl acetate =1:1 (v/v), vết sản phẩm được quan sát bằng cách hiện màu với iodine. - Thiết bị đo điểm nóng chảy STUART SMP3 (Anh). 2.3. Phương pháp tổng hợp azathioprine - Tổng hợp oxalyl dimethylamine: Trong bình cầu 3 cổ dung tích 500 mL lắp sẵn máy khuấy từ, phễu nhỏ giọt, sinh hàn, nhiệt kế, bổ sung monomethylamine 40 % (62 mL), làm lạnh hỗn hợp về -5 oC bằng hỗn hợp đá muối. Nhỏ giọt từ từ diethyl oxalate (30 mL) vào hỗn hợp, khuấy và duy trì ở nhiệt độ 0-5 oC. Sau khi nhỏ giọt xong, khuấy tiếp 4 giờ ở điều kiện trên. Kết tủa tách ra được lọc, rửa bằng nước đá bão hòa đến trung tính. Sấy khô ở 80 o/12 giờ thu được sản phẩm oxalyl dimethylamine (oxamide) là chất rắn, màu trắng, tonc=215-217 oC. O O OEt -2EtOH NH CH3 CH3NH2 + H3C NH EtO O O Methylamine Diethyl oxalate Oxalyl dimethylamine - Tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate: Oxamide (4,389 g) và phosphorus pentachloride (16,0 g) được chuyển vào bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL. Bổ sung 15 mL dung môi POCl3 vào hỗn hợp phản ứng. Hỗn hợp được khuấy cách thủy ở 60-70 oC trong 3 giờ. Lắp bộ cô quay chân không, cất loại dung môi POCl3 (lưu ý nhiệt độ không quá 70 o C). Phần cặn sau khi chưng cất được bổ sung thêm 30 mL nước cất, khuấy đều thu được dung dịch. Chỉnh pH của dung dịch về pH 10-12 bằng dung dịch KOH 60-70 %. Chiết dung dịch với dichloromethane (3x20 mL) thu dịch lọc. Để yên dịch chiết qua đêm cho đến khi bay hơi toàn bộ thu được phần cặn. Bổ sung 30 mL acetone vào phần cặn, khuấy đều và lọc thu dịch lọc. Acid hóa dịch lọc bằng acid nitric đặc đến pH 1-3 sau đó làm lạnh dung dịch. Kết tủa tách ra được lọc, rửa bằng acetone lạnh trên phễu lọc Buchner. Sấy kết tủa ở 80 oC/12 giờ thu được sản phẩm là chất rắn, màu trắng, tonc=141-143 oC. Cl O NH CH3 PCl5, POCl3 H3C N - H3C NH + HNO3 NO3 N O H Oxalyl dimethylamine 5-Chloro-1-methylimidazole nitrate - Tổng hợp 5-chloro-1-methyl-4-nitroimidazole: 5-chloro-1-methylimidazole nitrate (2,685 g) được chuyển vào bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL. Hỗn hợp gồm 5 mL acid sulfuric đặc và 1,7 mL acid acetic băng được chuyển vào phễu nhỏ giọt. Nhỏ giọt từ từ kết hợp với khuấy cách thủy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ không quá 25 oC. Sau khi kết thúc nhỏ giọt, gia nhiệt hỗn hợp đến các giá trị 40, 50, 60, 70, 80 C, với mỗi giá trị nhiệt độ duy trì trong 1 giờ. Khi phản ứng kết thúc, rót toàn bộ hỗn hợp vào cốc 250 mL. Thêm 100 g đá vụn vào hỗn hợp thấy xuất hiện kết tủa trắng. Lọc, rửa bằng nước lạnh trên phễu Buchner đến pH trung tính. Sấy kết tủa ở 80 oC/12 giờ thu được sản phẩm là chất rắn, màu trắng, tonc=148-150 oC. 10 V. N. Toán, ..., Đ. M. Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.”
Nghiên cứu khoa học công nghệ Cl NO2 H2SO4 N H3C N + - CH3COOH N Cl N NO3 H H3C 5-Chloro-1-methylimidazole nitrate 5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole - Tổng hợp azathioprine: Trong bình cầu 3 cổ dung tích 250 mL đã lắp sẵn máy khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế, sinh hàn hồi lưu, cách ẩm, chuyển 6-mercaptopurine khan (2,3 g), 5- chloro-1-methyl-4-nitroimidazole (2,5 g) và natri acetate khan (1,25 g) vào bình cầu, thêm 20 mL dung môi DMSO khô. Hỗn hợp được gia nhiệt cách thủy đến 100 oC và duy trì trong 5 giờ. Để yên hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, rót từ từ hỗn hợp vào 200 g đá vụn, kết tủa màu vàng tách ra được lọc, rửa với nước lạnh. Kết tinh lại trong hệ dung môi acetone-nước theo tỷ lệ 3:2. Sấy khô ở 80 oC/12 giờ thu được azathioprine là chất rắn, màu vàng sáng. SH N N NO2 NO2 NN N N H Mercaptopurine S N N Cl CH3COONa, DMSO N N CH3 H3C N N 5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole H Azathioprine 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tổng hợp oxalyl dimethylamine Phản ứng tổng hợp oxalyl dimethylamine dựa trên phản ứng giữa diethyl oxalate với dung dịch monomethylamine. Hiệu suất của phản ứng phụ thuộc nhiều vào nồng độ dung dịch monomethylamine và tỷ lệ mol giữa 2 tác nhân phản ứng. Bảng 1. Khảo sát điều kiện tổng hợp oxalyl dimethylamine. Nồng độ Tỷ lệ mol Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất Lần (%) amine (%) (amine/oxalate) o (C) (giờ) 1 30 2,0 0-5 4 51,95 2 30 2,5 0-5 4 65,86 3 33 2,0 0-5 4 54,52 4 33 2,5 0-5 4 70,99 5 40 2,0 0-5 4 61,45 6 40 2,5 0-5 4 81,87 Sản phẩm oxalyl dimethylamine thu được là chất rắn, màu trắng. IR (cm-1): 3311 cm-1 (νNH), 2943 cm-1 và 2806 cm-1 (νCH), 1660 cm-1 (νC=O amide), 1531 cm-1 (δNH), 1403 cm-1 (δCH). 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=7,59 ppm (s, 1H), δ=2,91 ppm (d, 3H, J 5,5 Hz). tonc=215-217 oC, TLC 01 điểm. Phổ 1H NMR rõ nét, không xuất hiện tín hiệu của tạp chất, do đó sản phẩm có độ tinh khiết cao. Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 11
Hóa học và Kỹ thuật môi trường 3.2. Kết quả tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate Từ sản phẩm oxalyl dimethylamine thu được ở giai đoạn trước, tiến hành phản ứng đóng vòng bằng tác nhân PCl5 trong dung môi POCl3 theo Wallach [5] sau đó tạo muối với acid nitric. Phản ứng tạo muối với acid nitric là rất cần thiết do muối tạo thành ở dạng rắn, màu trắng, dễ dàng phân lập so với các sản phẩm chưa tạo muối. Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp imidazole cho kết quả như trong bảng 2. Bảng 2. Khảo sát điều kiện tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate. Tỷ lệ mol Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất Lần Dung môi chiết o (PCl5/amine) (C) (h) (%) 1 1 Chloroform 28,34 60-70 3 2 1 Dichloromethane 32,86 60-70 3 3 2 Chloroform 40,94 60-70 3 4 2 Dichloromethane 46,59 60-70 3 5 3 Chloroform 41,93 60-70 3 6 3 Dichloromethane 47,11 60-70 3 Kết quả thu được cho thấy, việc chiết imidazole bằng dichloromethane cho hiệu suất cao hơn nhiều so với việc chiết bằng dung môi chloroform và tỷ lệ mol PCl5/oxalyl dimethylamine tối ưu là 2. Cơ chế đóng vòng imidazole như sau: Cl NCH3 Cl NCH3 Cl CH3 Cl CH3 CONHCH3 + N H N H CONHCH3 Cl N CH2 Cl N CH2 H H H H N N H Sản phẩm thu được là chất rắn, màu trắng. IR (cm-1): 3118 cm-1 (ν=CH), 2962, 2922 và 2852 cm-1 (νCH), 1641(δC=N), 1497 và 1452 cm-1 (νC=C thơm), 1358 cm-1 (δCH), 807 cm-1 (νC- Cl). Nhiệt độ nóng chảy 141-143 C. TLC 01 điểm. o 3.3. Kết quả tổng hợp 5-chloro-1-methyl-4-nitroimidazole Tiến hành phản ứng nitro hóa 5-chloro-1-methylimidazole nitrate trong dung môi acid acetic, xúc tác bởi acid sunfuric. Phản ứng xảy ra theo cơ chế thế electrophile (SE) vào nhân thơm. Lượng acid sulfuric sử dụng dư khoảng 6 lần so với nguyên liệu imidazole ban đầu sẽ cho hiệu suất tối ưu. Kéo dài thời gian phản ứng cho thấy hiệu suất phản ứng có xu hướng giảm dần. Sản phẩm thu được là chất rắn, màu trắng. Hiệu suất: 85,32 %. IR (cm-1): 3117 cm-1 (ν=CH), 1533 (νas NO2), 1510 và 1477 cm-1 (νC=C thơm), 1384 cm-1 (νs NO2), 827 cm-1 (νC-Cl); 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=7,97 ppm (s, 1H, H-2), δ=3,69 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ=141,2 ppm (C-4), 136,3 ppm (C-5), 119,7 ppm (C-2), 32,5 ppm (CH3). tonc= 148-150 oC, TLC 01 điểm. Phổ 1H NMR có đường nền bằng phẳng, không xuất hiện tín hiệu tạp chất, do đó có thể khẳng định sản phẩm có độ tinh khiết cao, được sử dụng để chuyển hóa ở giai đoạn cuối cùng. 3.4. Kết quả tổng hợp azathioprine Azathioprine được tổng hợp dễ dàng từ phản ứng của 5-chloro-1-methyl-4- nitroimidazole và 6-mercaptopurine khan trong dung môi DMSO, xúc tác bởi NaHCO3, 12 V. N. Toán, ..., Đ. M. Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.”
Nghiên cứu khoa học công nghệ CH3COONa hoặc K2CO3 khan. Nguyên liệu 6-mercaptopurine dạng thương mại tồn tại ở dạng hydrate hóa, cần chuyển hóa về dạng khan bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 140 oC trong khoảng 7-8 giờ, tính toán độ giảm khối lượng đến khối lượng không đổi. Bảng 3. Khảo sát ảnh hưởng của chất xúc tác tới hiệu suất tổng hợp azathioprine. Hiệu suất (%) Xúc tác Thời gian (h) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 81,55 81,89 81,63 81,69 ± 0,25 NaHCO3 5 85,83 85,13 85,25 85,40 ± 0,53 CH3COONa 5 78,95 78,46 78,49 78,63 ± 0,39 K2CO3 5 Kết tinh lại sản phẩm azathioprine trong một số dung môi như dung dịch amoniac, hệ dung môi acetone: nước (3:2) hoặc methanol để xác định hiệu suất thu hồi. Kết quả cho thấy, hiệu suất thu hồi lần lượt thu được là 92 %, 97 % và 94 % đối với 3 hệ dung môi trên. Sản phẩm sau kết tinh lại được lọc, hút và sấy khô trong tủ sấy ở 80 oC/12 giờ thu được sản phẩm azathioprine dạng vẩy, màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 243-245 oC, TCL xuất hiện 01 điểm. Công thức cấu tạo và đánh số trong công thức của azathioprine: 3 NO2 N 4 2 5 1N S 7' 1' 6' 5' N CH3 N 8' 2' N 4' N 9' 3' H Kết quả phân tích phổ NMR: - 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=13,74 ppm (s, 1H, NH), δ=8,58 ppm (s, 1H, H- 2’), δ=8,54 ppm (s, 1H, H-8’), δ=8,24 ppm (s, 1H, H-2), δ=3,70 ppm (s, 3H, N-CH3); - 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ=154,7 ppm (C-5’), δ=151,6 ppm (C-2’ và C-8’, chồng chập), δ=150,6 ppm (C-4’), δ=149,7 ppm (C-4), δ=144,4 ppm (C-6’), δ=139,4 ppm (C-2), δ=117,2 ppm (C-5), δ=32,9 ppm (N-CH3); - COSY: Không xuất hiện tương tác; - HSQC: 139,4 ppm (C-2) ↔ 8,58 (H-2’), 151,6 ppm (C-8’) ↔ 8,54 ppm (H-8’), 139,4 ppm (C-2) ↔ 8,24 ppm (H-2); - HMBC: 3,70 ppm (CH3) ↔ 149,7 ppm (C-4) và 117,2 ppm (C-5); 8,24 ppm (H-2) ↔ 150,6 ppm (C-4’) và 117,2 ppm (C-5). Kết quả phân tích phổ MS: Trên phổ ESI-MS xuất hiện pic ion “giả” phân tử có số khối m/z 278 ([M+H]+). Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 13
Hóa học và Kỹ thuật môi trường Hình 1. Phổ 1H NMR của hợp chất azathioprine. Hình 2. Phổ 13C NMR của hợp chất azathioprine. 4. KẾT LUẬN Bằng việc khảo sát các xúc tác khác nhau, chúng tôi đã tổng hợp thành công hợp chất azathioprine qua 4 giai đoạn với hiệu suất đạt 28,2 %. So với công bố của nhóm tác giả Yuan-Xiang Fu, quy trình tổng hợp azathioprine đưa ra có hiệu suất được cải thiện hơn đáng kể. Cấu trúc, độ sạch của các sản phẩm được xác nhận bằng các phương pháp vật lý hiện đại như IR, NMR, MS và tonc. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Athanasiou V. T. et al. (2010), “Historical comparison of autograft, allograft-DBM, xenograft and synthetic grafts in a trabecular bone defect: an experimental study in rabbits”, Med. Sci. Monit., 16 (1), pp. 24-31. [2]. Barker C. F., Markmann J. F. (2013), “Historical overview of transplantation”, Cold. Spring. Harb. Perspect. Med., 3 (4), pp. 1-19. [3]. Hitchings G. H., Yonkers (1962), Purine derivatives, US patent No. 3,056,785. [4]. Jean-Paul S. (2011), “The history of kidney transplantation: Past, Present and Future (With special references to the Belgian History)”, University of Liege, Belgium, 39 pages. 14 V. N. Toán, ..., Đ. M. Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.”
Nghiên cứu khoa học công nghệ [5]. Wallach O., Boehringer A. (1877), “Verhalten des Dimethylexamids”, Justus Liebig’s Annalen der Chemie, 184, pp. 50-57. [6]. Yuan-Xiang Fu et. al. (2009), “Method for producing azathioprine intermediate and product produced thereby”, CN patent No. 101486681B. ABSTRACT RESEARCH ON SYNTHESIS OF AZATHIOPRINE Azathioprine is approved by FDA for symptomatic treament of active rheumatoid arthritis. It also has approval as adjuncive therapy for the prevent of kidney transplant rejection. In this paper, the process of synthesis azathioprine through four steps, yield 28.2 % is introduced. Azathioprine exists in yellow crystalline form, melting point 243-245 oC. The products structure were determined by modern physical methods such as IR, NMR, MS spectra. Keywords: Azathioprine; Imidazole; Immunosuppressive; Allografts. Nhận bài ngày 30 tháng 7 năm 2020 Hoàn thiện ngày 18 tháng 8 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 24 tháng 8 năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Công nghệ mới/Viện KH-CN quân sự; 2 Khoa Hóa học/Trường Đại học Khoa học Tự nhiên/Đại học QGHN. *Email: vntoanchem@gmail.com. Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 15