Phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - hydroxylase

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2<br /> GÂY BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH<br /> THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE<br /> Vũ Chí Dũng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể<br /> thường gây nên do đột biến gen CYP21A2. Đột biến điểm là loại đột biến phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ khoảng<br /> 70 - 75%, đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn khoảng 20 - 25%. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu toàn<br /> diện nào tiến hành xác định đột biến xóa đoạn trên gen CYP21A2 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm<br /> sinh. Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên bệnh nhân<br /> tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. 56 bệnh nhân được chẩn đoán xác<br /> định bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - hydroxylase được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ<br /> thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) kết hợp với giải trình tự gen được sử dụng<br /> để phát hiện đột biến. Kết quả cho thấy 14/56 (25%) bệnh nhân đã được phát hiện có đột biến xóa đoạn gen<br /> CYP21A2, trong đó, 10/14 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3, 1/14 bệnh<br /> nhân có đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ gen C4B đến exon 8 gen CYP21A2 và 3 bệnh nhân có đột biến<br /> xóa đoạn dị hợp tử exon 1 - 3 kết hợp với đột biến điểm 656A > G hoặc R356W.<br /> Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn gen CYP21A2, MLPA<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu<br /> <br /> này dẫn đến các trình tự ở vùng gen giả<br /> <br /> enzym 21 - hydroxylase (21 - OH) là bệnh di<br /> <br /> (CYP21A1P) sẽ chuyển sang gen CYP21A2<br /> và dẫn đến các đột biến gây bệnh [3; 4].<br /> <br /> truyền lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh gây<br /> nên do đột biến gen CYP21A2 làm rối loạn<br /> quá trình sinh tổng hợp hormon vỏ thượng<br /> thận, gây bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy<br /> thượng thận cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy<br /> thì sớm giả ở trẻ trai [1, 2].<br /> Gen CYP21A2 mã hóa cho 21 - OH nằm<br /> trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3),<br /> gồm 10 exon, có kích thước 3.4 kb. Đột biến<br /> gây thiếu hụt 21 - OH là do sự bắt chéo không<br /> đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể trong<br /> quá trình phân bào giảm nhiễm. Sự bắt chéo<br /> <br /> Cho đến nay, nhiều dạng đột biến đã được<br /> phát hiện như đột biến điểm, đột biến xóa<br /> đoạn, trong đó đột biến điểm chiếm tỉ lệ cao<br /> nhất khoảng 70 - 75%, đột biến xóa đoạn<br /> chiếm tỉ lệ thấp hơn khoảng 20 - 25% [4; 5; 6].<br /> Kỹ thuật giải trình tự thường được áp dụng để<br /> xác định đột biến điểm gen CYP21A2 [4; 5; 6;<br /> 9]. Với đột biến xóa đoạn, có nhiều kỹ thuật<br /> xác định, tuy nhiên các phương pháp kinh<br /> điển như PCR thường bị hạn chế về mặt thời<br /> gian, kỹ thuật MLPA là kỹ thuật xác định đột<br /> biến xóa đoạn gen CYP21A2 nhanh chóng,<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: vankhanh73md@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 16/11/2015<br /> Ngày được chấp thuận: 26/02/2016<br /> <br /> 8<br /> <br /> chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi [7,<br /> 8]. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Xác<br /> định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên<br /> bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể<br /> thiếu hụt enzym 21-hydroxylase.<br /> <br /> TCNCYH 99 (1) - 2016<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng: 56 bệnh nhân tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 -<br /> <br /> 2oC trước khi cho 3µl hỗn hợp chứa các đoạn<br /> oligonucleotid của các probe. Hỗn hợp được ủ<br /> ở 60oC trong 16 giờ. Thêm 32µl hỗn hợp<br /> <br /> hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại<br /> <br /> ligase buffer, ủ ở 54oC trong 15 phút. Tăng<br /> nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút, giữ ở 4oC.<br /> <br /> Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh<br /> viện Nhi Trung ương.<br /> <br /> Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sản<br /> phẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ở<br /> <br /> Tiêu chuẩn chẩn đoán<br /> Bệnh nhân có biểu hiện mất muối, mất<br /> nước từ nhẹ đến nặng, Na+ giảm và K+ tăng;<br /> Biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái và<br /> dậy thì sớm ở trẻ trai. Nồng độ 17 - OH tăng<br /> trên 10.000 ng/dl ở thể cổ điển và tăng từ 20010.000 ng/dl ở thể không cổ điển [2].<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA<br /> DNA được tách chiết từ bạch cầu máu<br /> ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất<br /> cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng<br /> độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị<br /> 1,8-2,0 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được<br /> sử dụng để phân tích.<br /> 2.2. Kỹ thuật MLPA<br /> Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland). Thành phần của kit gồm các đầu dò<br /> <br /> 60oC trước khi thêm 10µl hỗn hợp PCR<br /> master vào hỗn hợp, thực hiện chu trình nhiệt<br /> sau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1<br /> phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; bảo quản ở<br /> 4oC. Điện di mao quản huỳnh quang trên máy<br /> giải trình tự để phân tích kết quả. Nếu có đột<br /> biến xóa đoạn, probe không gắn được vào<br /> gen đích, do đó kết quả điện di sẽ không xuất<br /> hiện đỉnh tương ứng tại exon đột biến. Đột<br /> biến dị hợp tử thì chiều cao đỉnh sẽ bằng 1/2<br /> so với mẫu đối chứng.<br /> 3. Kỹ thuật giải trình tự gen: được tiến<br /> hành theo quy trình đã mô tả trước đây [9].<br /> 4. Đạo đức nghiên cứu<br /> Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định<br /> về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh<br /> nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào<br /> nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền<br /> <br /> (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi<br /> <br /> rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp<br /> tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ<br /> <br /> đầu dò tương ứng với một vùng gen. Ngoài<br /> ra, còn có các đầu dò đặc trưng cho gen của<br /> <br /> được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để<br /> giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa<br /> <br /> người cũng được sử dụng để làm đối chứng<br /> và 2 đầu dò cho nhiễm sắc thể X và Y để xác<br /> <br /> chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin<br /> <br /> định giới tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được<br /> điện di mao quản trên máy giải trình tự. Số<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò<br /> <br /> Bằng kỹ thuật MLPA kết hợp với giải trình<br /> tự gen, 14/56(25%) bệnh nhân đã được phát<br /> <br /> sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA<br /> đích đặc hiệu với đầu dò đó.<br /> Quy trình MLPA<br /> Cho 5µl DNA vào 1 ống PCR, biến tính ở<br /> 98oC trong 5 phút. Nhiệt độ được chuyển về<br /> <br /> TCNCYH 99 (1) - 2016<br /> <br /> cá nhân được đảm bảo bí mật.<br /> <br /> hiện là có đột biến xóa đoạn gen CYP21A2<br /> trong đó:<br /> 10/14 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn<br /> đồng hợp tử exon 1 đến exon 3 (exon1-3<br /> deletion).<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 1 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn đồng<br /> <br /> exon 1 đến exon 3 kết hợp đột biến điểm<br /> <br /> hợp tử từ gen C4B đến exon 8 gen CYP21A2<br /> (C4B - exon 8 deletion).<br /> <br /> 656A > G và 1 bệnh nhân có đột biến xóa<br /> đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3 kết hợp đột<br /> <br /> 2 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử xóa đoạn<br /> <br /> biến điểm R356W trên gen CYP21A2.<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 của bệnh nhân<br /> Thể bệnh<br /> <br /> 21 - OH<br /> <br /> n<br /> <br /> Allele 1<br /> <br /> Allele 2<br /> <br /> Kiểu gen<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 0%<br /> <br /> 10<br /> <br /> Exon 1 - 3 deletion<br /> <br /> Exon 1 - 3 deletion<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> Nam hóa<br /> <br /> 3%<br /> <br /> 1<br /> <br /> Exon 1 - 3 deletion<br /> <br /> 656A > G<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 0%<br /> <br /> 1<br /> <br /> Exon 1 - 3 deletion<br /> <br /> 656A > G<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 0%<br /> <br /> 1<br /> <br /> Exon 1 - 3 deletion<br /> <br /> R356W<br /> <br /> Heterozygous<br /> <br /> Mất muối<br /> <br /> 0%<br /> <br /> 1<br /> <br /> C4B - exon 8 deletion<br /> <br /> C4B-exon 8 deletion<br /> <br /> Homozygous<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 14 bệnh nhân<br /> <br /> Bảng 1 cho thấy, các bệnh nhân có đột<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy, bệnh nhân mã số 01<br /> <br /> biến xóa đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến<br /> exon 3 và từ gen C4B đến exon gen<br /> <br /> không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với<br /> exon 1 đến exon 3, vì vậy, bệnh nhân có đột<br /> <br /> CYP21A2 đều được chẩn đoán là thể bệnh<br /> mất muối. Bên cạnh đó có 2 bệnh nhân có đột<br /> <br /> biến xóa đoạn từ exon 1 đến exon 3. Tương<br /> tự ở bệnh nhân mã số 08 không thấy xuất<br /> <br /> biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3<br /> kết hợp đột biến điểm 656A > G hoặc R356W<br /> <br /> hiện các đỉnh của gen C4B và các exon 1, 3,<br /> 4, 6, 8 của gen CYP21A2 vì vậy bệnh nhân có<br /> <br /> cũng được chẩn đoán là thể mất muối. Thể<br /> <br /> đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ gen C4B<br /> <br /> mất muối là thể bệnh nặng, biểu hiện bệnh<br /> sớm nên các bệnh nhân này hầu hết đều<br /> <br /> đến exon 8 trên gen CYP21A2 (hình 1).<br /> Kết quả hình 2 cho thấy bệnh nhân mã số<br /> <br /> được chẩn đoán ở thời điểm từ 2-6 tuần và<br /> enzym 21 - OH không được tổng hợp (21 -<br /> <br /> 03 có xuất hiện các đỉnh tương ứng với exon<br /> 1 đến exon 3, tuy nhiên chiều cao đỉnh của<br /> <br /> OH: 0%). Duy nhất có 1 bệnh nhân có đột<br /> biến xóa đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3<br /> <br /> exon 1 và exon 3 của bệnh nhân này chỉ bằng<br /> 1/2 so với mẫu đối chứng của người bình<br /> <br /> kết hợp đột biến điểm 656A > G được chẩn<br /> <br /> thường, chứng tỏ bệnh nhân có đột biến xóa<br /> <br /> đoán là thể nam hóa đơn thuần. Thể nam hóa<br /> đơn thuần là thể bệnh nhẹ hơn nên biểu hiện<br /> <br /> đoạn dị hợp tử exon 1 đến exon 3. Tiến hành<br /> giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 phát hiện<br /> <br /> bệnh muộn hơn và bệnh nhân này có hoạt độ<br /> enzym 21 - OH là 3%.<br /> <br /> thấy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử 656A<br /> > G kết hợp.<br /> <br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 99 (1) - 2016<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Kết quả bệnh nhân có đột biến xóa đoạn đồng hợp tử gen CYP21A2<br /> <br /> Hình 1. Kết quả đột biến xóa đoạn gen CYP21A2<br /> Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2;<br /> E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron2, và exon 10 của gen giả<br /> CYP21A1P; C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B; Y là đỉnh tương ứng với NST Y<br /> dùng để xác định giới tính. (1) Là hình ảnh tương ứng với kết quả người bình thường, (2) Là hình<br /> ảnh tương ứng với kết quả của bệnh nhân mã số 01 bị xóa đoạn exon 1 đến exon 3, (3) Là hình<br /> ảnh tương ứng với kết quả của bệnh nhân mã số 08 bị đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8<br /> gen CYP21A2.<br /> <br /> TCNCYH 99 (1) - 2016<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Kết quả bệnh nhân có đột biến xóa đoạn dị hợp tử gen CYP21A2 kết hợp với đột biến<br /> điểm<br /> <br /> A)<br /> A<br /> <br /> Ex3<br /> <br /> Người bình<br /> Người<br /> bìnhthường<br /> thường<br /> <br /> Ex3<br /> <br /> B)<br /> B<br /> <br /> Ex1<br /> <br /> Bệnh nhân<br /> Bệnh<br /> nhân<br /> <br /> Ex1<br /> <br /> 656A<br /> 656A<br /> <br /> 656A > G<br /> 656A>G<br /> <br /> Bệnh<br /> nhân<br /> Bệnh nhân<br /> <br /> Người<br /> thường<br /> Người bình<br /> bình thường<br /> <br /> Hình 1. Kết quả xác định đột biến gen CYP21A2<br /> (A) Kết quả MLPA: Ex1, Ex3, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, của gen CYP21A2;(B)<br /> kết quả giải trình tự gen: mũi tên chỉ vị trí đột biến 656A > C.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Nghiên cứu này đã sử dụng kỹ thuật MLPA<br /> <br /> đột biến xóa đoạn ở tất cả vị trí trên gen<br /> <br /> kết hợp với giải trình tự gen để xác định đột<br /> <br /> CYP21A2. Đây là ưu thế đặc biệt của MLPA<br /> mà các phương pháp kinh điển không có<br /> <br /> biến xóa đoạn gen cho 56 bệnh nhân tăng sản<br /> thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym<br /> 21 - OH, chỉ cần 1 phản ứng MLPA sẽ khuếch<br /> đại toàn bộ 10 exon của gen CYP21A2 [7; 8].<br /> Như vậy, trong vòng 2 ngày có thể xác định<br /> 12<br /> <br /> được. Bằng kỹ thuật MLPA,14/56 (25%) bệnh<br /> nhân đã được phát hiện đột biến xóa đoạn<br /> gen CYP21A2 với 4 dạng đột biến khác nhau,<br /> trong đó đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ<br /> TCNCYH 99 (1) - 2016<br /> <br />