Phân lập hai dẫn chất catechin từ sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> <br /> PHÂN LẬP HAI DẪN CHẤT CATECHIN TỪ SINH KHỐI<br /> TẾ BÀO THÔNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc.)<br /> Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương*; Nguyễn Minh Chính*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: chiết xuất và phân lập được các dẫn chất catechin. Phương pháp: chiết xuất<br /> phân đoạn, sắc ký cột, nhận dạng dựa vào các thông số lý hóa. Kết quả: đã phân lập được<br /> hai dẫn chất (+)-catechin (1) và (-)-epicatechin (2) từ dịch chiết methanol sinh khối Thông đỏ.<br /> Kết luận: hợp chất (-)-epicatechin lần đầu tiên được tìm thấy trong sinh khối tế bào của Taxus<br /> wallichiana Zucc.<br /> * Từ khóa: Thông đỏ; Taxus wallichiana; Sinh khối; (+)-catechin; (-)-epicatechin.<br /> <br /> Isolation of Two Catechin Derivatives from Cultured Cells of Taxus<br /> wallichiana Zucc.<br /> Summary<br /> Objectives: To isolate catechin derivatives. Methods: fractional extraction, column chromatography,<br /> structural elucidation based on physicochemical data. Results: Two compounds (+)-catechin (1)<br /> and (-)-epicatechin (2) were isolated from methanol extract of biomass of Taxus wallichiana.<br /> Conclusion: (-)-epicatechin was isolated from cultured cells of Taxus wallichiana for the first time.<br /> * Key words: Taxus wallichiana; Biomass; (+)-catechin; (-)-epicatechin.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, công nghệ sinh khối tế bào<br /> thực vật là hướng đi mới có nhiều triển<br /> vọng để sản xuất các hoạt chất từ dược<br /> liệu ở quy mô lớn [1]. Học viện Quân y<br /> đã và đang tiến hành nuôi cấy sinh<br /> khối tế bào Thông đỏ nhằm mục đích<br /> sản xuất paclitaxel và các dẫn chất dùng<br /> để điều trị ung thư [2]. Trong bài này,<br /> chúng tôi thông báo kết quả phân lập hai<br /> dẫn chất catechin trong sinh khối tế bào<br /> Thông đỏ.<br /> <br /> NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và thiết bị.<br /> * Nguyên vật liệu:<br /> Sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam<br /> thu được từ quá trình nuôi cấy trên môi<br /> trường lỏng SH (Học viện Quân y cung cấp,<br /> Lô SX 08/2010).<br /> * Hóa chất, thiết bị:<br /> - Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt Memmert<br /> GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG<br /> (Đức). Máy cất quay Rotavapor R-200, Buchi<br /> (Đức). Máy Fraction collector DC-1200 (Nhật).<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Trịnh Nam Trung (tntqy114@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/08/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 12/09/2016<br /> <br /> 19<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> - Sắc ký cột: sử dụng chất nhồi cột loại<br /> pha thuận là silica gel cỡ hạt 70 - 230 mesh<br /> (0,04 - 0,063 mm) và 230 - 400 mesh<br /> (0,063 - 0,200 mm) (Merck), loại pha đảo<br /> là YMC RP-18 resin cỡ hạt 30 - 50 µm<br /> (Fuji Silysia Chemical Ltd.).<br /> - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy<br /> Electrothermal 9100 (Anh).<br /> - Năng suất quay cực: đo trên máy Jasco<br /> DIP-370 (Nhật).<br /> - Phổ tử ngoại (UV): đo trên máy<br /> Speccord 40 (Đức).<br /> - Phổ hồng ngoại (IR): đo trên máy<br /> Hitachi-730-30 (Nhật).<br /> - Phổ khối lượng (ESI-MS): đo trên máy<br /> LC-MSD Agilent 6310 Ion Trap (Mỹ).<br /> - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):<br /> đo trên máy Bruker Avance 500 (Đức).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Chiết xuất, phân lập:<br /> Bột dược liệu khô được chiết siêu âm<br /> với methanol. Cắn thu được sau khi cất<br /> loại ethanol, hòa vào nước và chiết phân<br /> đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và<br /> n-butanol. Phân lập cắn ethyl acetat bằng<br /> sắc ký cột pha thuận với chất hấp phụ là<br /> silicagel. Tinh chế bằng sắc ký cột pha<br /> đảo lặp lại với chất hấp phụ YMC.<br /> * Xác định cấu trúc hóa học:<br /> Đo nhiệt độ nóng chảy chất phân lập,<br /> năng suất quay cực và ghi các loại phổ:<br /> phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR),<br /> phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ<br /> hạt nhân 1 chiều (1H-, 13C-NMR và DEPT).<br /> Cấu trúc hóa học của chất phân lập được<br /> xác định bằng cách so sánh với các dữ<br /> liệu đã công bố.<br /> 20<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả chiết xuất, phân lập.<br /> Xay nhỏ dược liệu (300 g) và chiết với<br /> methanol (1 lít x 3 lần) bằng thiết bị chiết<br /> siêu âm. Dịch methanol của các lần chiết<br /> được lọc, gom lại và cất loại dung môi ở<br /> nhiệt độ không quá 60oC dưới áp suất<br /> giảm, thu được 78 g cắn dịch ethanol.<br /> Hòa cắn này vào nước (tỷ lệ 1/1), lắc siêu<br /> âm và chiết phân đoạn lần lượt với các<br /> dung môi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol<br /> theo tỷ lệ 1/1 (3 lần), thu được các cắn<br /> dịch tương ứng là n-hexan (11 g), ethyl<br /> acetat (20 g), n-butanol (13 g) và nước<br /> (16 g).<br /> Tiến hành phân tách thô cắn ethyl acetat<br /> bằng sắc ký cột pha, thường sử dụng<br /> các thang nồng độ hệ dung môi rửa giải<br /> cloroform/methanol từ 100/1 đến 75/1, 50/1,<br /> 25/1, 10/1, 5/1, 3/1, 1/1, thu được 8 phân<br /> đoạn tương ứng. Rửa giải phân đoạn bằng<br /> cloroform/methanol 10/1 (1,5 g), tiến hành<br /> tinh chế với sắc ký cột lặp lại sử dụng chất<br /> hấp phụ pha đảo là YMC RP-18 và hệ<br /> dung môi rửa giải nước/methanol 1/1, thu<br /> được hợp chất 1 (75 mg) và hợp chất 2<br /> (24 mg) dưới dạng chất bột có màu trắng.<br /> 2. Kết quả nhận dạng các chất phân<br /> lập.<br /> Chất 1 và chất 2 được đo nhiệt độ nóng<br /> chảy, năng suất quay cực và ghi phổ UV,<br /> IR, ESI-MS và NMR. Kết quả cho thấy:<br /> - Chất 1: bột có màu trắng, nhiệt độ<br /> nóng chảy 173 - 175°C; năng suất quay<br /> 20<br /> <br /> cực [α] D + 21,5° (MeOH, c 0,4); UV (MeOH)<br /> <br /> λmax: 240 và 280 nm; IR (KBr) νmax 3.325<br /> (OH), 1.607; 1.519; 1.449 (C=C); 1.359;<br /> <br /> T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> 1.283; 1.141 cm-1; ESI-MS m/z 289 [M - H]–<br /> (C15H14O6, M = 290); 1H NMR (400 MHz,<br /> CD3OD) δ: 6,79 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2′);<br /> 6,71 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); 6,67 (1H, dd,<br /> J = 8,0, 1,9 Hz, H-6′); 5,88 (1H, d, J = 2,3<br /> Hz, H-6); 5,81 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8);<br /> 4,52 (1H, d, J = 7,3 Hz, H-2); 3,93 (1H, m,<br /> H-3); 2,80 (1H, dd, J = 16,2, 5,4 Hz, Ha-4);<br /> 2,46 (1H, dd, J = 16,2, 8,2 Hz, Hb-4); 13C<br /> NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 157,8 (C-9);<br /> 157,5 (C-5); 156,9 (C-7); 146,2 (C-3′);<br /> 146,2 (C-4′); 132,2 (C-1′); 120,0 (C-6′);<br /> 116,1 (C-5′); 115,2 (C-2′); 100,8 (C-10);<br /> 96,2 (C-6); 95,5 (C-8); 82,8 (C-2); 68,8 (C-3);<br /> 28,5 (C-4).<br /> - Chất 2: bột có màu trắng, nhiệt độ<br /> nóng chảy 230 - 232°C; năng suất quay<br /> 20<br /> <br /> cực [α] D -21,0° (MeOH, c 0,6); UV (MeOH)<br /> <br /> λmax: 240 và 280 nm; IR (KBr) νmax 3325<br /> (OH), 1.607; 1.519; 1.449 (C=C); 1.359;<br /> 1.283; 1.141 cm-1; EI-MS m/z 290 [M]<br /> (C15H14O6, M = 290); 1H NMR (400 MHz,<br /> CD3OD) δ: 6,93 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′);<br /> 6,73 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5′); 6,70 (1H, dd,<br /> J = 8,1, 2,0 Hz, H-6′); 5,90 (1H, d, J =<br /> 2,3 Hz, H-6); 5,89 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8);<br /> 4,76 (1H, s, H-2); 4,13 (1H, m, H-3); 2,69<br /> (1H, dd, J = 16,5, 3,2 Hz, Ha-4); 2,80 (1H,<br /> dd, J = 16,5, 4,6 Hz, Hb-4); 13C NMR (100<br /> MHz, CD3OD) δ: 158,0 (C-9); 157,6 (C-5);<br /> 157,3 (C-7); 145,9 (C-4′); 145,7 (C-3′);<br /> 132,3 (C-1′); 119,4 (C-6′); 115,9 (C-5′);<br /> 115,3 (C-2′); 100,0 (C-10); 96,4 (C-6);<br /> 95,9 (C-8); 79,8 (C-2); 67,5 (C-3); 29,2 (C-4).<br /> Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của<br /> hợp chất 2 cho tín hiệu cộng hưởng đặc<br /> trưng của một flavan-3-ol. Đơn vị C3 trong<br /> hệ thống C6-C3-C6 được thể hiện bằng<br /> các tín hiệu của một nhóm methylen<br /> <br /> [δH 2,69 (1H, dd, J = 16,5; 3,2 Hz, Ha-4);<br /> 2,80 (1H, dd, J = 16,5; 4,6 Hz, Hb-4) và<br /> δC 29,2 (CH2, C-4)] và hai nhóm methin<br /> gắn với oxygen [δH 4,76 (1H, s tù, H-2);<br /> 4,13 (1H, m, H-3) và δC 79,8 (CH, C-2);<br /> 67,5 (CH, C-3)].<br /> Ngoài ra, còn có các tín hiệu cộng<br /> hưởng của hai vòng benzen. Vòng A thể<br /> hiện các tín hiệu đặc trưng của nhân benzen<br /> thuộc hệ thống benzopyran [δH 5,90 (1H, d,<br /> J = 2,3 Hz, H-6); 5,89 (1H, d, J = 2,3 Hz,<br /> H-8) và δC 157,6 (C-OH, C-5); 96,4 (CH,<br /> C-6); 157,3 (C-OH, C-7); 95,9 (CH, C-8);<br /> 158,0 (C-O, C-9); 100,0 (C, C-10)]. Vòng<br /> B thể hiện các tín hiệu đặc trưng của<br /> nhân benzen bị thế hai lần tại vị trí para<br /> và meta [δH 6,93 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′);<br /> 6,73 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5′); 6,70 (1H, dd,<br /> J = 8,1, 2,0 Hz, H-6′) và δC 132,3 (C, C-1′);<br /> 115,3 (CH, C-2′); 145,7 (C-OH, C-3′);<br /> 145,9 (C-OH, C-4′); 115,9 (CH, C-5′);<br /> 119,4 (CH, C-6′)].<br /> - Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và<br /> DEPT của 1 cho thấy hợp chất này có<br /> cấu trúc hóa học tương tự như 2, chỉ khác<br /> nhau ở vị trí carbon số 2 và 3 [δH 4,52<br /> (1H, d, J = 7,3 Hz, H-2); 3,93 (1H, m, H-3)<br /> và δC 82,8 (CH, C-2); 68,8 (CH, C-3)].<br /> 20<br /> <br /> Ngoài ra, năng suất quay cực ([α] D ) của<br /> 1 là +21,5° (MeOH, c 0,4), còn của 2 là<br /> -21,0° (MeOH, c 0,6). Cấu tạo của các<br /> chất phân lập được khẳng định bằng dữ<br /> liệu phổ EI-MS với píc ion giả phân tử m/z<br /> 289 [M - H]– (C15H14O6, M = 290) của 1 và<br /> píc ion phân tử m/z 290 [M] (C15 H14O6 ,<br /> M = 290) của 2.<br /> Từ các dữ liệu trên, kết hợp so sánh với<br /> số liệu đã công bố trong tài liệu tham khảo<br /> [3], có thể kết luận chất 1 là (+)-catechin,<br /> 21<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> chất 2 là (-)-epicatechin. (+)-catechin đã<br /> được chứng minh có trong sinh khối của<br /> Taxus wallichiana [4] và hai hợp chất này<br /> cũng đã tìm thấy trong sinh khối tế bào<br /> <br /> một số loài Taxus khác [5]. Tuy nhiên,<br /> đây là công bố đầu tiên về hợp chất (-)<br /> -epicatechin trong sinh khối tế bào của<br /> Taxus wallichiana Zucc.<br /> <br /> Hình 1: Công thức cấu tạo của các chất phân lập.<br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng các phương pháp sắc ký cột pha<br /> thuận (chất hấp phụ là silicagel) và pha<br /> đảo (chất hấp phụ là YMC), các hợp chất<br /> (+)-catechin (1) và (-)-epicatechin (2) đã<br /> được phân lập từ sinh khối tế bào Thông<br /> đỏ (Taxus wallichiana Zucc.). Cấu trúc<br /> hóa học của chất phân lập được xác định<br /> dựa vào phương pháp phổ cộng hưởng<br /> từ hạt nhân một chiều (1D NMR: 1H, 13CNMR và DEPT) và phổ khối lượng (MS).<br /> Hợp chất (-)-epicatechin lần đầu tiên được<br /> tìm thấy trong sinh khối tế bào của Taxus<br /> wallichiana Zucc.<br /> <br /> 2. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long,<br /> Hoàng Văn Lương, Nguyễn Tùng Linh, Sang<br /> Yo Byun. Nghiên cứu quy trình tạo callus<br /> Thông đỏ (Taxus wallichiana). Tạp chí Dược<br /> học. 2008, 9, tr.24-27.<br /> 3. Cai. Y, Evans. FJ, Roberts MF,<br /> Phillipson JD, Zenk MH, Gleba YY. Biological<br /> and chemical investigation of dragon's blood<br /> from Croton species of South America. Part 1.<br /> Polyphenolic compounds from croton lechleri.<br /> Phytochemistry. 1991, 30 (6), pp.2033-2040.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 4. Shipra Agrawal, Suchitra Banerjee,<br /> Sunil K Chattopadhyay, K V Shashidhar, Shiv<br /> Kumar Gupta, Sushil Kumar. Synthesis of (+)catechin penta-acetat by callus culture of<br /> Himalayan Yew, Taxus wallichiana Zucc.<br /> Indian Journal of Biotechnology. 2003, 222 (2),<br /> pp.264-267.<br /> <br /> 1. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long,<br /> Hoàng Văn Lương, Lê Bách Quang. Sinh khối<br /> tế bào thực vật, hướng mới trong sản xuất<br /> nguyên liệu làm thuốc. Tạp chí Thông tin Y<br /> Dược. 2008, 12, tr.6-9.<br /> <br /> 5. Bulgakov VP, Tchernoded GK, Veselova<br /> MV, Fedoreyev SA, Muzarok TI, Zhuravlev YN.<br /> Catechin production in cultured cells of Taxus<br /> cuspidata and Taxus baccata. Biotechnology<br /> Letters. 2011, 33 (9), pp.1879-1883.<br /> <br /> 22<br /> <br />