YOMEDIA
ADSENSE
Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)
46
lượt xem 3
download
lượt xem 3
download
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
Nghiên cứu đặt vấn đề - mục đích nghiên cứu về: Nhóm alkaloid của họ thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây thạch tùng dương phân bố nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo.
AMBIENT/
Chủ đề:
Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!
Nội dung Text: Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
PHÂN LẬP HUPERZININ TỪ CÂY THẠCH TÙNG DƯƠNG<br />
(LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE)<br />
Nguyễn Ngọc Chương*, Trần Công Luận**<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Nhóm alkaloid của họ Thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà<br />
khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây Thạch tùng dương phân bố nhiều ở<br />
các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp<br />
theo.<br />
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi Diaion HP-20 và sắc ký cột<br />
cổ điển trong quy trình phân lập alkaloid của cây Thạch tùng dương. Thực hiện các phương pháp đo phổ UV, phổ<br />
hồng ngoại, điểm chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được.<br />
Kết quả: Sử dụng hai phương pháp sắc ký trao đổi ion và phương pháp sắc ký cột cổ điển rất thuận lợi để<br />
phân lập được Huperzinin trong cây Thạch tùng dương.<br />
Kết luận: Kết quả của đề tài là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu phân lập các alkaloid thạch tùng và các thử<br />
nghiệm sinh học tiếp theo.<br />
Từ khóa: Họ Thạch tùng, Thạch tùng dương, Huperzinin, alkaloid trong họ Thạch tùng.<br />
<br />
ABSTRACT<br />
ISOLATION HUPERZININE FROM LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE<br />
Nguyen Ngoc Chuong, Tran Cong Luan<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 191 - 196<br />
Background - Objectives: Lycopodium alkaloids have attracted great attention from scientists in the<br />
world. Lycopodium casuarinoides, a member of Lycopodiaceae, widely distributes in the Highland Central of<br />
Viet Nam. Studying on isolation of lycopodium alkaloids from this species would have contributed to<br />
subsequent biological tests.<br />
Methods: Ion exchange chromatography with Diaion Hry P-20 and column chromatography were used<br />
in alkaloid extraction and isolation processes from Lycopodium casuarinoide. The chemical structure of<br />
isolated compound was elucidated by UV spectrum, infrared spectrum, melting points, nuclear magnetic<br />
resonance spectrum.<br />
Results: Both two methods of ion exchange chromatography and column chromatography method are very<br />
useful for isolation Huperzinine from Lycopodium casuarinoide.<br />
Conclusion: The results of this research would have contributed to subsequent isolation study of other<br />
lycopodium alkaloids and biological testing.<br />
Keywords: Lycopodiaceae, Lycopodium casuarinoides, Huperzinine, lycopodium alkaloids.<br />
Thạch tùng có khung cấu trúc cơ bản là<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
lycodin, lycopodin, fawcettimin và nhóm có<br />
Những hợp chất tự nhiên alkaloid của họ<br />
* Khoa Y học Cổ Truyền – Đại học Y Dược Tp. HCM<br />
** Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu<br />
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Ngọc Chương ĐT: 0913649750<br />
Email: chuong0911@yahoo.com<br />
<br />
Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />
<br />
191<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br />
<br />
cấu trúc khác. Vào năm 1986, khi tác giả Liu và<br />
cộng sự đã phát hiện ra khả năng ức chế<br />
enzyme acetylcholinesterase của huperzin A<br />
và huperzin B phân lập từ cây Thạch tùng<br />
răng thì các alkaloid của họ Thạch tùng đã và<br />
đang được quan tâm của nhiều nhà khoa học<br />
nghiên cứu phân lập, thử tác dụng sinh học và<br />
tổng hợp hữu cơ. Hàng loạt các công trình<br />
nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới về các<br />
cây thuộc họ Thạch tùng đã được công bố<br />
trong thời gian gần đây(1,2,6).<br />
Ở nước ta, có nhiều loài trong họ Thạch tùng<br />
được tìm thấy ở các vùng núi cao thuộc các tỉnh<br />
Tây Nguyên nhưng chưa được nghiên cứu,<br />
trong đó có cây Thạch tùng dương (3,5). Để góp<br />
phần nghiên cứu phân lập các hợp chất tự nhiên<br />
của loài này, làm cơ sở để thực hiện nghiên cứu<br />
tác dụng sinh học về sau, chúng tôi tiến hành<br />
nghiên cứu phân lập alkaloid trong cây Thạch<br />
tùng dương.<br />
<br />
NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br />
Nguyên liệu<br />
Toàn cây Thạch tùng dương (Lycopodium<br />
casuarinoides Spring, Lycopodiaceae) được thu<br />
hái ở rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm<br />
Đồng, rửa sạch, phơi khô âm can, tán thành<br />
bột thô.<br />
<br />
Hóa chất và trang thiết bị<br />
Hóa chất - dung môi<br />
Dicloromethan, cloroform, methanol, ethyl<br />
acetat,<br />
diethyl<br />
ether,<br />
aceton, n-hexan,<br />
isopropanol (Trung Quốc), NH4OH, HCl 5%<br />
NaOH 1N (Việt Nam), thuốc thử Dragendorff.<br />
Trang thiết bị<br />
Bản mỏng silica gel 60 F254, silica gel cỡ hạt<br />
40-63 µm (Merck, Đức). Diaion loại hạt HP-20 do<br />
hãng Misubishi (Nhật) sản xuất. Cân phân tích<br />
Satorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật), bếp cách thủy<br />
Memmert WB.14 (Đức), máy cô quay buchi R300<br />
(Thụy sỹ), máy siêu âm Sanorex RK510 H<br />
(Pháp), máy đo phổ hồng ngoại FTIR - 820PC<br />
Bruker, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker<br />
<br />
192<br />
<br />
AV 500 (500 MHz), máy soi UV hai bước sóng<br />
254 nm và 365 nm Vilber Lourmat (Pháp), máy<br />
quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu (Nhật).<br />
<br />
Phương pháp nghiên cứu<br />
Nghiên cứu thực vật học<br />
Nguyên liệu là toàn cây Thạch tùng dương<br />
tươi, có đầy đủ rễ, thân, lá được thu hái ở rừng<br />
Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng. Mẫu thu<br />
thập được chụp hình và ghi nhận đặc tính sinh<br />
thái. Kết hợp với các đặc điểm về hình thái, sử<br />
dụng tài liệu tham khảo thực vật học chuyên<br />
ngành, để định danh chính xác tên khoa học của<br />
loài nghiên cứu.<br />
Nguyên liệu được cắt nhỏ, phơi khô trong<br />
bóng râm, và xay bột dùng để soi bột, nghiên<br />
cứu sơ bộ thành phần hóa học hóa học, thử<br />
tinh khiết.<br />
<br />
Chiết xuất<br />
10 kg bột thô Thạch tùng dương được làm<br />
ẩm bằng methanol, cho vào bình ngấm kiệt, chiết<br />
kiệt alkaloid bằng methanol. Cô dịch chiết dưới<br />
áp suất giảm, cắn thu được chiết tiếp tục hòa tan<br />
với acid HCl 5%, lọc thu dịch acid, dịch này<br />
được lắc với diethyl ether để loại tạp chất kém<br />
phân cực, sau đó kiềm hóa bằng NH4OH đến<br />
pH=10 thu được dịch alkaloid toàn phần.<br />
<br />
Phân lập và tinh chế<br />
Sắc ký cột trao đổi ion<br />
Dịch alkaloid toàn phần được nạp vào cột<br />
Diaion HP 20. Sau đó, lần lượt cho các dung<br />
môi nước khử ion, methanol 20%, methanol<br />
100%, dicloromethan. Phân đoạn methanol<br />
100% và dicloromethan được cô đến cắn thu<br />
được hai phân đoạn alkaloid. Kiểm tra các<br />
phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung<br />
môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện<br />
bằng đèn UV 254 nm và thước thử<br />
Dragendorff.<br />
Sắc ký cột cổ điển<br />
Cột thủy tinh (6 x 70 cm), pha tĩnh silica gel<br />
cỡ hạt 40-63 µm, nạp mẫu ướt bằng cách hòa tan<br />
mẫu vừa đủ với dicloromethan, mẫu nạp là<br />
<br />
Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br />
phân đoạn methanol 100%. Pha động ban đầu<br />
triển khai bằng dung môi dicloromethan, sau đó<br />
tăng dần thể tích methanol đến tỉ lệ<br />
dicloromethan:methanol (90:10), thể tích hứng<br />
mỗi lần 100 ml, tốc độ 2 ml/phút. Kiểm tra các<br />
phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung<br />
môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện<br />
bằng đèn UV 254 nm và thuốc thử Dragendorff.<br />
<br />
Kiểm tra độ tinh khiết<br />
Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp<br />
sắc ký lớp mỏng, triển khai bản mỏng bằng ba hệ<br />
dung môi có độ phân cực khác nhau. Sắc ký đồ<br />
của chất tinh khiết phải cho một vết gọn duy<br />
nhất khi soi dưới đèn UV 254 nm và có màu cam<br />
với thuốc thử Dragendorff.<br />
Đo điểm chảy<br />
<br />
Thân lưỡng phân đều<br />
<br />
Lá<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo<br />
điểm chảy.<br />
<br />
Đo phổ UV Xác định cấu trúc<br />
Dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt<br />
nhân 1 chiều và 2 chiều.<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br />
Thực vật học<br />
Đặc điểm hình thái<br />
Cây thảo mọc bò trên mặt đất hoặc trên cây khác;<br />
thân cứng, dài, thân chính rộng khoảng 3 mm,<br />
lưỡng phân đều; lá hình kim hay dải nhọn,<br />
không cuống, ở thân chính lá nhỏ và mọc thưa, ở<br />
nhánh lá mọc dày và lớn hơn. Lá sinh sản khác lá<br />
thường và tập trung thành bông bào tử ở đỉnh<br />
nhánh, dạng chùy. Túi bào tử hình thận.<br />
<br />
Bông bào tử Lá<br />
<br />
Rễ<br />
<br />
Hình 1. Đặc điểm hình thái Thạch tùng dương<br />
<br />
Đặc điểm vi phẫu<br />
<br />
A<br />
<br />
B<br />
<br />
C<br />
<br />
Hình 2.Vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dương<br />
<br />
Vi phẫu rễ<br />
Vi phẫu rễ Thạch tùng dương có tiết diện<br />
tròn hoặc gần tròn. Cấu tạo từ ngoài vào trong<br />
<br />
Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />
<br />
gồm lớp ngoại bì mang lông hút, vòng đai mô<br />
cứng hóa sợi, vùng tủy chứa libe và gỗ xếp xen<br />
kẽ (phân hóa chưa rõ rệt).<br />
<br />
193<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Vi phẫu thân<br />
Vi phẫu thân Thạch tùng dương có tiết<br />
diện tròn hoặc gần tròn, có nhiều rãnh. Cấu<br />
tạo từ ngoài vào trong gồm lớp biểu bì, mô<br />
mềm vỏ, mô mềm có vách hóa gỗ, một số bó<br />
dẫn phụ nằm trong vùng mô mềm vỏ, vòng<br />
đai mô cứng bao quanh vùng tủy, vùng tủy<br />
gồm libe và gỗ xếp khá đặc sắc, gỗ ở giữa xếp<br />
thành dãy.<br />
<br />
Bào tử<br />
<br />
Đặc điểm bột dược liệu<br />
Cảm quan: Bột màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ.<br />
Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Biểu bì<br />
mang lỗ khí, mảnh mô mềm, mảnh nhựa, bào tử,<br />
sợi, mạch vạch, mạch xoắn.<br />
<br />
Biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm Mảnh nhựa<br />
<br />
Hình 3. Đặc điểm bột dược liệu Thạch tùng dương<br />
<br />
Kết quả đo độ ẩm, độ tro và hàm lượng chất<br />
chiết được<br />
Bảng 1. Độ ẩm của Thạch tùng dương<br />
Lần đo<br />
Độ ẩm (%)<br />
<br />
Lần 1 Lần 2 Lần 3<br />
8,68 8,47 8,30<br />
<br />
Trung bình<br />
8,48<br />
<br />
Bảng 2. Độ tro của Thạch tùng dương<br />
Lần đo<br />
<br />
4,30<br />
<br />
3,83<br />
<br />
Trung<br />
bình<br />
3,98<br />
<br />
0,15<br />
<br />
0,12<br />
<br />
0,13<br />
<br />
Lần 1 Lần 2 Lần 3<br />
<br />
Độ tro toàn phần (%)<br />
3,81<br />
Độ tro không tan trong HCl<br />
0,13<br />
(%)<br />
<br />
Bảng 3. Hàm lượng chất chiết được của Thạch tùng<br />
dương<br />
Lần đo<br />
<br />
19,20<br />
<br />
Trung<br />
bình<br />
19,20<br />
<br />
18,60<br />
<br />
18,55<br />
<br />
Lần 1 Lần 2 Lần 3<br />
<br />
Chiết lạnh với nước (%) 19,10 19,25<br />
Chiết lạnh với methanol<br />
18,35 18,65<br />
(%)<br />
<br />
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật<br />
Sơ bộ định tính thành phần hóa thực vật của<br />
cây Thạch tùng dương gồm có triterpenoid tự<br />
do, alkaloid, coumarin, saponin, acid hữu cơ và<br />
chất khử.<br />
<br />
Kết quả các phân đoạn từ cột Diaion HP-20<br />
Trong các phân đoạn thu được từ cột Diaion<br />
HP-20 chỉ có phân đoạn methanol 100% (6,6g) và<br />
<br />
194<br />
<br />
Vi phẫu lá<br />
Vi phẫu lá Thạch tùng dương có cấu tạo từ<br />
ngoài vào trong gồm lớp biểu bì mang lỗ khí, mô<br />
mềm giậu, vùng tủy gồm bó dẫn chưa phân hóa,<br />
xung quanh có tế bào tẩm mộc tố.<br />
<br />
Mạch vạch<br />
<br />
Mạch xoắn<br />
<br />
dicloromethan (0,7g) dương tính với thuốc thử<br />
Dragendroff. Phân đoạn nước và methanol 20%<br />
không có alkaloid.<br />
Chuẩn bị mẫu: 6,6 g cắn alkaloid thu được từ<br />
phân đoạn methanol 100% được hòa tan với<br />
lượng vừa đủ với dichloromethan, nạp mẫu ướt<br />
vào cột sắc ký (6 x70 cm). Pha tĩnh khoảng 450 g<br />
sillicagel hạt vừa (kích thước 0,040-0,063 mm).<br />
Nhồi cột và ổn định cột khoảng 2 giờ bằng dung<br />
môi dicloromethan. Khai triển cột với hệ dung<br />
môi CH2Cl2-MeOH có tỷ lệ thay đổi từ 100:0 đến<br />
80:20. Tốc độ 2ml/ phút. Thể tích hứng 100 ml.<br />
Kết quả thu được 8 phân đoạn bao gồm các<br />
alkaloid khác nhau.<br />
Phân đoạn I sau khi cô thu hồi dung môi,<br />
trên bình cầu xuất hiện các tinh thể màu vàng<br />
nhạt, tinh thể này được rửa bằng aceton và kết<br />
tinh lại bằng aceton-methanol (1:1). Tái kết<br />
tinh lại nhiều lần đến khi thu được tinh thể<br />
không màu, đặt tên là HT1. Kết quả thu được<br />
1,07g HT1.<br />
<br />
Kiểm tra độ tinh khiết chất HT1<br />
Tiến hành triển khai SKLM với các hệ dung<br />
môi khác nhau, phát hiện bằng soi đèn UV 254<br />
nm, 365 nm, thuốc thử Dragendorff. Hình 1 cho<br />
thấy HT1 là một chất tinh khiết.<br />
<br />
Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br />
<br />
CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,5)<br />
<br />
UV 254<br />
<br />
UV 365<br />
<br />
TT Dragedorff<br />
<br />
EtOAc-MeOH-H2O-NH3<br />
(100:13,5:10:0,5)<br />
<br />
UV 254<br />
<br />
UV 365<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
n-hexan-EtOAc-NH<br />
(40:60:0,5)<br />
<br />
TT Dragedorff<br />
<br />
UV 254<br />
<br />
UV 365<br />
<br />
TT Dragedorff<br />
<br />
Hình 4: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của HT1<br />
<br />
Xác định cấu trúc HT1<br />
HT1 kết tinh dạng tinh thể hình kim không<br />
màu, dễ tan trong CH3Cl3, CH2Cl2, MeOH; cho<br />
màu cam bền với thuốc thử Dragendorff.<br />
<br />
Phổ IR của HT1.<br />
Các băng hấp thụ ở 1660, 1619, 1554 cho thấy<br />
HT1 có tín hiệu của nhóm ceton, nối đôi ở<br />
carbon α-β.<br />
Phổ MS của HT1.<br />
Phổ LC MS (ESI+) có mảnh chính m/z = 271,25<br />
cho thấy [M+H]+ = 271,25 và dạng dimer [2M+H]+<br />
= 541,31. Do đó HT1 có khối lượng phân tử<br />
tương đương 270, tương ứng với công thức phân<br />
tử là C17H22N2O (Ω=8)<br />
<br />
3 nhóm methylen, gồm: 2 nhóm -CH2- sp3 (δC<br />
29,152 và 44,469 ppm), 1 nhóm =CH2 sp2 (δC<br />
116,258 ppm)<br />
6 nhóm methin, gồm: 2 nhóm >CH- sp3(δC<br />
38,808 và 45,840); 4 nhóm =CH- sp2 (δC 117,624;<br />
124,479; 140,221 và 142,433 ppm)<br />
5 nhóm Carbon bậc 4, gồm: 1 nhóm –NHC=O (δC 165,119 ppm); 3 nhóm >C= sp2 (δC<br />
118,723; 134,315 và 142,823 ppm); 1 nhóm >C-N<<br />
(δC 59,888 ppm)<br />
Từ các dữ liệu phân tích được, định hướng<br />
HT1 về hợp chất huperzinin<br />
16<br />
15<br />
8<br />
<br />
Phổ UV của HT1<br />
Phổ UV trong MeOH của HT1 cho cực đại<br />
hấp thu tại 229,50 nm và 308,00 nm.<br />
Phổ NMR của HT1.<br />
Phổ 13C-NMR cho 16 tín hiệu carbon. Phổ<br />
1H-NMR lấy tích phân cho 22 nguyên tử hydro.<br />
Phổ NMR cho thấy sự hiện diện của 16<br />
nhóm tín hiệu carbon, trong đó có 1 tín hiệu của<br />
của 2 carbon tương đương, bao gồm:<br />
3 nhóm methyl, gồm: 1 CH3-C= (δC 22,849<br />
ppm); 1nhóm (CH3)2-N (δC 39,512 ppm)<br />
<br />
Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br />
<br />
14<br />
7<br />
<br />
H<br />
10<br />
<br />
12<br />
11<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
13<br />
<br />
N<br />
<br />
H<br />
N<br />
<br />
4<br />
<br />
1<br />
3<br />
<br />
O<br />
<br />
2<br />
<br />
Hình 5. Công thức phân tử huperzinin.<br />
Các kết quả của phổ NMR 1 chiều và 2 chiều<br />
đã chứng minh alkaloid HT1 là huperzinin.<br />
<br />
195<br />
<br />
ADSENSE
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
Thêm tài liệu vào bộ sưu tập có sẵn:
Báo xấu
LAVA
AANETWORK
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Chịu trách nhiệm nội dung:
Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA
LIÊN HỆ
Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM
Hotline: 093 303 0098
Email: support@tailieu.vn