intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

46
lượt xem
3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu đặt vấn đề - mục đích nghiên cứu về: Nhóm alkaloid của họ thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây thạch tùng dương phân bố nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÂN LẬP HUPERZININ TỪ CÂY THẠCH TÙNG DƯƠNG<br /> (LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE)<br /> Nguyễn Ngọc Chương*, Trần Công Luận**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Nhóm alkaloid của họ Thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà<br /> khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây Thạch tùng dương phân bố nhiều ở<br /> các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp<br /> theo.<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi Diaion HP-20 và sắc ký cột<br /> cổ điển trong quy trình phân lập alkaloid của cây Thạch tùng dương. Thực hiện các phương pháp đo phổ UV, phổ<br /> hồng ngoại, điểm chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được.<br /> Kết quả: Sử dụng hai phương pháp sắc ký trao đổi ion và phương pháp sắc ký cột cổ điển rất thuận lợi để<br /> phân lập được Huperzinin trong cây Thạch tùng dương.<br /> Kết luận: Kết quả của đề tài là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu phân lập các alkaloid thạch tùng và các thử<br /> nghiệm sinh học tiếp theo.<br /> Từ khóa: Họ Thạch tùng, Thạch tùng dương, Huperzinin, alkaloid trong họ Thạch tùng.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ISOLATION HUPERZININE FROM LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE<br /> Nguyen Ngoc Chuong, Tran Cong Luan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 191 - 196<br /> Background - Objectives: Lycopodium alkaloids have attracted great attention from scientists in the<br /> world. Lycopodium casuarinoides, a member of Lycopodiaceae, widely distributes in the Highland Central of<br /> Viet Nam. Studying on isolation of lycopodium alkaloids from this species would have contributed to<br /> subsequent biological tests.<br /> Methods: Ion exchange chromatography with Diaion Hry P-20 and column chromatography were used<br /> in alkaloid extraction and isolation processes from Lycopodium casuarinoide. The chemical structure of<br /> isolated compound was elucidated by UV spectrum, infrared spectrum, melting points, nuclear magnetic<br /> resonance spectrum.<br /> Results: Both two methods of ion exchange chromatography and column chromatography method are very<br /> useful for isolation Huperzinine from Lycopodium casuarinoide.<br /> Conclusion: The results of this research would have contributed to subsequent isolation study of other<br /> lycopodium alkaloids and biological testing.<br /> Keywords: Lycopodiaceae, Lycopodium casuarinoides, Huperzinine, lycopodium alkaloids.<br /> Thạch tùng có khung cấu trúc cơ bản là<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> lycodin, lycopodin, fawcettimin và nhóm có<br /> Những hợp chất tự nhiên alkaloid của họ<br /> * Khoa Y học Cổ Truyền – Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> ** Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Ngọc Chương ĐT: 0913649750<br /> Email: chuong0911@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 191<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> cấu trúc khác. Vào năm 1986, khi tác giả Liu và<br /> cộng sự đã phát hiện ra khả năng ức chế<br /> enzyme acetylcholinesterase của huperzin A<br /> và huperzin B phân lập từ cây Thạch tùng<br /> răng thì các alkaloid của họ Thạch tùng đã và<br /> đang được quan tâm của nhiều nhà khoa học<br /> nghiên cứu phân lập, thử tác dụng sinh học và<br /> tổng hợp hữu cơ. Hàng loạt các công trình<br /> nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới về các<br /> cây thuộc họ Thạch tùng đã được công bố<br /> trong thời gian gần đây(1,2,6).<br /> Ở nước ta, có nhiều loài trong họ Thạch tùng<br /> được tìm thấy ở các vùng núi cao thuộc các tỉnh<br /> Tây Nguyên nhưng chưa được nghiên cứu,<br /> trong đó có cây Thạch tùng dương (3,5). Để góp<br /> phần nghiên cứu phân lập các hợp chất tự nhiên<br /> của loài này, làm cơ sở để thực hiện nghiên cứu<br /> tác dụng sinh học về sau, chúng tôi tiến hành<br /> nghiên cứu phân lập alkaloid trong cây Thạch<br /> tùng dương.<br /> <br /> NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Toàn cây Thạch tùng dương (Lycopodium<br /> casuarinoides Spring, Lycopodiaceae) được thu<br /> hái ở rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm<br /> Đồng, rửa sạch, phơi khô âm can, tán thành<br /> bột thô.<br /> <br /> Hóa chất và trang thiết bị<br /> Hóa chất - dung môi<br /> Dicloromethan, cloroform, methanol, ethyl<br /> acetat,<br /> diethyl<br /> ether,<br /> aceton, n-hexan,<br /> isopropanol (Trung Quốc), NH4OH, HCl 5%<br /> NaOH 1N (Việt Nam), thuốc thử Dragendorff.<br /> Trang thiết bị<br /> Bản mỏng silica gel 60 F254, silica gel cỡ hạt<br /> 40-63 µm (Merck, Đức). Diaion loại hạt HP-20 do<br /> hãng Misubishi (Nhật) sản xuất. Cân phân tích<br /> Satorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật), bếp cách thủy<br /> Memmert WB.14 (Đức), máy cô quay buchi R300<br /> (Thụy sỹ), máy siêu âm Sanorex RK510 H<br /> (Pháp), máy đo phổ hồng ngoại FTIR - 820PC<br /> Bruker, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker<br /> <br /> 192<br /> <br /> AV 500 (500 MHz), máy soi UV hai bước sóng<br /> 254 nm và 365 nm Vilber Lourmat (Pháp), máy<br /> quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu (Nhật).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Nghiên cứu thực vật học<br /> Nguyên liệu là toàn cây Thạch tùng dương<br /> tươi, có đầy đủ rễ, thân, lá được thu hái ở rừng<br /> Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng. Mẫu thu<br /> thập được chụp hình và ghi nhận đặc tính sinh<br /> thái. Kết hợp với các đặc điểm về hình thái, sử<br /> dụng tài liệu tham khảo thực vật học chuyên<br /> ngành, để định danh chính xác tên khoa học của<br /> loài nghiên cứu.<br /> Nguyên liệu được cắt nhỏ, phơi khô trong<br /> bóng râm, và xay bột dùng để soi bột, nghiên<br /> cứu sơ bộ thành phần hóa học hóa học, thử<br /> tinh khiết.<br /> <br /> Chiết xuất<br /> 10 kg bột thô Thạch tùng dương được làm<br /> ẩm bằng methanol, cho vào bình ngấm kiệt, chiết<br /> kiệt alkaloid bằng methanol. Cô dịch chiết dưới<br /> áp suất giảm, cắn thu được chiết tiếp tục hòa tan<br /> với acid HCl 5%, lọc thu dịch acid, dịch này<br /> được lắc với diethyl ether để loại tạp chất kém<br /> phân cực, sau đó kiềm hóa bằng NH4OH đến<br /> pH=10 thu được dịch alkaloid toàn phần.<br /> <br /> Phân lập và tinh chế<br /> Sắc ký cột trao đổi ion<br /> Dịch alkaloid toàn phần được nạp vào cột<br /> Diaion HP 20. Sau đó, lần lượt cho các dung<br /> môi nước khử ion, methanol 20%, methanol<br /> 100%, dicloromethan. Phân đoạn methanol<br /> 100% và dicloromethan được cô đến cắn thu<br /> được hai phân đoạn alkaloid. Kiểm tra các<br /> phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung<br /> môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện<br /> bằng đèn UV 254 nm và thước thử<br /> Dragendorff.<br /> Sắc ký cột cổ điển<br /> Cột thủy tinh (6 x 70 cm), pha tĩnh silica gel<br /> cỡ hạt 40-63 µm, nạp mẫu ướt bằng cách hòa tan<br /> mẫu vừa đủ với dicloromethan, mẫu nạp là<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> phân đoạn methanol 100%. Pha động ban đầu<br /> triển khai bằng dung môi dicloromethan, sau đó<br /> tăng dần thể tích methanol đến tỉ lệ<br /> dicloromethan:methanol (90:10), thể tích hứng<br /> mỗi lần 100 ml, tốc độ 2 ml/phút. Kiểm tra các<br /> phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung<br /> môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện<br /> bằng đèn UV 254 nm và thuốc thử Dragendorff.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết<br /> Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp<br /> sắc ký lớp mỏng, triển khai bản mỏng bằng ba hệ<br /> dung môi có độ phân cực khác nhau. Sắc ký đồ<br /> của chất tinh khiết phải cho một vết gọn duy<br /> nhất khi soi dưới đèn UV 254 nm và có màu cam<br /> với thuốc thử Dragendorff.<br /> Đo điểm chảy<br /> <br /> Thân lưỡng phân đều<br /> <br /> Lá<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo<br /> điểm chảy.<br /> <br /> Đo phổ UV Xác định cấu trúc<br /> Dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt<br /> nhân 1 chiều và 2 chiều.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Thực vật học<br /> Đặc điểm hình thái<br /> Cây thảo mọc bò trên mặt đất hoặc trên cây khác;<br /> thân cứng, dài, thân chính rộng khoảng 3 mm,<br /> lưỡng phân đều; lá hình kim hay dải nhọn,<br /> không cuống, ở thân chính lá nhỏ và mọc thưa, ở<br /> nhánh lá mọc dày và lớn hơn. Lá sinh sản khác lá<br /> thường và tập trung thành bông bào tử ở đỉnh<br /> nhánh, dạng chùy. Túi bào tử hình thận.<br /> <br /> Bông bào tử Lá<br /> <br /> Rễ<br /> <br /> Hình 1. Đặc điểm hình thái Thạch tùng dương<br /> <br /> Đặc điểm vi phẫu<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 2.Vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dương<br /> <br /> Vi phẫu rễ<br /> Vi phẫu rễ Thạch tùng dương có tiết diện<br /> tròn hoặc gần tròn. Cấu tạo từ ngoài vào trong<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> gồm lớp ngoại bì mang lông hút, vòng đai mô<br /> cứng hóa sợi, vùng tủy chứa libe và gỗ xếp xen<br /> kẽ (phân hóa chưa rõ rệt).<br /> <br /> 193<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Vi phẫu thân<br /> Vi phẫu thân Thạch tùng dương có tiết<br /> diện tròn hoặc gần tròn, có nhiều rãnh. Cấu<br /> tạo từ ngoài vào trong gồm lớp biểu bì, mô<br /> mềm vỏ, mô mềm có vách hóa gỗ, một số bó<br /> dẫn phụ nằm trong vùng mô mềm vỏ, vòng<br /> đai mô cứng bao quanh vùng tủy, vùng tủy<br /> gồm libe và gỗ xếp khá đặc sắc, gỗ ở giữa xếp<br /> thành dãy.<br /> <br /> Bào tử<br /> <br /> Đặc điểm bột dược liệu<br /> Cảm quan: Bột màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ.<br /> Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Biểu bì<br /> mang lỗ khí, mảnh mô mềm, mảnh nhựa, bào tử,<br /> sợi, mạch vạch, mạch xoắn.<br /> <br /> Biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm Mảnh nhựa<br /> <br /> Hình 3. Đặc điểm bột dược liệu Thạch tùng dương<br /> <br /> Kết quả đo độ ẩm, độ tro và hàm lượng chất<br /> chiết được<br /> Bảng 1. Độ ẩm của Thạch tùng dương<br /> Lần đo<br /> Độ ẩm (%)<br /> <br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3<br /> 8,68 8,47 8,30<br /> <br /> Trung bình<br /> 8,48<br /> <br /> Bảng 2. Độ tro của Thạch tùng dương<br /> Lần đo<br /> <br /> 4,30<br /> <br /> 3,83<br /> <br /> Trung<br /> bình<br /> 3,98<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 0,12<br /> <br /> 0,13<br /> <br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3<br /> <br /> Độ tro toàn phần (%)<br /> 3,81<br /> Độ tro không tan trong HCl<br /> 0,13<br /> (%)<br /> <br /> Bảng 3. Hàm lượng chất chiết được của Thạch tùng<br /> dương<br /> Lần đo<br /> <br /> 19,20<br /> <br /> Trung<br /> bình<br /> 19,20<br /> <br /> 18,60<br /> <br /> 18,55<br /> <br /> Lần 1 Lần 2 Lần 3<br /> <br /> Chiết lạnh với nước (%) 19,10 19,25<br /> Chiết lạnh với methanol<br /> 18,35 18,65<br /> (%)<br /> <br /> Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật<br /> Sơ bộ định tính thành phần hóa thực vật của<br /> cây Thạch tùng dương gồm có triterpenoid tự<br /> do, alkaloid, coumarin, saponin, acid hữu cơ và<br /> chất khử.<br /> <br /> Kết quả các phân đoạn từ cột Diaion HP-20<br /> Trong các phân đoạn thu được từ cột Diaion<br /> HP-20 chỉ có phân đoạn methanol 100% (6,6g) và<br /> <br /> 194<br /> <br /> Vi phẫu lá<br /> Vi phẫu lá Thạch tùng dương có cấu tạo từ<br /> ngoài vào trong gồm lớp biểu bì mang lỗ khí, mô<br /> mềm giậu, vùng tủy gồm bó dẫn chưa phân hóa,<br /> xung quanh có tế bào tẩm mộc tố.<br /> <br /> Mạch vạch<br /> <br /> Mạch xoắn<br /> <br /> dicloromethan (0,7g) dương tính với thuốc thử<br /> Dragendroff. Phân đoạn nước và methanol 20%<br /> không có alkaloid.<br /> Chuẩn bị mẫu: 6,6 g cắn alkaloid thu được từ<br /> phân đoạn methanol 100% được hòa tan với<br /> lượng vừa đủ với dichloromethan, nạp mẫu ướt<br /> vào cột sắc ký (6 x70 cm). Pha tĩnh khoảng 450 g<br /> sillicagel hạt vừa (kích thước 0,040-0,063 mm).<br /> Nhồi cột và ổn định cột khoảng 2 giờ bằng dung<br /> môi dicloromethan. Khai triển cột với hệ dung<br /> môi CH2Cl2-MeOH có tỷ lệ thay đổi từ 100:0 đến<br /> 80:20. Tốc độ 2ml/ phút. Thể tích hứng 100 ml.<br /> Kết quả thu được 8 phân đoạn bao gồm các<br /> alkaloid khác nhau.<br /> Phân đoạn I sau khi cô thu hồi dung môi,<br /> trên bình cầu xuất hiện các tinh thể màu vàng<br /> nhạt, tinh thể này được rửa bằng aceton và kết<br /> tinh lại bằng aceton-methanol (1:1). Tái kết<br /> tinh lại nhiều lần đến khi thu được tinh thể<br /> không màu, đặt tên là HT1. Kết quả thu được<br /> 1,07g HT1.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết chất HT1<br /> Tiến hành triển khai SKLM với các hệ dung<br /> môi khác nhau, phát hiện bằng soi đèn UV 254<br /> nm, 365 nm, thuốc thử Dragendorff. Hình 1 cho<br /> thấy HT1 là một chất tinh khiết.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,5)<br /> <br /> UV 254<br /> <br /> UV 365<br /> <br /> TT Dragedorff<br /> <br /> EtOAc-MeOH-H2O-NH3<br /> (100:13,5:10:0,5)<br /> <br /> UV 254<br /> <br /> UV 365<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> n-hexan-EtOAc-NH<br /> (40:60:0,5)<br /> <br /> TT Dragedorff<br /> <br /> UV 254<br /> <br /> UV 365<br /> <br /> TT Dragedorff<br /> <br /> Hình 4: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của HT1<br /> <br /> Xác định cấu trúc HT1<br /> HT1 kết tinh dạng tinh thể hình kim không<br /> màu, dễ tan trong CH3Cl3, CH2Cl2, MeOH; cho<br /> màu cam bền với thuốc thử Dragendorff.<br /> <br /> Phổ IR của HT1.<br /> Các băng hấp thụ ở 1660, 1619, 1554 cho thấy<br /> HT1 có tín hiệu của nhóm ceton, nối đôi ở<br /> carbon α-β.<br /> Phổ MS của HT1.<br /> Phổ LC MS (ESI+) có mảnh chính m/z = 271,25<br /> cho thấy [M+H]+ = 271,25 và dạng dimer [2M+H]+<br /> = 541,31. Do đó HT1 có khối lượng phân tử<br /> tương đương 270, tương ứng với công thức phân<br /> tử là C17H22N2O (Ω=8)<br /> <br /> 3 nhóm methylen, gồm: 2 nhóm -CH2- sp3 (δC<br /> 29,152 và 44,469 ppm), 1 nhóm =CH2 sp2 (δC<br /> 116,258 ppm)<br /> 6 nhóm methin, gồm: 2 nhóm >CH- sp3(δC<br /> 38,808 và 45,840); 4 nhóm =CH- sp2 (δC 117,624;<br /> 124,479; 140,221 và 142,433 ppm)<br /> 5 nhóm Carbon bậc 4, gồm: 1 nhóm –NHC=O (δC 165,119 ppm); 3 nhóm >C= sp2 (δC<br /> 118,723; 134,315 và 142,823 ppm); 1 nhóm >C-N<<br /> (δC 59,888 ppm)<br /> Từ các dữ liệu phân tích được, định hướng<br /> HT1 về hợp chất huperzinin<br /> 16<br /> 15<br /> 8<br /> <br /> Phổ UV của HT1<br /> Phổ UV trong MeOH của HT1 cho cực đại<br /> hấp thu tại 229,50 nm và 308,00 nm.<br /> Phổ NMR của HT1.<br /> Phổ 13C-NMR cho 16 tín hiệu carbon. Phổ<br /> 1H-NMR lấy tích phân cho 22 nguyên tử hydro.<br /> Phổ NMR cho thấy sự hiện diện của 16<br /> nhóm tín hiệu carbon, trong đó có 1 tín hiệu của<br /> của 2 carbon tương đương, bao gồm:<br /> 3 nhóm methyl, gồm: 1 CH3-C= (δC 22,849<br /> ppm); 1nhóm (CH3)2-N (δC 39,512 ppm)<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 14<br /> 7<br /> <br /> H<br /> 10<br /> <br /> 12<br /> 11<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> 13<br /> <br /> N<br /> <br /> H<br /> N<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1<br /> 3<br /> <br /> O<br /> <br /> 2<br /> <br /> Hình 5. Công thức phân tử huperzinin.<br /> Các kết quả của phổ NMR 1 chiều và 2 chiều<br /> đã chứng minh alkaloid HT1 là huperzinin.<br /> <br /> 195<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2