Phân lập nấm Chaetomium globosum từ lá cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Phân lập nấm Chaetomium globosum từ lá cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) khảo sát sự có mặt của một số chủng nấm nội sinh lá, cụ thể là ở cây ớt ngọt với mong muốn tìm được chủng nội sinh có lợi để ứng dụng như tác nhân kiểm soát sinh học thay thế thuốc diệt nấm hoá học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập nấm Chaetomium globosum từ lá cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.)

PHÂN LẬP NẤM CHAETOMIUM GLOBOSUM TỪ LÁ CÂY ỚT NGỌT (Capsicum annuum L.) Đặng Khánh Hoàng Minh Đăng*, Phạm Đăng Hoàng Hà, Lý Thị Bích Ngân *Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Mẫu lá cây ớt ngọt từ một nông trại tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng sau khi thu nhận và vận chuyển về phòng thí nghiệm của Viện Khoa học Ứng dụng thì đã được tiến hành phân lập và làm thuần. Các chủng nấm này tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường thạch dextrose khoai tây (PDA) để quan sát hình thái khuẩn lạc và đánh giá đặc điểm sợi nấm dưới kính hiển vi quang học với vật kính 40x và 100x. Trong số chín chủng nấm được khảo sát thì có một chủng là V142 nghi ngờ thuộc chi Chaetomium. Để có thể khẳng định thì chủng này đã được đi định danh bằng cách giải trình tự gen 18S và ITS theo phương pháp Sanger; tiếp sau đó là so sánh DNA thu được với cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng Gen (GenBank) tại the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Kết quả cho thấy chủng nấm được xác định là Chaetomium globosum với độ tương đồng 99,87%. Từ khoá: ớt ngọt, nấm nội sinh, Chaetomium globosum, phương pháp Sanger. 1. GIỚI THIỆU Trong nông nghiệp, sâu hại và mầm bệnh làm giảm năng suất cây trồng hàng năm trên toàn cầu ước tính từ 30 đến 50%, đây là một tổn thất cần phải đấu tranh để đảm bảo an ninh lương thực cho dân số ngày càng tăng (Grabka. R et al., 2022). Hiện nay, người nông dân vẫn thường sử dụng các thuốc diệt nấm hoá học như một biện pháp phòng ngừa và điều trị để kiểm soát các mầm bệnh thực vật (J.H. Park et al., 2005). Tuy nhiên, giải pháp này đang ngày càng để lộ nhiều hạn chế khi mà việc sử dụng bừa bãi và quá mức đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, tính kháng thuốc ở một số mầm bệnh. Bên cạnh đó là nhu cầu của người tiêu dùng về các sản phẩm hữu cơ cũng dần một tăng. Do đó, việc tìm ra một giải pháp an toàn hơn nhằm thay thế các thuốc diệt nấm hoá học là rất cần thiết. Trong số đó thì các vi khuẩn nội sinh có lợi được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học để bảo vệ cây trồng, hiện đang nhận được nhiều sự chú ý. Vì chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của thực vật và bảo vệ chống lại sâu hại và mầm bệnh thông qua các cơ chế khác nhau như tiết ra các hợp chất thứ cấp nhằm ngăn chặn hoặc giảm tác động tiêu cực từ mầm bệnh; cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi sống với mầm bệnh; một số còn có đặc tính thúc đẩy tăng trưởng giúp cây khoẻ mạnh hơn (Grabka. R et al., 2022) và Chaetomium globosum là một trong số đó. Khi đã có báo cáo cho thấy rằng có thể sử dụng chúng như một 467
tác nhân đối kháng tiềm năng với các mầm bệnh thực vật khác nhau mà phần lớn có nguồn gốc từ đất và hạt giống (J.H. Park et al., 2005). Tuy nhiên, các nghiên cứu những năm gần đây về quần xã nội sinh có liên quan đến các loài thực vật khác nhau đã chỉ ra rằng sự đa dạng của nấm nội sinh cư trú bên trong thực vật phần lớn bị đánh giá thấp (Grabka. R et al., 2022). Chính vì vậy, nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát sự có mặt của một số chủng nấm nội sinh lá, cụ thể là ở cây ớt ngọt với mong muốn tìm được chủng nội sinh có lợi để ứng dụng như tác nhân kiểm soát sinh học thay thế thuốc diệt nấm hoá học. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: mẫu lá cây ớt ngọt được thu nhận từ một nông trại trên địa bàn huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập nấm nội sinh Dựa theo kỹ thuật cải tiến của Petrini (1992), mẫu lá sau khi thu nhận được rửa sạch dưới vòi nước máy để loại bỏ bụi bẩn. Dùng dao vô trùng cắt nhỏ lá ra thành từng miếng có kích thước 5 x 5 mm. Sau đó, các mẫu lá này được khử trùng lần đầu bằng cồn 70% và lần hai bằng dung dịch NaClO 1%; mỗi lần được thực hiện trong vòng 2 - 3 phút. Tiếp đến là tráng lại 3 lần trong nước cất vô trùng và để khô trên giấy lọc vô trùng trước khi cấy lên môi trường PDA (Hernawati et al., 2011) có bổ sung 0,5 g/L Chloramphenicol đã được hấp tiệt trùng. Ủ lá ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 - 7 ngày và quan sát sự hình thành tơ nấm từ rìa lá. 2.2.2 Cấy truyền Quan sát các đĩa phân lập khi thấy trong môi trường xuất hiện nhiều tản nấm có hình dạng, màu sắc và kích thước khác nhau thì phải tách riêng từng dạng tản nấm ra để làm thuần bằng cách cắt một miếng thạch nhỏ có kích thước 2 × 2 mm từ rìa mỗi tản nấm. Sau đó, cấy chúng sang một đĩa khác chứa môi trường PDA. Khi tản nấm mọc từ các miếng cấy đạt đến khoảng 5 mm thì tiến hành cấy truyền tiếp qua đĩa có môi trường PDA mới bằng cách dùng que cấy lấy một ít sợi nấm từ tản nấm cấy vào giữa đĩa. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 - 4 ngày. 468
2.2.3 Làm thuần Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường ½ PDA mà độ nghiêng của một bên đĩa cao hơn phía còn lại khoảng 1 mm. Dùng cây đục lỗ thạch đường kính 5 mm lấy một miếng nấm từ đĩa cấy truyền đặt vào phần dày hơn của đĩa môi trường ½ PDA. Sau 3 ngày thì soi đĩa dưới nguồn sáng để tìm sợi nấm. Lưu ý chọn ở vị trí sợi nấm mọc thưa thớt và dùng que cấy dẹp cắt miếng thạch chứa sợi nấm đó đặt qua môi trường PDA mới. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 - 7 ngày để quan sát hình thái khuẩn lạc. 2.2.4 Quan sát hình thái sợi nấm Sử dụng phương pháp phòng ẩm để đánh giá đặc điểm hình thái sợi nấm khảo sát. Trước tiên cần phải chuẩn bị lame, lamelle và đĩa petri phi 10 có lót giấy lọc đã được hấp tiệt trùng; tiếp theo là đổ một lớp mỏng (khoảng 1 cm) môi trường PDA lên một đĩa petri phi 9. Sau đó dùng dao mổ vô trùng cắt thạch thành từng khối vuông (1 x 1 cm) và đặt lên lame sau đó dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối nấm cấy vào bốn cạnh của miếng thạch, dùng kẹp vô trùng đặt lamelle lên trên, nhỏ một ít nước cất vô trùng cho thấm ướt giấy lọc. Đậy đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày trước khi quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40x và 100x. 2.2.5 Định danh chủng nấm được phân lập Chủng nấm có hình thái khuẩn lạc và đặc điểm sợi nấm mà nghi ngờ là chi Chaetomium được gửi đi giải trình tự vùng ITS (internal transcribed spacer) ở Công ty TNHH Dịch vụ và Thuơng mại Nam Khoa (Nam Khoa Biotek CO., Ltd). bằng phương pháp Sanger và dựa vào các trình tự thu được, tìm kiếm cơ sở dữ liệu trên GenBank bằng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm nội sinh Mẫu lá cây sau khi phân lập được 3 ngày thì từ rìa lá bắt đầu xuất hiện các sợi tơ. Tuy nhiên, đặc điểm về màu sắc và tốc độ phát triển thì không rõ ràng phải đến ngày thứ 5 thì màu sắc và tốc độ phát triển của các tảng nấm mới có sự khác biệt rõ rệt. 3.2 Cấy truyền và làm thuần Những tảng nấm có đặc điểm màu sắc và tốc độ phát triển khác nhau đã tách riêng ra bằng cách cấy truyền nhiều lần. Sau khi làm thuẩn thì thu nhận được 9 chủng nấm có hình thái khuẩn lạc khác nhau. Tuy nhiên chỉ có duy nhất một chủng V142 là cho thấy các đặc điểm giống với mô tả về chi Chaetomium. Khuẩn lạc của chủng V142 trên môi trường PDA có màu trắng nhạt với các mảng màu sậm hơn. Tản nấm mọc không đều, không xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, sợi nấm nhiều hơi bông xốp. Mặt còn lại có màu nâu sậm ở tâm và nhạt dần ra phần rìa (Hình 1). Kết quả này khá là tương đồng với mô tả của Afra Khiralla (2015). 469
Mặt trên Mặt dưới Hình 1: Hình thái khuẩn lạc chủng V142 trên môi trường PDA. 3.3 Quan sát hình thái sợi nấm Quả thể dạng chai (Perithecia) có hình cầu được bao phủ bởi các sợi lông ở mặt trên (Hình 2). Các sợi lông này cơ bản có hình trụ thẳng, hơi cong ở phần đỉnh (Hình 3). Kết quả cho thấy sự tương đồng với báo cáo của Afra Khiralla (2015). Tuy nhiên, trong quá trình soi kính, chưa tìm thấy bào tử túi hình oval (ascospores). Chính vì vậy để chắc chắn cần phải tiến hành định danh chủng. Vật kính 40x Vật kính 100x Hình 2: Đặc điểm quả thể dạng chai của chủng V142 dưới kính hiển vi 470
Hình 3: Đặc điểm sợi nấm của chủng V142 dưới kính hiển vi 3.4 Định danh nấm nội sinh đã phân lập Tiến hành định danh theo phương pháp Sanger bằng cách sử dụng cặp mồi ITS1 5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’ và ITS4 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ để khuếch đại vùng đệm trong được phiên mã (ITS) ribosome DNA (rDNA) (White et al., 1990). Sau khi giải trình tự gene 18S và ITS thu được đoạn gene 753 bp. Kết quả này được so sánh trên Genbank (NCBI) cho thấy V142 có thể là Chaetomium globosum với tỉ lệ tương đồng là 99,87%. Chi Chaetomium được báo cáo có nhiều loài thuộc nấm đối kháng, không những có tác dụng phòng chống bệnh hại cây trồng mà còn được sử dụng để tăng độ màu mỡ cho đất, kích thích cây trồng phát triển và hấp thụ dinh dưỡng (Nguyễn Thế Quyết và cộng sự, 2017). Kết quả này gợi ý cho những nghiên cứu tiếp theo là khảo sát một số đặc điểm có lợi của loài Chaetomium globosum trong việc ứng dụng nó như một tác nhân đối kháng lại với các mầm bệnh gây hại như Pythium ultimum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Venturia inaequalis, Pyricularia oryzae, Botrytis cinera, Phomopsis, Colletotrichum spp. (Nguyễn Thế Quyết và cộng sự, 2017) và sinh các chất hỗ trợ tăng trưởng như IAA, GA3,... (Abdul Latif Khan et al., 2012). 4. KẾT LUẬN Mẫu lá ớt thu nhận từ huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng sau khi phân lập và làm thuần đã thu nhận được 9 chủng nấm có đặc điểm khuẩn lạc khác nhau. Trong quá trình nuôi cấy khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi thì chỉ có duy nhất một chủng V142 là có những đặc điểm giống mô tả về Chaetomium globosum của Afra Khiralla (2015) và được khẳng định bằng cách giải trình tự gene trình tự ITS và so sánh DNA thu được với các trình tự trên Genbank NCBI. Những nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm bệnh và hỗ trợ tăng trưởng cây ớt ngọt của chủng phân lập sẽ được tiến hành để đánh giá toàn diện khả năng áp dụng chủng phân lập trong phát triển nông nghiệp hữu cơ. 471
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abdul Latif Khan et al., 2012. Role of endophyte Chaetomium globosum Lk4 in growth of Capsicum annuum by producion of gibberellins and indole acetic acid,Pak. J. Bot., 44 (5), 1601 - 1607. 2. Afra Khiralla, 2015. Phytochemical study, cytotoxic and antibacterial potentialities of endophytic fungi from medicinal plants from Sudan, Université de Lorraine. 3. Grabka. R, d’Entremont. T.W, Adams. S.J, Walker. A.K, Tanney. J.B, Abbasi. P.A & Ali. S, 2022. Fungal Endophytes and Their Role in Agricultural Plant Protection against Pests and Pathogens. Plants 11, 384. 4. Hernawati et al., 2011. Leaf endophytic fungi of Capsicum annuum, Biodiversitas 12 (4), 187 - 191. 5. Nguyễn Thế Quyết, Kasem Soytong & Hà Viết Cường, 2017, Xác định danh tính nấm Chaetomium cupreum và Chaetomium globosum trên đất trồng cây ăn quả có múi tại miền Bắc Việt Nam, Vietnam J. Agri. Sci. 15 (10), 1323 - 1331. 6. Park et al., 2005. Antifungal activity against plant pathogenic fungi of chaetoviridins isolated from Chaetomium globosum, FEMS Microbiology Letters 252, 309 - 313. 472