Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa (Oryza sativa) có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae)

Chia sẻ: Bigates Bigates | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ba chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2 được phân lập nội sinh từ rễ lúa thu được ở tỉnh Long An, 1 chủng RL được phân lập từ bề mặt rễ lúa Cà Mau. Cả 4 chủng vi khuẩn phân lập RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khả năng sinh acid, sinh IAA, tạo màng biofilm và ức chế nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae trong điều kiện nồng độ muối từ 0-3%. Hai chủng có hoạt tính mạnh nhất RL và RL1T được định danh là Enterococcus faecium bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA và so sánh với các trình tự của Genbank.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa (Oryza sativa) có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TỪ RỄ CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) CÓ HOẠT TÍNH HỖ TRỢ TĂNG TRƯỞNG CÂY TRỒNG VÀ KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN (PYRICULARIA ORYZAE) Đặng Ngọc Thanh*, Lê Khắc Khoa Điềm, Hồ Thị Dưỡng, Trần Quang, Nguyễn Tấn Lộc * Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Ba chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2 được phân lập nội sinh từ rễ lúa thu được ở tỉnh Long An, 1 chủng RL được phân lập từ bề mặt rễ lúa Cà Mau. Cả 4 chủng vi khuẩn phân lập RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khả năng sinh acid, sinh IAA, tạo màng biofilm và ức chế nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae trong điều kiện nồng độ muối từ 0-3%. Hai chủng có hoạt tính mạnh nhất RL và RL1T được định danh là Enterococcus faecium bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA và so sánh với các trình tự của Genbank. Từ khóa: bệnh đạo ôn, hỗ trợ tăng trưởng cây trồng, kháng nấm, lúa, vi khuẩn lactic. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa (Oryza sativa) là cây lương thực quan trọng hàng đầu nuôi sống khoảng 1/2 dân số và khoảng 3/4 người nghèo của thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực quan trọng nhất cho sinh kế của người dân và an ninh lương thực quốc gia [1]. Hiện nay bệnh đạo ôn đã và đang là nỗi ám ảnh nặng nề nhất đối với người trồng, tính kháng bệnh của giống liên tục bị phá vỡ do độc tính của nấm bệnh gây ra [2]. Thuốc hóa học được xem là biện pháp giải quyết phổ biến, nhưng gây tồn dư và ô nhiễm môi trường. Từ thực trạng cấp thiết đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm bệnh đạo ôn thay thế cho thuốc bảo vệ thực vật và phân bón hóa học là một việc làm cấp thiết và thiết thực, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sạch và bền vững. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập: rễ lúa Nàng Hương, Nàng Thơm chợ Đào (Long An), rễ lúa OM6162 (Cà Mau). Nấm chỉ thị: nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae. Đối chứng dương kháng nấm: thuốc hóa học BEAM 75W (Tricyclazole 75% w/w). 466
2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic từ rễ lúa Phân lập vi khuẩn lactic sống trên bề mặt rễ lúa: rễ lúa được rửa sạch đất và ngâm trong NMSL, sau đó phân lập trên môi trường MRS agar bổ sung Azide 0,2% và Bromocresol purple (BCP) 0,4%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Phân lập vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa: rễ lúa sau khi được khử trùng bề mặt đến không phát hiện được vi sinh vật phát triển từ nước rửa rễ, sau đó rễ được nghiền trong NMSL và phân lập như trên. Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá: quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase, khả năng di động, khả năng lên men đường [3]. Khả năng lên men đường được xác định bằng cách: Môi trường MRS broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường cần kiểm tra, bổ sung Bromocresol purple 0.4% và có ống Durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Nếu môi trường đổi màu, đục và có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men dị hình. Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí yếu. Đánh giá khả năng lên men qua mức độ đổi màu môi trường. 2.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính hỗ trợ ăng ưởng cây trồng và kháng nấm bệnh đạo ôn Tuyển chọn vi khuẩn lactic theo khả năng sinh acid (Phương pháp chuẩn độ Therner), khả năng tạo màng sinh học biofilm [4], khả năng sinh IAA theo phương pháp Salkowski [5], khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae in vitro bằng phương pháp cấy hai đường song song [6]. 2.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn Các chủng thuần khiết được gửi đi công ty Phusa Biochem giải trình tự 16S rRNA bằng phương pháp Sanger và so sánh trên Genbank NCBI bằng phần mềm Blast. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic từ rễ lúa Từ rễ lúa Long An phân lập được 3 chủng vi khuẩn nội sinh RL1T, RL1V, RL2; 1 chủng RL trên bề mặt từ rễ lúa Cà Mau. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào: Cả 4 chủng vi khuẩn RL1T, RL1V, RL2, RL đều có khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục, viền nhẵn. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của 4 chủng được thể hiện qua bảng 1 và 2 thể hiện tính chất của vi khuẩn lên men lactic. Cả 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng lên men đường glucose, fructose, galactose, mannose, mannitol, xylose, maltose, sucrose, lactose và đặc biệt cả dextrin, thể hiện qua đổi màu môi trường từ tím sang vàng, trong đa số trường hợp có sinh khí, chứng tỏ các chủng lên men dị hình, ngoài acid lactic còn có các acid hữu cơ khác. 467
Bảng 1. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của 4 chủng phân lập Đặc điểm RL1T RL1V RL2 RL Gram + + + + Bào tử - - - - Di động - - - - Catalase - - - - Ghi chú: +: dương tính, -: âm tính Bảng 2. Khả năng lên men đường của 4 chủng phân lập Nguồn đường RL1T RL1V RL2 RL Glucose + +x +x +x Fructose +x +x +x +x Galactose + + + + Mannose +x +x +x +x Mannitol +x +x +x +x Xylose +x +x +x +x Maltose +x +x +x +x Sucrose +x +x +x +x Lactose + + +x + Dextrin +x +x +x +x *x: sinh khí 3.2 Tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn 3.2.1 Khả năng sinh acid lactic Khả năng sinh acid lactic ở các nồng độ muối từ 0-3% được thể hiện ở bảng 3, trong đó chủng RL và RL1T thể hiện khả năng sinh acid lactic cao nhất. Khi nồng độ muối tăng từ 0% lên 3%, khả năng lên men lactic cũng giảm theo, sai khác có ý nghĩa thống kê đối với chủng RL1T và RL. Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng lên men lactic của các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường MRS Nồng độ % NaCl Chủng 0 1 2 3 RL1T 1,030 aA 1,026 aB 1,017 bC 1,014 aD RL1V 1,026 aA 1,023 aA 1,017 bB 1,012 bC RL2 1,020 bA 1,017 bAB 1,014 cB 1,012 bB RL 1,026 aA 1,022 aB 1,021 aC 1,014 aD Ghi chú: *a: Xử lý số liệu theo cột, A: Xử lý số liệu theo hàng (P < 0.05, Duncan test, phân tích phương sai 1 yếu tố). 468
3.2.2 Khả năng tạo biofilm Khả năng tạo màng sinh học biofilm dưới ảnh hưởng của nồng độ muối từ 0-3% được trình bày ở bảng 4. Khả năng tạo biofilm cao nhất ở nồng độ NaCl 2% đối với các chủng. Trong đó chủng RL2 có khả năng sinh biofilm nhiều nhất. Khả năng sinh biofilm liên quan đến polysaccharide ngoại bào được tổng hợp giúp vi khuẩn chống chịu điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ muối 0-3% đến khả năng tạo biofilm của vi khuẩn phân lập Nồng độ % NaCl Chủng 0 1 2 3 RL1T 0,4063 bB 0,5183 abB 0,8983 aA 0,804 aA RL1V 0,3053 cB 0,4303 bB 0,808 aA 0,798 aA RL2 0,4437 bC 0,4467 abC 1,0817 aA 0,715 aB RL 0,5693 aA 0,5783 aA 0,8117 aA 0,698 aA Ghi chú: *a: Xử lý số liệu theo cột, A: Xử lý số liệu theo hàng (P < 0.05, Duncan test, phân tích phương sai 1 yếu tố). 3.2.3 Khả năng tổng hợp IAA Khả năng tổng hợp IAA dưới ảnh hưởng của nồng độ muối từ 0-3% lên được trình bày ở Bbảng 5. Tất cả các chủng khảo sát đều có khả năng sinh IAA. Khi tăng nồng độ muối lên 1%, khả năng sinh IAA của RL1T, RL1V và RL tăng. Khi muối tiếp tục tăng thì đường kính IAA giảm có ý nghĩa thống kê, riêng chủng RL2, khả năng sinh IAA cao nhất ở môi trường chứa 2% NaCl. Bảng 5. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên đường kính vòng IAA của các chủng phân lập Nồng độ % NaCl Chủng 0% 1% 2% 3% RL1T 8,3 aB 11,0 aA 6,7 bC 6,3 aC RL1V 6,3 bB 7,3 bcA 7,0 bAB 5,0 bC RL2 7,7 abAB 5,7 cBC 9,0 aA 5,0 bC RL 6,3 bB 8,0 bA 6,0 bB 7,0 aAB Ghi chú: *a: Xử lý số liệu theo cột, A: Xử lý số liệu theo hàng (P < 0.05, Duncan test, phân tích phương sai 1 yếu tố). 3.2.4 Khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae in vitro Khả năng ức chế tăng trưởng nấm sinh bệnh đạo ôn dưới ảnh hưởng của các nồng độ muối từ 0-3% được thể hiện ở Bảng 6. 469
Bảng 6. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae Nồng độ % NaCl Chủng 0 1 2 3 BEAM 75W 23,1 cA 17,9 cB 13,8 dC 9,4 dD RL1T 58,5 bA 45,7 bB 39,1 bB 35,4 bB RL1V 48,2 bA 39,5 bAB 32,6 cBC 26,0 cC RL2 47,2 bA 43,8 bA 31,2 cB 26,0 cB RL 55,4 bA 45,1 bB 38,4 bBC 34,4 bC Ghi chú: *a: Xử lý số liệu theo cột, A: Xử lý số liệu theo hàng (P < 0.05, Duncan test, phân tích phương sai 1 yếu tố). Cả 5 chủng vi khuẩn lactic khảo sát đều có hoạt tính kháng nấm Pyricularia oryzae ở các nồng độ muối khác nhau và đều cao hơn đối chứng dương là BEAM 75W. Tỷ lệ ức chế nấm của cả 4 chủng vi khẩn phân lập đều giảm dần theo thứ tự nồng độ muối từ 0 – 3% NaCl. Chủng Lactobacillus plantarum L5 (đối chứng dương kháng nấm) thể hiện hoạt tính kháng nấm chỉ thị cao nhất ở mọi nồng độ muối. Các chủng RL1T, RL1V, RL2 và RL có tỷ lệ (%) ức chế nấm tương đương nhau, sai khác không có ý nghĩa thống kê, đạt cao nhất khi không có muối là từ 47,2 đến 58,5%. Trong số các chủng phân lập của đề tài, chủng RL1T và RL thể hiện khả năng kháng nấm in vitro cao nhất. Từ kết quả tuyển chọn, ta thấy hai chủng tiềm năng nhất là RL và RL1T với khả năng chịu mặn, khả năng sinh acid lactic, khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và khả năng kháng nấm bệnh là cao nhất. 3.3 Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn Hai chủng tiềm năng nhất RL và RL1T được gửi đi giải trình tự gene 16SrRNA và so sánh kết quả trên genbank NCBI bằng phần mềm Blast. Kết quả cho thấy chủng RL1T tương đồng 98,93% với chủng Enterococcus faecium NBRC 100486 và RL tương đồng 99,21%. 4 KẾT LUẬN Từ đó có thể kết luận hai chủng chọn lọc RL1T nội sinh rễ lúa và RL trên bề mặt rễ lúa đều thuộc loài Enterococcus faecium. Loài này thuộc họ Enterococcaceae trong bộ Lactobacillales gồm 35 loài có mặt ở khắp nơi, từ đường ruột người và động vật đến thực phẩm và môi trường. Đây có thể là các vi khuẩn gây bệnh cơ hội, nhưng cũng đóng vai trò trong thực phẩm lên men và được sử dụng như probiotic [7]. Cần khảo sát tiếp các đặc điểm sinh hóa, rà soát các yếu tố độc lực và kháng sinh đồ của vi khuẩn để quyết định xem có thể sử dụng chủng ngoài sản xuất hay không. 470
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nhân ĐK (2009). Năng Suất và Lợi Tức Sản Xuất Lúa Cao Sản ở Đồng bằng sông Cửu Long Giai Đoạn 1995-2006. Tạp chí Khoa học, ại học Cần Thơ Số, 12, 212–218. [2] Lan NTP, Ngân VTT, Lộc TP (2015). Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia grisea gây bệnh đạo ôn hại lúa. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 13(8), 1442–1451. [3] Manero A và Blanch AR (1999). Identification of Enterococcus spp. with a biochemical key. Appl Environ Microbiol, 65(10), 4425–4430. [4] Kubota H, Senda S, Nomura N (2008). Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress. J Biosci Bioeng, 106(4), 381–386. [5] Glickmann E và Dessaux Y(1995). A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Appl Environ Microbiol, 61(2), 793–796. [6] Laref Nora và Guessas Bettache (2013). Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria. Innov Rom Food Biotechnol, 13, 80–88. [7] Švec P, Vandamme P, Bryndová H (2012). Enterococcus plantarum sp. nov, isolated from plants. Int J Syst Evol Microbiol, 62(7), 1499–1505. 471