Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cải tạo đất trồng rau trên quần đảo Trường Sa

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Nguyệt

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Nguyệt

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS. Lê Đức Anh Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Ngọc Lan

Hà Nội - 2020

Lời cam đoan

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Đức Anh, TS. Nguyễn Ngọc Lan và Ths. Vũ Văn Dũng. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Học viên

Trần Thị Nguyệt

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đức Anh, TS. Nguyễn Ngọc Lan và ThS. Vũ Văn Dũng đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện Luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, các cô, cán bộ Học viện Khoa học và công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành các học phần trong Chương trình đào tạo.

Em cũng xin cảm ơn Đảng ủy, Lãnh đạo Viện Hóa học- vật liệu, Viện Khoa học và công nghệ quân sự, Bộ Quốc phòng và tập thể phòng Hóa học các hợp chất nhiên đã cho phép, tạo điều kiện về thời gian, thiết bị nghiên cứu, động viên tinh thần cho em trong quá trình học tập nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn đề tài ĐTĐL.CN - 11/19- C đã giúp đỡ một phần kinh

phí để tôi hoàn thành Luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đinh, người thân, bạn bè đã hết lòng ủng hộ tôi về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận văn.

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan .................................................................................................... i

Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii

Mục lục ............................................................................................................ iii

Danh mục các bảng ....................................................................................... vii

Danh mục các hình vẽ, đồ thị ........................................................................ ix

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4

1.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN VÀ TÌNH HÌNH TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA ......................................................................... 4

1.1.1. Điều kiện tự nhiên quần đảo Trường Sa ......................................... 4

1.1.2. Tình hình trồng rau trên quần đảo Trường Sa ................................ 5

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT CỐ ĐINH NITƠ ............................. 6

1.3. PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN THU SINH KHỐI VI SINH VẬT ......... 9

1.3.1. Phương pháp lên men chìm ........................................................... 10

1.3.2. Phương pháp lên men bề mặt. ....................................................... 10

1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỐI QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU SINH KHỐI CỦA VI SINH VẬT CHỤI MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM................................................................................................. 10

1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ....................................................... 10

1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ............................................................ 11

1.4.3. Các nguyên tố khoáng ................................................................... 11

1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm ......................................................... 11

1.4.5 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi sinh vật chụi mặn có khả năng cố định đạm. ............................................................................ 12

1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển của vi sinh vật chụi mặn có khả năng cố định đạm ................................................................. 12

1.5 THỰC TRẠNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN CHỊU MẶN VÀO CÁC CHẾ PHẨM VI SINH TRÊN THẾ GIỚI ..................... 13

1.6 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG NƯỚC ................................................................................ 16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................... 18

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................... 18

2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 18

2.1.2. Hóa chất và môi trường ................................................................. 19

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU ....................................................... 20

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu ..................................................................... 20

2.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu mặn và bảo quản ........................................................................................................ 20

2.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn .......... 21

2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn .......... 21

2.2.5 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn ............................................. 22

2.2.6. Khuếch đại gen 16S rRNA ............................................................ 23

2.2.7. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitơ ................ 23

2.2.8. Sàng lọc các chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan ..... 24

2.2.9. Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng chọn lọc ................................................................................................................. 25

2.2.10. Phương pháp xác định đường tổng bằng phenol và acid sulfuric ................................................................................................................. 26

2.2.11. Phương pháp định lượng protein bằng phương pháp Lowry ...... 27

2.2.12. Phương pháp lên men .................................................................. 28

2.2.13. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ..... 29

2.2.13.1 Ảnh hưởng của NaCl lên sinh trưởng, cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA ...................................................................................... 29

2.2.13.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm ........... 29

2.2.13.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................ 30

2.2.14.4 Ảnh hưởng của pH ................................................................ 30

2.2.13.5 Ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối .............................. 30

2.2.14 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm phân vi sinh chịu mặn cố định đạm .......................................................................................................... 31

2.2.15. Thử nghiệm, đánh giá chế phẩm vi sinh ..................................... 32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI SINH VẬT CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ MẪU ĐẤT LẤY TẠI CÁC ĐẢO THUỘC QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA .................................................................................... 33

3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN PHOSPHATE VÀ SINH IAA CỦA CÁC CHỦNG CHỌN LỌC ............. 34

3.3 GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RRNA CỦA HAI CHỦNG CHỌN LỌC N4.1 VÀ STT 3 3.1 ..................................................................................... 37

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NACL LÊN KHẢ NĂNG SINH IAA CỦA CHỦNG N 4.1 VÀ KHẢ NĂNG SINH AMONI CỦA CHỦNG STT3 3.1 ............................................................................. 38

3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG N4.1 VÀ STT 3 3.1 ..................................................................................... 40

3.5.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 .................................................................. 40

3.5.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ......................................................................................................... 41

3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ................................................................................... 42

3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan ban đầu đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 .................................................................. 43

3.5.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ................................................................................... 43

3.5.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ............................................................................................ 46

3.6 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN NHÂN SINH KHỐI .............. 48

3.6.1 Động học quá trình lên men nhân sinh khối chủng N4.1 .............. 48

3.6.2 Động học quá trình lên men nhân sinh khối chủng STT3.3.1 ....... 49

3.7. QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN SINH KHỐI CHỦNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ............................................................................................................ 50

3.8. SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHỊU MẶN N4.1 VÀ STT3 3.1 ..................................... 52

3.9 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM PHÂN VI SINH CỐ CHỊU MẶN CỐ ĐỊNH ĐẠM ................................................................................................ 54

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 57

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 57

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 59

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Kí hiêu và vị trí lấy mẫu đất trên quần đảo Trường Sa .................. 18

Bảng 2.2: Kết quả các phép đo OD ................................................................ 24

Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm ............................ 33

Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của chủng N 4.1 và STT3 3.1

......................................................................................................................... 37

Bảng 3.3: Môi trường lên mem sinh khối của hai chủng N4.1 và STT3 3.1 .. 51

Bảng 3.4: Kết quả sau 30 ngày thử nghiệm trồng rau với giá thể là đất nền cổ trên đảo Trường Sa và phân vi sinh cố định đạm chịu mặn qui mô phòng thí nghiệm ............................................................................................................. 54

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Phần viết đầy đủ

Adensine triphosphate ( năng lượng của tế bào) ATP 1

N nitơ 2

Amoniac 3 NH3

VSV Vi sinh vật 4

IAA 3-indole aceticacid (chất kích thích sinh trưởng) 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên ........................................................... 7

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 ................................................... 8

Hình 1.3 Mô hình cấy trúc các gen nif ............................................................. 8

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn ammonium sử dụng dung dịch chuẩn (NH4)2SO4 ....................................................................................................... 24

Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn phosphate sử dụng dung dịch chuẩn KH2PO4.25

Hình 2.3 Đường chuẩn IAA ............................................................................ 26

Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn glucose ........................................................... 27

Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn biển điễn protein. ........................................... 28

Hình 3.1 Hình ảnh sàng lọc các chủng vi sinh vật trên môi trường Burk’s ............................................................................. Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm ............................ 33

Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của chủng STT3 3.1 .... 33

Hình 3.3: Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của của chủng N 4.1 ... 34

Hình 3.4: Đồ thị thể hiện hàm lượng amoni tổng hợp của 36 chủng............. 34 Hình 3.5. So sánh khả năng phân giải phosphate của các chủng phân lập ..... 35

Hình 3.6.So sánh khả năng sinh IAA của 36 chủng vi khuẩn. ....................... 36

Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3 3.1. ............................................................................ 38

Hình 3.8: Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp IAA của chủng N4.1 ................................................................................................................. 39

Hình 3.9 : Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp amoni của chủng STT3 3.1 .......................................................................................................... 40

Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ......................................................................... 41

Hình 3.11 : Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ............................................................................... 42

Hình 3.12: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 43

Hình 3.13: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ........... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 45

Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của đường glucose đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 45

Hình 3.16 : Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ......................................................................... 46

Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của cao nấm men đối với sự sinh trưởng của chủng N 4.1 và chủng STT3 3.1. .................................................. 47

Hình 3.18: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn ni tơ kết hợp bổ sung NH4NO3 đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT 3.3.1 ..................... 48

Hình 3.19 Động học quá trình lên men thu sinh khối của chủng N 4.1. ....... 49

Hình 3.20 Động học quá trình lên men thu sinh khối của chủng STT3 3.1. . 50

Hình 3.21: Sơ đồ quy trình nhân sinh khối chủng cố định đạm ..................... 51

Hình 3.22: Sơ đồ quy trình sản xuất phân bón vi sinh từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn N4.1 và STT3 3.1. ........................................................... 52

Hình 3.23: Hình ảnh phân bón vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3.3.1 .......................................................................................................... 53

Hình 3.24: Hình ảnh đất nên cổ phối trộn với phân vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn bản địa. .............................................. 54

Hình 3.25: Hình ảnh giá thể phân đất 6:4 ....................................................... 54

Hình 3.26: Rau muống trồng với phân vi sinh cố định đạm chụi mặn ........... 55

Hình 3.27: Hình ảnh rễ , lá, và chiều dài cây của lô thí nghiệm và mẫu đối chứng ............................................................................................................... 56

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết chọn đề tài

Quần đảo Trường Sa, thuộc tỉnh Khánh Hòa, nằm ở trung tâm biển Đông, về phía Đông Nam nước ta, là một trong những khu vực có nhiều tuyến đường biển nhất trên thế giới nối liền Thái Bình Dương với Ấn Độ Dương và Đại Tây Dương, một tuyến đường huyết mạch có lưu lượng tàu thuyền tấp nập vào hàng thứ 2 trên thế giới, trung bình mỗi ngày có 250-300 tàu biển các loại đi qua biển Đông. Giá trị vận chuyển tuyến đường này lên tới 31 tỷ USD. Trong tương lai, việc vận chuyển khối lượng hàng hóa qua biển đông sẽ tăng gấp 2-3 lần, khi đó biển Đông nói chung và vùng biển Trường Sa nói riêng sẽ có vai trò rất lớn trong thương mại và an ninh quốc tế.

Từ vị trí quan trọng của biển, đảo, Đảng và Nhà nước ta luôn coi trọng giải quyết tốt mối quan hệ giữa phát triển kinh tế xã hội gắn với củng cố quốc phòng an ninh và xây dựng thế trận quốc phòng toàn dân trên các vùng biển, đảo. Ngày nay, với xu thế tốc độ tăng trưởng kinh tế và dân số, nguồn tài nguyên thiên nhiên, nhất là nguồn tài nguyên không tái tạo được trên đất liền sẽ dần bị cạn kiệt, sự tồn tại và phát triển của con người đang hướng về đại dương. Vì vậy, vị trí và vai trò của biển đảo càng trở nên quan trọng, việc tranh chấp, xác định chủ quyền biển, đầu tư phát triển kinh tế biển, củng cố quốc phòng an ninh trên biển đang trở thành vấn đề nóng bỏng và có tính cấp bách cho các quốc gia có biển. Là một quốc gia có biển, đó là một lợi thế lớn, chúng ta cần tiếp tục phát huy những thành tựu đã đạt được, tăng cường hơn nữa phát triển kinh tế biển với chiến lược toàn diện, có trọng tâm, trọng điểm, sớm đưa nước ta thành một quốc gia mạnh về kinh tế biển trong khu vực, gắn với đảm bảo quốc phòng an ninh và hợp tác quốc tế.

Đất trồng rau ở trên các đảo nổi thuộc Quần đảo Trường Sa chủ yếu là lớp cát san hô, rất thô, kém giữ nước, giữ màu. Có thể phân biệt hai loại: đất cát san hô thường thấy ở ven đảo, đất phân chim, rất phổ biến ở các đảo lớn, thường có màu nâu đen, phủ kín các mặt đảo. Nói tóm lại, điều kiện tự nhiên ở quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho sinh hoạt và trồng

trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là không thể, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết.

Chính vì vậy, cần phải phát triển một loại phân vi sinh có khả năng chịu mặn được với điều kiện khí hậu khắc nghiệt của quần đảo Trường Sa để phục vụ cải tạo đất trồng rau xanh và cây xanh trên đảo là rất cần thiết.

Xuất phát từ ý tưởng trên đề tài tập trung nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate và đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng để sản xuất được phân bón vi sinh phục vụ trồng rau xanh và cây xanh trên đảo Trường Sa.

Mục đích của đề tài

- Tuyển chon được bộ chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa Trường Sa, có hoạt tính cố định đạm, phân giải phosphate và đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng IAA( Indole -3- axetic axit).

- Xây dựng được quy trình lên men thu nhận sinh khối các chủng vi

sinh vật đã được tuyển chọn nhằm sản xuất phân vi sinh.

Đối tượng

Các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate, sinh chất kích thích sinh trưởng được phân lập từ các mẫu đất được lấy tại các vị trí khác nhau trên các đảo thuộc quần đảo Trường Sa.

2. Phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm trong

các mẫu đất lấy tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa

Bước đầu thử nghiệm hiệu quả của phân bón vi sinh sản xuất được so

sánh với đối chứng.

3. Ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.

Ý nghĩa khoa học: Đề tài phân lập, tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate, sinh IAA trên một số mẫu đất thu được tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa, góp phần vào công tác cải tạo đất trồng rau và việc chăm sóc cây xanh. Ngoài ra còn tham gia bảo tồn nguồn gen đa dạng vi sinh vật tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa.

Giá trị thực tiễn: Kết quả của đề tài tham gia phục vụ cải tạo đất trồng rau và chăm sóc cây xanh phủ xanh quần đảo Trường Sa góp phần cải thiện đời sống của bộ đội trên đảo và phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN VÀ TÌNH HÌNH TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA

1.1.1. Điều kiện tự nhiên quần đảo Trường Sa

“Quần đảo Trường Sa thuộc tỉnh Khánh Hòa là một trong những khu vực có nhiều tuyến đường biển nhất trên thế giới nối liền Thái Bình Dương với Ấn Độ Dương và Đại Tây Dương, một tuyến đường huyết mạch có lưu lượng tàu thuyền tấp nập vào hàng thứ hai trên thế giới, trung bình mỗi ngày có 250-300 tàu biển các loại đi qua biển Đông. Với vị trí đặc biệt quan trọng Đảng và Nhà nước ta luôn coi củng cố quốc phòng an ninh trên các vùng biển, đảo đặc biệt là quần đảo Trường Sa. Tuy nhiên, điều kiện tự nhiên của quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho trồng trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Vì vậy, việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là việc khó khăn, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết...”

“Về khí hậu thời tiết tại quần đảo có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô. Về cơ bản, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 1 năm sau, mùa khô từ tháng 2 đến tháng 4. Nhiệt độ trung bình từ 29oC-31oC. Đổ ẩm không khí trung bình ở Trường Sa khá cao khoảng 82-83%. [1]

Độ muối trong nước biển Trường Sa khá cao. Hàm lượng muối ở tầng nước mặt thường không quá 3,5%. Tuy nhiên, ở ven các đảo nổi hoặc trong lòng các đảo chìm do quá trình bốc hơi lớn, việc lưu thông nước với toàn vùng lại kém, do vậy độ muối ở đây có thể cao hơn. Theo số liệu thống kê nhiều năm của Tổng Cục Khí tượng Thủy văn, độ muối tại trạm Trường Sa Lớn và Song Tử Tây lên tới 3,5%. Vào các tháng 8, 9, và 10, độ muối tầng mặt dao động trong khoảng 32,7%–33,5%. Ở độ sâu 100m, độ muối thường có giá trị từ 34,4% – 34,5%. [1]

Tất cả các đảo đều không có đất trồng. Trên mặt các đảo nổi ở Trường Sa thường hình thành một lớp đất phủ đặc trưng của đảo san hô vùng khơi. Có thể phân biệt hai loại: - đất cát san hô thường thấy ở ven đảo, - đất phân chim, rất phổ biến ở các đảo lớn, thường có màu nâu đen, phủ kín các mặt đảo, đây là loại rất giàu hữu cơ, đặt biệt là hàm lượng P2O5 có khi từ 15-20%. Đất phân chim có lượng phân chim chiếm khoảng từ 30-40% như ở Trường Sa Lớn và Song Tử Tây. Đất có phản ứng kiềm yếu. Hàm lượng muối tổng số của đất tới 8,5%, đạm tổng số tới 0,65–0,85%. [2]

Điều kiện khí hậu của đảo Trường Sa gây khó khăn cho công tác tăng gia sản xuất tại đảo nhất là gió mặn gây chết cây và mưa nhiều làm dập nát cây. Diện tích của từng đảo là rất nhỏ nên gió lớn có thể tạt bọt nước biển như mưa phùn vào tận giữa đảo. Vì vậy, nhà kính là phương tiện tốt nhất giúp che chắn được mưa, hơi muối và bọt nước biển. Bộ đội thường tận dụng các các khoảng trống để trồng rau. Tuy nhiên, vì vườn rau rất sát mực nước biển nên thường xuyên bị nước biển tạt làm cháy lá và nhiễm mặn đất trồng.

1.1.2. Tình hình trồng rau trên quần đảo Trường Sa

Chủng loại rau ở đảo hiện khá nghèo nàn chủ yếu là rau muống, mồng tơi, cải xanh, cải củ, bầu, mướp, rau dền, đu đủ, rau khoai lang, rau bầu đất và rau má. Trong đó, mùa khô rau muống, mồng tơi, cải xanh chiếm khoảng 80% diện tích, mùa mưa gần như chỉ còn rau muống, mồng tơi và rau lang. Riêng đu đủ, nơi nào trồng được thì cho thu hoạch quanh năm. Đa số đất trồng rau tại đảo hiện nay là phối trộn giữa đất đỏ hoặc phù sa từ đất liền chở ra với cát san hô tại đảo, phần nào được tưới nhiều phân gia súc và nước tiểu thì còn màu mỡ, phần nào được tưới ít thì nay đã bạc màu và không cho năng suất cao. [3]

Một số nguyên nhân hạn chế đến sự phát triển của rau bao gồm:

- Gió mặn: gió mùa Đông Bắc từ tháng 11 năm trước đến tháng 2 năm

sau mang hơi muối mặn, nếu che chắn không đầy đủ rau bị cháy lá.

- Mưa dầm: từ tháng 6 đến tháng 9 mưa gió nhiều, nếu không che chắn rau sẽ bị giập nát. Thêm nữa đất luôn trong tình trạng ướt, cây rau kém phát

triển. Nếu không có biện pháp che chắn hạn chế tác hại của mưa sẽ không phát triển được rau mùa mưa.

- Thiếu đất trồng và thiếu không gian. Lớp đất mặt tại chỗ thực ra là lớp cát san hô, rất thô, kém giữ nước, giữ màu. Việc trồng rau chủ yếu nhờ đất từ đất liền mang ra. Tuy nhiên, nếu không có biện pháp tăng cường chất hữu cơ, đất sẽ ngày càng nghèo kiệt. Thiếu không gian, tức thiếu nơi trồng, không chỉ ở đảo chìm mà ở đảo nổi cũng thiếu. Vì vậy cần suy nghĩ phát triển rau ở đây theo hướng thâm canh, không tăng thêm nhiều diện tích mà nâng cao hiệu suất canh tác trên mỗi mét vuông mặt bằng.

Nói tóm lại, điều kiện tự nhiên ở quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho sinh hoạt và trồng trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là không thể, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết.

Trong những năm gần đây, các kỹ thuật trồng rau xanh trên đảo đã được bộ đội áp dụng. Tuy nhiên, hiện nay năng suất rau trồng trên đảo chưa cao, chất lượng rau chưa ổn định, một phần là do chưa có quy trình kỹ thuật kiểm soát chất lượng đất trồng rau.

1.2. VI SINH VẬT CỐ ĐINH NITƠ

Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu để thực vật sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên, nguồn N chính trong tự nhiên là nitơ khí quyển (N2) thì hầu hết các sinh vật sống, bao gồm cả sinh vật nhân chuẩn không sử dụng được. Cố định nitơ sinh học là quá trình khử N2 thành ammoniac và được thực hiện ở các vi sinh vật cố định nitơ, nhờ đó mà thực vật có thể hấp thụ được nguồn dinh dưỡng nitơ. [4]

Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên [4]

Vi sinh vật có thể cố định nitơ thông qua cộng sinh (hình thành các nốt sần rễ cây đặc biệt là cây họ đậu) và không cộng sinh (sống tự do trong đất). Với sự tham gia của năng lượng ATP, các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện quá trình cố định nitơ nhờ phức hệ enzyme nitrogenase. Phức hệ enzyme nitrogenase, bao gồm 2 thành phần protein :

- “Dinitrogenase (MoFe-protein): có trọng lượng phân tử khoảng 240 KDa, cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa khử. Dinitrogenase có chứa cofactor MoFe hoặc MoFe-co.”

- “Dinitrogenase reductase (Fe-protein): protein nhỏ hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 60 KDa, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa - khử Fe4-S4, có 2 vị trí gắn ATP.

* Cơ chế cố định đạm

Theo Kneip và cộng sự (2007) [5], trong suốt quá trình cố định đạm, nitơ giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử, kết quả tạo NH3 và phóng thích H2. NH3 sau đó được sử dụng để tổng hợp các chất khác. Quá trình chuyển N2 thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự tham gia của năng lượng ATP. Enzyme dinitrogenase reductase và dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và NifD/K (α2ß2 heterotetrameric molybdoferredoxin). Điện tử chuyển từ ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3. Mỗi mol N2 được cố định

cần có 16 ATP và có sự tham gia của protein nifH. Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2 thành NH3 theo sơ đồ sau:

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 [5]

Vi sinh vật cố định nitơ thuộc nhiều chi khác nhau như, Rhizobium, Bradyrhizobium, Herbaspirillum, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Klebsiella, …

Klebsiella oxytoca M5a1 là vi sinh vật cố định đạm đầu tiên mà các gen liên quan đến quá trình tổng hợp nitơ và chức năng của enzyme nitrogenase được xác định và mô tả. Trong bộ gen của vi sinh vật này, 20 gen nif được nhóm lại trong vùng nhiễm sắc thể 24 kb, được tổ chức thành 8 operon: nifJ, nifHDKTY, nifENX, nifUSVWZ, nifM, nifF, nifLA, và nifBQ. Gen nifD và nifK mã hóa cho FeMo-protein, gen nifH mã hóa cho Fe-protein [6]

Hình 1.3 Mô hình cấy trúc các gen nif [6]

Rhizobium là một chi vi khuẩn gram âm sống trong đất có vai trò cố định đạm. Rhizobium hình thành một nhóm vi sinh vật cộng sinh cố định đạm sống trong rễ của các cây họ Đậu. Vi sinh vật này xâm chiếm tế bào rễ cây tạo thành các nốt sần rễ; ở đây chúng biến đổi nitơ trong khí quyển thành ammoniac và sau đó cung cấp các hợp chất nitơ hữu cơ như glutamin hoặc ure cho cây. Còn cây thì cung cấp các hợp chất hữu cơ cho vi sinh vật từ quá trình quang hợp [7].

Bradyrhizobium là trực khuẩn gram âm, hình que sống phổ biến trong đất có thể hình thành mối quan hệ cộng sinh với các loài thực vật họ đậu. Nhiều loài trong chi này có khả năng cố định nitơ trong khí quyển thành các dạng có sẵn cho các sinh vật khác sử dụng. Một số loài đã đươc sử dụng như nguồn phân bón nitơ thay thế như B. japonicum và B. elkanii [8]

Herbaspirillum sp. là trực khuẩn gram âm sống phổ biến trong đất, một số loài có khả năng cố đinh đạm và là vi sinh vật nội sinh có khả năng kích thích sinh trưởng của nhiều loại cây trồng như lúa [9], cao lương [10], ngô [11] và mía đường [12]

Chi Azospirillum bao gồm một nhóm vi sinh vật gram âm, sống phổ biến trong đất, sống trên bề mặt rễ hoặc nội sinh trong các mô thực vật. Azospirillum được coi là chi được cho là tốt nhất về đặc điểm của vi sinh vật thúc đẩy tăng trưởng thực vật do do khả năng cố định đạm vượt trội của chúng. Trong số các loài chính của chi là A. brasilense, A. lipoferum, A. halopraeferens và A. oryzae, được sử dụng rộng rãi làm phân bón sinh học, đặc biệt là ngũ cốc. Chủng Azospirillum brasilense Ab-V5 thúc đấy sự tăng trưởng cây và tăng hiệu quả sử dụng nitơ của cây ngô. [ 13]

Một số loài trong chi Bacillus có khả năng cố định nitơ như B. subtilis, flexus, and B. B. megaterium, B. circulans, B. aerophilus, B. oceanisediminis.Cơ sở phân tử cố định nitơ của các chủng Bacillus dị dưỡng này đã được chứng minh do sự hiện diện của gen nifH .[14]

1.3. PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN THU SINH KHỐI VI SINH VẬT

Quá trình lên men thu sinh khối vi sinh vật là quá trình nuôi cấy các chủng vi sinh vật thuần khiết hoặc hỗn hợp vài chủng để thu được khối lượng tế bào

sau khi sinh trưởng. Tuỳ vào đặc điểm sinh lý của tế bào đối với oxy mà người ta có những phương pháp lên men khác nhau. Nhưng nói chung người ta thường chia làm hai phương pháp: Lên men chìm và lên men bề mặt. [15]

1.3.1. Phương pháp lên men chìm

Phương pháp này có thể áp dụng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu khí.

Đây là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng.

Phương pháp này có những ưu điểm sau: thứ nhất là tốn ít diện tích mặt bằng xây dựng, chi phí điện năng và nhân lực thấp. Thứ hai là dễ tổ chức sản xuất và cuối cùng là các thiết bị lên mem chin dễ cơ khí hóa, tự động hóa. Nhưng nhược điểm của phương pháp này là thiết bị hiện đại, quá trình sục khí và khuấy dễ làm nhiễm vi sinh vật khác vào môi trường lên men, gây nhiễm toàn bộ mẻ nuôi cấy.

1.3.2. Phương pháp lên men bề mặt.

Phương pháp này chỉ áp dụng cho những vi sinh vật hiếu khí hay kị khí không bắt buộc. Nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt thoáng của môi trường, do vậy môi trường thường là rắn hay xốp. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành, trang thiết bị không cần hiện đại nên tiết kiệm được chi phí sản xuất. Nhưng nhược điểm của phương pháp này tốn diện tích mặt bằng, thiết bị lên men cồng kềnh nên khó cơ giới hoá, tự động hoá, lao động thủ công và lao động chân tay nhiều. Chi phí cho một đơn vị sản phẩm cao.

1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỐI QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU SINH KHỐI CỦA VI SINH VẬT CHỤI MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM

1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong sự sống của vi sinh vật, khoảng một nửa số chất khô của tế bào là cacbon. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn cacbon khác nhau cua vi sinh vật phụ thuộc vào hai yếu tố chính:

Thành phần hoá học và tính chất sinh lí của nguồn cacbon

Đặc điểm sinh lí của vi khuẩn mà cụ thể là khả năng phân giải đường

của từng loại

Cacbon là nguyên liệu chính cung cấp năng lượng cho các quá trình sống của vi khuẩn. Do vậy nguồn cacbon khác nhau sẽ ảnh hưởng đến lượng sinh khối sinh ra, hiệu suất thu hồi và các sản phẩm sinh ra....

Có hai nguồn cacbon: Cacbon vô cơ như glucoza, lactoza, saccaroza...

và cacbon hữu cơ như peptone, cao thịt nước chiết ngô...

1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ và nồng độ nitơ ảnh hưởng một cách trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào, lượng sinh khối sinh ra, chất lượng các sản phẩm của quá trình lên men.

Các chủng Bacillus có thể sử dụng được nhiều nguồn nito khác nhau như:

Nito vô cơ: các muối amoni, nitrate

Nito hữu cơ: cao nấm men, pepton, tryptone, cao thịt…

1.4.3. Các nguyên tố khoáng

Các nguyên tố khoáng tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ trong thành phần môi trường nhưng lại ảnh hưởng khá lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật.

Trong các nguyên tố khoáng photpho (P) chiếm tỉ lệ khá cao, người ta bổ sung photphat vô cơ vào môi trường ngoài tác dụng cung cấp photpho cho tế bào còn có tác dụng làm đệm pH ổn định pH của môi trường.

Các nguyên tố khác như Mg, Fe, Na, K ,Ca....và các nguyên tố vi lượng như Mn, Co….được cung cấp ở các dạng muối vô cơ hay dịch nước trái cây, tuy có vai trò quan trọng nhưng nhu cầu của các nguyên tố khoáng chỉ giới hạn ở những nồng độ nhất định.

1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của vi sinh

vật chịu mặn có khả năng cố định đạm

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật.Mỗi loài vi sinh vật thường chỉ tồn tại và phát triển trong những khoảng nhiệt độ nhất định gọi là khoảng nhiệt độ tối ưu của chúng. Ngoài giới hạn đó, vi sinh vật có thể bị ức chế phát triển hoặc bị giết chết.

Nhiệt độ tăng được cho là sẽ gây ra sự thay đổi trực tiếp mạnh nhất trong tỷ lệ cố định N bằng cách tăng quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật đất. [16]

1.4.5 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi sinh vật chịu mặn

có khả năng cố định đạm.

“Vi sinh vật bị tác động trực tiếp từ pH môi trường. Trạng thái diện tích của thành tế bào phụ thuộc vào ion hydro. Tuỳ theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với những ion nhất định. Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzym có mặt trên thành tế bào.”

“Độ pH của môi trường có ảnh hưởng đến họat động sống của vi khuẩn do làm thay đổi sự cân bằng về trao đổi chất giữa môi trường và vi khuẩn có thể giết chết vi khuẩn.”Mỗi loại vi khuẩn chỉ thích hợp với một giới hạn pH nhất định (từ 5,5 đến 8,5), đa số là ở pH trung tính (pH=7), bởi vì pH nội bào của tế bào sống là trung tính. Ở môi trường kiềm, Pseudomonas và Vibrio phát triển tốt, đặc tính này rất hữu ích để phân lập chúng. Trong khi đó Lactobacillus phát triển tốt hơn ở pH=6 hoặc thấp hơn. Trong quá trình điều chế các môi trường nuôi cấy phải đảm bảo pH thích hợp thì vi khuẩn mới phát triển tốt. Trong tiệt khuẩn hoặc khử khuẩn người ta có thể sử dụng các hóa chất có pH rất axit hoặc rất kiềm để loại trừ vi khuẩn.

Tác giả Trần Anh Nguyệt và cộng sự, 2017 [17] đã công bố kết quả Ở các ống nghiệm có pH từ 4-5 các chủng vi sinh vật không phát triển được, pH = 6 phát triển nhưng rất yếu, còn ở các ống nghiệm có pH từ 7-10 phát triển rất tốt, riêng ở pH bằng 11 có sự phát triển nhưng yếu và pH = 12 là không phát

1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển của vi sinh

vật chụi mặn có khả năng cố định đạm

Upadhyay và cộng sự. (2009)[18] đã khám phá sự đa dạng di truyền của ST-PGPR được phân lập từ thân rễ lúa mì. Họ phát hiện ra rằng hầu hết các chủng Bacillus phân lập có thể dung nạp tới 8% NaCl. Zhang và cộng sự [19] đã báo cáo về sự đa dạng của các vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ

thân rễ lúa ở Taoyuan, Trung Quốc. Họ đã phân lập được 305 chủng vi khuẩn, và trong số đó, 162 chủng được thử nghiệm về khả năng chịu muối với nồng độ NaCl lên đến 150 g / l.

Tác giả Trần Anh Nguyệt và cộng sự, 2017 [17] đã công bố kết quả là Sau hai ngày cấy hai chủng vi khuẩn vào môi trường lỏng nhận thấy rằng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức: ở nồng độ muối đối chứng là không cấy vi khuẩn thì không có sự phát triển môi trường vẫn trong. Ở các nồng độ muối 0,5-2% 2 chủng phát triển rất tốt làm đục cả môi trường, bắt đầu phát triển yếu ở nồng độ 2,5% và nồng độ từ 3-4%.

1.5 THỰC TRẠNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN CHỊU MẶN VÀO CÁC CHẾ PHẨM VI SINH TRÊN THẾ GIỚI

Tác giả Egamberdieva năm 2015 [20], đã phát hiện ra rằng vi khuẩn trong đất có khả năng chịu mặn tốt giúp cây trồng phát triển tốt hơn mà không gây hại cho con người. Những vi khuẩn này được tìm thấy xung quanh rễ. Vi khuẩn Pseudomonas, đặc biệt là Pseudomonas extremorientalis, là vi khuẩn có khả năng kháng mặn và phát triển gần rễ, nơi chúng cạnh tranh với các vi khuẩn xâm nhập khác. Nhóm đã hoàn thành một số thử nghiệm, cả trong nhà kính được bảo vệ và trên cánh đồng, làm việc chặt chẽ với nông dân địa phương. Cây trồng được xử lý bằng "phân vi sinh" cho năng suất cao hơn 12- 15% so với vi khuẩn thông thường khi bón cho cà chua và dưa chuột.

Nabti và các cộng sự (2012) [21] đã phân lập được chủng Azospirillumbrasilense NH chịu mặn có thể khôi phục và tăng khả năng sinh trưởng của cây lúa mì. Nghiên cứu của Shukla và cộng sự cũng chỉ ra rằng các chủng Brachybacterium saurashtrense JG-06, Brevibacterium casei JG- 08, và Haererohalobacter JG-11 làm tăng chiều dài và khối lượng khô của thân và rễ cây lạc bị stress mặn. Đặc biệt trong nghiên cứu của Siddikee và cộng sự [22] , có 14 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ đất ven biển có khả năng giảm tác hại của mặn lên cây cải hạt. Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng bao gồm chủng thuộc các chi Brevibacterium, Plancococcus, Exiguobacterium, Arthrobacter, Zhihengliuella, Micrococcus, Oceanimonas, Bacillus, và Corynebacterium. Các chủng vi khuẩn Enterobacter sp. MN17

và Bacillus sp. MN54 [23] khi được xử lý với cây diêm mạch có tưới nước mặn đã làm tăng khả năng giữ nước của lá và giảm hàm lượng ion Na+ trong lá, từ đó làm giảm stress thẩm thấu và ion. Nhờ vậy tăng khả năng sinh trưởng của cây diêm mạch hơn so với không sử dụng vi khuẩn.

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nước có công nghệ phát triển như Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc, New Zealand, Trung Quốc,... phát triển các công nghệ, kỹ thuật trồng rau xanh tại các khu vực đất đai cằn cỗi, hạn hán, hoặc nhiễm mặn. Ngoài ra các nước có điều kiện khí hậu hạn hán, sa mạc cũng đầu tư tiềm lực và sử dụng công nghệ canh tác tiết kiệm nước ngọt như Israel, Nam Phi. Đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng diễn biến phức tạp, toàn cầu đang phải tập trung để nghiên cứu hạn chế tối đa sự ảnh hưởng này đến sản xuất và đời sống kinh tế. Một trong những mối lo ngại lớn nhất trong vấn đề này là sự xâm nhập mặn đất nông nghiệp trồng trọt, nuôi trồng thủy sản do nước biển dâng cao. Để đối phó và chủ động hạn chế ảnh hưởng, một trong những giải pháp là sử dụng các chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất phân bón vi sinh cải tạo đất nông nghiệp nhiễm mặn và tăng khả năng chịu mặn của cây trồng. Phân bón VSV được sản xuất bằng cách phối trộn sinh khối VSV ở một mật độ nhất định vào chất mang vô trùng hoặc không vô trùng [24].

Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển hoá chất hữu cơ. Các nhóm vi sinh vật thường được đưa vào sản xuất phân vi sinh, phân hữu cơ vi sinh thường là:

- Nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter, Azospirillum, vi

khuẩn lam và Rhizobium

- Nhóm vi sinh vật phân giải lân khó tan Bacillus polymixa, Bacillus

megaterium, Aspergilus awamori,

- Nhóm vi sinh vật phân giải cellulose và lignin: vi khuẩn

Cellulomonas sp, nấm sợi Aspergillus niger, xạ khuẩn Actomyces sp

- Nhóm vi sinh vật đối kháng nấm sợi Tricholoderma sp, Fusarium sp,

vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacilus acidophilus

- Nhóm vi sinh vật giữ ẩm cho đất Saccharomyces cerevisae, lipomyces

PT7.1

- Nhóm vi sinh vật hạn chế sâu bệnh Bacciluss thuringiensis

- Nhóm vi sinh vật sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật

Anthrobacter, Agrobacterium, Flavobaterium....

Phân bón vi sinh vật cố định đạm được sản xuất từ vi sinh vật cố định đạm. Sản phẩm này chứa một hoặc nhiều vi sinh vật cố định đạm, có tác dụng cố định đạm (N) từ không khí chuyển hóa thành các hợp chất chứa N cho đất và cây trồng, bổ sung hàm lượng đạm cho rễ cây. Phân vi sinh cố định đạm tự do được sử dụng rộng rãi nhất với thành phần trong số các vi khuẩn loại này là Azotobacter và Clostridium. Hỗn hợp các vi sinh vật này đã được các nhà khoa học Mỹ và Úc sản xuất và thương mại hóa dưới tên E.201 và đã được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới. Phân bón vi sinh cố định đạm kết hợp với phân bón giúp lá xanh tốt hơn và cây phát triển nhanh hơn, giảm chi phí hơn so với sử dụng phân hóa học. Dùng phân bón vi sinh cố định đạm giảm tỷ lệ sâu bệnh 25 – 50% so với phân bón truyền thống. Ngoài ra còn tăng khả năng chống chịu cho cây trồng, cải tạo đất, cân bằng dinh dưỡng hữu cơ. Một đặc điểm nữa là dùng phân bón này thân thiện với môi trường, an toàn cho sức khỏe vật nuôi và con người và có thể bón trực tiếp cho cây trồng trước khi thu hoạch.

Bên cạnh những ưu điểm thì loại phân bón vi sinh cố định đạm cũng có những nhược điểm của nó. Thứ nhất, phân bón VSV cố định nitơ tốt phải có chủng VSV có cường độ cố định nitơ cao, sức cạnh tranh lớn, thích ứng với dải pH rộng, phát huy được trên nhiều vùng sinh thái khác nhau. Thứ hai, chất lượng của phân bón VSV khó đảm bảo do hàm lượng VSV không ổn định. Thứ ba, hiệu quả của phân bón VSV cố định nitơ còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của các VSV có trong phân vi sinh. Và cuối cùng là phân bón VSV cố định đạm dễ bị bay hơi, dễ hoa tan và bị rửa trôi khi gặp mưa dầm.

1.6 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG NƯỚC

Lâm Bạch Vân (2008) [25] bổ sung dòng vi sinh vật cố định đạm Azospirillum lipoferum lên cây lúa, khoai lang đã làm tăng năng suất và tiết kiệm được 45 kg N/ha.

Lê Thị Diễm Ái (2010) [26] sử dụng hai dòng vi sinh vật cố định đạm (Azospirillum lipoferum và Pseudomonas stutzeri) bổ sung trên lúa ở dạng lỏng hoặc dạng viên kết hợp 50% phân bón hóa học đã thu năng suất tương đương với nghiệm thức bón 100% phân hóa học, đồng thời hàm lượng protein trong gạo tăng.

Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2012) [27] sử dụng ba dòng vi sinh vật là Burkholderia tropicalis, B.tropica và Pseudomonas stutzeri kết hợp 150 kg N, 60 kg P2O5 và 200 kg K2O/ha bón cho cây dứa làm tăng kích thước, khối lượng và năng suất tương đương bón 300 kg N/ha.

Theo Nguyễn Minh Hưng và cộng sự (2007), ở Việt Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự do với tên thương mại là e.2001 đã được khảo nghiệm hiệu lực đối với cây trồng trên đồng ruộng và được đưa vào danh mục các loại phân bón được phép sử dụng tại Việt Nam. Còn sản phẩm phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh được nghiên cứu và phát triển từ những năm 90 của thế kỷ XX trong khuôn khổ của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.08.01. [28]

Có nhiều cách để sử dụng phân bón vi sinh cố định đạm. Cách thứ nhất là tẩm phân vào hạt hoặc rễ trước khi gieo trồng. Sau khi tẩm hạt giống cần được gieo trồng và vùi vào đất ngay. Cách thứ hai là bón trực tiếp vào đất.

Quá trình sản xuất phân vi sinh theo hai giai đoạn chủ yếu sau:

+ Giai đoạn 1: Tìm nguyên liệu sản xuất chất mang. Chất mang được dùng là các hợp chất vô cơ (bột photphorit, bột apatit, bột xương, bột vỏ sò,..) hay các chất hữu cơ (than bùn, bã nấm, phế thải nông nghiệp, rác thải,..). Chất mang được ủ yếm khí hoặc hiếu khí nhằm tiêu diệt một phần VSV tạp và

trứng sâu bọ, bay hơi các hợp chất dễ bay hơi và phân giải phần nhỏ các chất hữu cơ khó tan.

+ Giai đoạn 2: Cấy vào chất mang trên các chủng vi sinh vật cố định đạm thuần khiết trong điều kiện nhất định để đạt được hiệu suất cao. Để cho phân vi sinh được sử dụng rộng rãi, người ta thường chọn các chủng vi sinh có khả năng thích nghi rộng hoặc dùng nhiều chủng trong cùng một loại phân.[29]

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu

Mẫu đất thu được từ các đảo trên quần đảo Trường Sa: 42 mẫu đất trên

11 đảo

Bảng 2.1: Kí hiệu và vị trí lấy mẫu đất trên quần đảo Trường Sa

Tên đảo Vị tí lấy mẫu Kí hiệu

Đất nền cổ ĐL1

Đá Lát Đất trồng rau ĐL2

Đất gốc cây cổ thụ ĐL3

Đất trồng rau ĐN1 Đá Nam Đất nền cổ ĐN2

Đất vườn rau TSL1

Trường Sa lớn Đất gốc cột điện TSL2

Đất nền cổ TSL3

Gốc Cột địện NY1

Đất vườn rau NY 2 Nam Yết Đất nền cổ NY3

Đất gần nhà bếp NY4

Đất vườn trồng rau ST1

Đất cát Sinh Tồn ST2

Đất nền ST3

Gốc cây AB1

Vườn rau AB2 An Bang Ven bờ AB3

Gần nhà bếp AB4

K1 Gốc cây

K2 Vườn rau Sơn Ca K3 Ven bờ

K4 Đất gần nhà bếp

PVA1 Gốc cây

PVA2 Vườn rau

PVA3 Phan Vinh A Ven bờ

PVA4 Gần nhà bếp

PVA5 Gần nhà vệ sinh

STĐ1 Gốc cây

STĐ2 Vườn rau

STĐ3 Sinh Tồn Đông Ven bờ

STĐ4 Gần nhà bếp

STĐ5 Gần nhà vệ sinh

STT1 Gốc cây

STT2 Vườn rau

STT3 Song Tử Tây Ven bờ

STT4 Gần nhà bếp

STT5 Gần nhà vệ sinh

ĐT1 Đá Thị Vườn rau

2.1.2. Hóa chất và môi trường

- Môi trường Burk’s không đạm [30]: saccharose 20 g/l; KH2PO4 0.41

g/l; K2HPO4.3H2O 0.68 g/l; MgSO4.7H2O 0.1 g/l; Na2SO4 0.05 g/l; CaCl2 0.2g/l; FeSO4.7H2O 0.005 g/l; Na2MoO4.2H2O: 0.0025 g/l.

- Môi trường nutrient agar (NA), Luria Bertani (LB) được mua từ hãng

Himedia (Ấn Độ).

- Môi trường NBRIP: Glucose 10 g/l; Ca3(PO4)2 5 g/l; MgCl2 5 g/l;

MgSO4.7 H2O 0.25 g/l; KCl 0.2 g/l; (NH4)2SO4, 0.1 g/l.

- Môi trường King B medium: peptone 2 g/l; K2HPO4.3H2O 1.15 g/l;

MgSO4.7 H2O 1.5 g/l; glycerol 10 ml/l.

- Môi trường nutrient broth: Peptone 5g/l, Cao thịt 3g/l.

- Hóa chất K2HPO4.3H2O, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, indole acetic acid, NaOH, glycerol, huyết thanh bò, H2SO4 do hãng merck sản xuất.

- Hóa chất saccharose và glucose do Việt Nam sản xuất.

- Hóa chất Na2SO4, CaCl2, Ca3(PO4)2, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4, phenol,

Na2CO3 do Trung Quốc sản xuất.

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: bình định mức (100 mL, 250 ml), bình định lượng (100 ml, 500 ml), bình tam giác, bông gòn, cốc đong (50 ml, 200 ml, 1 l), đĩa petri, giá đựng ống nghiệm, ống nghiệm, ống falcon (15 ml, 50 ml), ống eppendorf, đầu côn (10 µl, 100 µl, 1.000 µl), và que cấy.

- Thiết bị: nồi khử trùng, cân phân tích, kính hiển vi, máy lắc vi sinh, máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ, máy đo nồng độ oxy hòa tan Hanna, micropipette, thiết bị ổn nhiệt, hệ thống lên men phòng thí nghiệm ...

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu đất theo tiêu chuẩn TCVN 7538-2: 2005.[31]

2.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu mặn và

bảo quản [32]

- Cân 10 gram đất vào bình tam giác 250 ml chứa 90 ml nước muối

sinh lý vô trùng. Lắc 120 vòng/phút trong 30 phút.

- Pha loãng dịch mẫu đến nồng độ 10-6. Lấy 100 µl dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng10-4, 10-5, 10-6 cấy trang lên các đĩa petri chứa môi trường Bruck’s không đạm có bổ sung 3 % NaCl. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa.

- Ủ đĩa trong 3-5 ngày ở 28°C. Trong quá trình đó quan sát các khuẩn lạc

mọc lên hàng ngày.

- Các chủng vi sinh vật được chọn lọc thông qua hình thái bề mặt,

màu sắc

- Các khuẩn lạc được làm sạch và lưu giữ trong ống nghiệm bảo quản ở

40 C và bảo quản lạnh sâu ở - 800 C trong glycerol.

2.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn

[32]

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng phân lập được

đánh giá theo phương pháp của Cao Ngọc Điệp.

- Đặc điểm khuẩn lạc bao gồm kích thước khuẩn lạc, hình dạng, màu

sắc, độ nổi và dạng rìa.

- Đặc điểm tế bào vi khuẩn bao gồm các hình dáng và sự di động của tế báo được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Các tế bào vi khuẩn được nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Một số dòng vi khuẩn có tiềm năng được tiến hành chụp ảnh tế bào dưới kính hiển vi điện tử.

2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Số lượng tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi cấy trên môi trường thạch [33]. Mẫu cần xác định số lượng được lắc đều dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch chứa vi khuẩn cho vào ống chứa 9 ml dung dịch muối sinh lý (NaCl = 0.9%) vô trùng, trộn đều. Sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp tuỳ theo mật độ vi sinh vật ở mẫu. Lấy 0,1 ml dịch pha loãng ở nồng độ thích hợp cấy trang trên môi trường thạch tương ứng. Mỗi nồng độ cấy trang trên 3 đĩa và đếm số khuẩn lạc.

Nuôi cấy ở nhiệt độ tủ ấm 320C. Sau 3 ngày thì đếm số lượng khuẩn lạc vi

khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức:

CFU/ml (g) = a.1/K.1/V

Trong đó:

CFU- Conoly forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc riêng rẽ)

a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa thạch có cùng độ

pha loãng.

V: Thể tích dịch pha loãng được cấy trang trên đĩa thạch.

K: Độ pha loãng của dịch được nuôi cấy.

2.2.5 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn

Quá trình tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo

phương pháp của Sakiyama et al., bao gồm các bước như sau:

- Nuôi tế bào trong ống nghiệm có chứa 4 ml môi trường Bruck’s lỏng

qua đêm ở 28 °C và lắc với tốc độ 120 vòng/phút .

- Lấy 1 ml dịch nuôi cấy và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5

phút để thu sinh khối.

- Bổ sung dung dịch đệm gồm (10 mM Tris + 1 mM EDTA, pH 8) và

dung dịch SDS 50%.

- Bổ sung 10 µl proteinase K (10 mg/L) và ủ ở 65°C trong 20 phút, cứ

sau 5 phút, đảo ngược ống eppendorf để trộn đều dung dịch.

- Bổ sung thêm 200 µl 10% CTAB/0,7M NaCl, trộn nhẹ nhàng, ủ ở 65

°C trong 20 phút.

- Bổ sung thêm 300 µl chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) rồi lắc trong 10 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển lớp trên cùng sang ống eppendorf mới.

- Phần dịch nổi trên mặt (0,5 ml) được trộn với 1 ml isopropanol và giữ

ở -20 °C trong 30 phút.

- Thu cặn DNA bằng cách ly tâm ở 13.000 vòng/phút, 4°C trong 10 phút.

- DNA được rửa hai lần với 1 mL ethanol 70% và ly tâm ở 12.000

vòng/phút, 4 °C trong 20 phút.

- Bổ sung thêm 30 µl nước cất vô trùng, và bảo quản DNA ở -20 °C.

- DNA sau đó được điện di trên agarose gel 1% và kiểm tra bằng máy

Biorad UV 2000.

2.2.6. Khuếch đại gen 16S rRNA

ngược 1492R và mồi

Vùng gen 16S rRNA được khuếch đại bởi các đoạn mồi xuôi 27F (5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') (5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' [34]. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: DNA 30 ng, master mix (10X), mồi 27F 0,2 μM, mồi 1495R. Chu trình khuếch đại PCR: biến tính ban đầu ở nhiệt độ 95°C trong 3 phút, 30 chu kỳ (95°C trong 1 phút, 54°C trong 1 phút, 72°C trong 2 phút), và kéo dài ở 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp ảnh bằng máy ảnh gel Biorad UV 2000.

Các sản phẩm PCR được giải trình tự trên máy phân tích ABI PRISM®3100-Avant. Sau đó xử lý các đoạn trình tự thu được trên phần mềm Clustal X [35]. Trình tự 16S rRNA của các chủng được so sánh với trình tự 16S rRNA của các loài được công bố trên ngân hàng GenBank.

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm MEGA 7.

2.2.7. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitơ

- Những chủng vi khuẩn có khả năng mọc trên môi trường Burk’s

không đạm thì có khả năng cố định đạm.

- Chọn những chủng sinh trưởng mạnh (mọc nhanh, sinh khối nhiều) trên môi trương thạch Burk’s. Chuyển sang môi trường Burk’k dịch thể nuôi lắc 120 vòng/phút, sau 72h đem ly tâm dịch nuôi lấy dịch trong để xác định lượng NH+ 4 sinh ra bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler.

1.2

y = 0.0478x R² = 0.989

0.8

0.6

0.4

0.2

OD 625 nm

+(mg/l)

NH4

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn ammonium sử dụng dung dịch chuẩn (NH4)2SO4

2.2.8. Sàng lọc các chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan

- Khả năng phân giải lân được đánh giá bởi vòng phân giải phosphate

xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường NBRIP agar [36]

- Những chủng có khả năng phân giải phosphate được khảo sát tiếp bằng cách nuôi trong môi trường lỏng NBRIP, lắc 120 vòng/phút ở 30 0C. Sau 72h nuôi nồng độ phosphate hòa tan trong dịch nuôi được xác định theo phương pháp so màu Blue-molyphen ở bước sóng 700nm. [37]

- Lập đường chuẩn Phosphate: Chuẩn bị 9 ống nghiệm đánh số lần lượt 3-(mg/l) lần lượt là 0, 5, 10, 15, 25, 35, 40, 45,

từ 0 đến 9 với các nồng độ PO4 50 mg/l rồi tiến hành thí nghiệm theo các bước như bảng sau

Bảng 2.2: Kết quả các phép đo OD

3-(mg/l)

0 5 10 15 25 35 40 45 50 Nồng độ PO4

Ống Falcon 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0.1 0.2 0.3 0.5 0.7 0.8 0.9 1.0 Dung dịch chuẩn KH2PO4 (mL) 0

10 9.9 9.8 9.7 9.5 9.3 9.2 9.1 9.0 Thêm H2O (mL)

4 Thêm K2S2O8 5%(mL)

Hấp khử trùng tại nhiệt độ 121oC trong 30 phút

Để nguội rồi tiếp tục định mức lên 25mL

Thêm Ascorbic 10% (mL) 0,5

Để yên trong 15 giây

1 Thêm dung dịch Mo(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (mL)

Để yên trong 15 phút sau đó đo OD700nm.

OD 700 nm 1

0.8

y = 0.018x R² = 0.9991

0.6

0.4

0.2

3- (mg/l)

PO4

Xây đựng phương trìnhhồi quy tuyến tính của đường chuẩn

Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn phosphate sử dụng dung dịch chuẩn KH2PO4.

2.2.9. Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng chọn lọc

Các chủng vi khuẩn chọn lọc có khả năng cố định đạm và phân giải phosphate được đánh giá khả năng tổng hợp chất kích thích tăng trưởng IAA. Phương pháp thử hoạt tính IAA sử dụng thuốc thử Salkowski .[38]

- Các chủng phân lập được nuôi trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường King’ B bổ sung thêm L-tryptophan 0,5 g/l, nuôi lắc 120 vòng/phút ở 30 oC trong 72h.

- Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 1 ml dịch trong sau khi ly tâm trộn với 1 mL thuốc thử Salkowski (FeCl3 0,5 M trong H2SO4 98%, nước cất) và ủ trong bóng tối trong 30 phút. Mẫu dịch có chứa IAA thì xuất hiện màu đỏ và được đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 535 nm. Căn cứ vào đường chuẩn IAA để tính hàm lượng IAA sinh ra của từng chủng.

Các chủng có khả năng sinh IAA cao được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

- Lập đường chuẩn IAA: Chuẩn bị 9 ống nghiệm đánh số lần lượt từ 0 đến 9 rồi tiến hành thí nghiệm theo các bước như bảng sau:

Nồng độ IAA (µg/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Dung dịch chuẩn IAA (µL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 H2O (µL)

Thuốc thử Salkowski 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

3

y = 0.0317x R² = 0.9904

2.5

2

1.5 m n 0 3 5 D O

1

0.5

0

20

40

60

80

100 IAA (µg/mL)

Hình 2.3 Đường chuẩn IAA

2.2.10. Phương pháp xác định đường tổng bằng phenol và acid

sulfuric

Nguyên tắc:

Axit sulfuric có khả năng phân cắt các đường có phân tử lượng lớn tạo thành glucose. Glucose tạo phức màu với phenol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 490 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn ta có thể xác định được hàm lượng đường tổng số trong mẫu.

Chuẩn bị:

- Hoá chất : H2SO4 đặc, dung dịch phenol 5%

- Dịch ly tâm canh trường nuôi cấy

- Pha dung dịch glucose chuẩn: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 mg/l

Tiến hành:

- Hút 0,5 ml mẫu + 0,5 ml phenol 0,5%+2,5 ml H2SO4 đặc

- Lắc đều, để nguội, rồi đo OD ở bước sóng 490 nm.

0.9

0.8

Dựa vào đường chuẩn để xác định lượng đường tổng số có trong mẫu.

y = 0.0121x - 0.0335 R² = 0.9912

0.7

0.6

0.5

D O

0.4

0.3

0.2

0.1

100

mg/l

Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn glucose

2.2.11. Phương pháp định lượng protein bằng phương pháp Lowry.

[39]

Nguyên tắc: Dựa vào đường chuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein.

Chuẩn bị :

+ Dung dịch 1: dung dich Na2CO3 trong NaOH 0,1N

+ Dung dịch 2: dung dịch CuSO4 1%

+ Dung dịch 3: dung dịch muối seignhett 2%

+ Dung dịch 4: dung dịch Folin pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1

+ Làm đường chuẩn: Pha dung dịch protein huyết thanh bò chuẩn có các

dải nồng độ từ 0.05 đến 0.9 g/l.

Tiến hành :

- Pha dung dịch hỗn hợp của dung dịch 1, 2, 3 với tỉ lệ 100 :1 :1

- Hút 1 ml dung dịch hỗn hợp + 0,1 ml dung dịch mẫu để ở 300C trong 10 phút, sau đó bổ sung 1 ml dung dịch 4 rồi để tiếp ở 300C trong 30 phút rồi đo ở bước sóng 660 nm.

1.2

y = 0.0025x - 0.0429 R² = 0.992

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

mg/l

100

200

300

400

500

Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng protein có trong mẫu.

Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn biển diễn protein.

2.2.12. Phương pháp lên men

Quá trình lên men dịch thể được tiến hành trong các bình tam giác dung tích từ 100 ml, 250 ml, 500 ml chứa môi trường tương ứng tuỳ từng thí nghiệm, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ nghiên cứu, thời gian lên men có thể từ 18 đến 72 giờ. Kết thúc quá trình lên men lấy dịch lên men để phân tích các chỉ tiêu cần thiết.

2.2.13. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.2.13.1 Ảnh hưởng của NaCl lên sinh trưởng, khả năng cố định nitơ

và tổng hợp IAA

Chủng vi sinh được nuôi cấy trong môi trường được bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, và 10%. Dịch vi khuẩn được nuôi ở trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở 30°C. Sau 72h thu dịch lên men xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và ly tâm 10,000 vòng/ phút trong 5 phút lấy dịch trong đo nồng độ + IAA bằng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowki, đo hàm lượng NH4 bằng phương pháp indolephenol blue. Từ đó chọn được nồng độ muối thích hợp cho sự tổng hợp amoni, tăng chất kích thích sinh trưởng IAA và khả năng sinh trưởng của vi sinh vật.

2.2.13.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh trưởng

của các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm

a) Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon.

Dùng môi trường dịch thể Bruck’s với các nguồn carbon có hàm lượng

10 g/l gồm: glucose, sucrose, tinh bột, manitol, lactose…

Tiến hành nuôi cấy dịch môi trường với các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm với các nguồn cacbon như trên ở pH 7 trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24h nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nguồn cacbon thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn.

b) Ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon

Nuôi lắc các chủng chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon thích hợp nhất vừa được xác định, với các nồng độ khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25, 30 g/l ở pH 7 trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nồng độ cacbon thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn.

2.2.13.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối của các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa. Tiến hành nuôi cấy các chủng chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau: 25oC; 27 oC, 30oC, 35oC, 37 oC ,40oC, 45oC trên máy lắc có tốc độ 120 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn.

2.2.14.4 Ảnh hưởng của pH

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh khối các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa tiến hành tăng sinh các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa chọn lọc trên môi trường Bruck’s chứa nguồn carbon, nồng độ carbon và nhiệt độ thích hợp nhất đối với các chủng đã chọn lọc ở các pH khác nhau: 5.5; 6; 6,5; 7,5; 8; 8.5; 9 trên máy lắc xoay 120 vòng/phút. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn được pH thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn.

2.2.13.5 Ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối

Các chủng vi sinh vật được nhân sinh khối trên môi trường có các yếu tố thích hợp để tăng sinh khối chủng vi sinh vật như nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ… Trong quá trình nuôi lấy mẫu ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 48h để xác định mật độ tế bào sinh ra, hàm lượng đường, đạm tiêu hao trong quá trình lên men. Từ đó chọn được thời gian để sinh khối đạt cực đại cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn .

2.2.14 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm phân vi sinh chịu mặn cố định đạm [29][40]

Các chất dinh dưỡng Giống vi sinh vật

Tạo môi trường lên men

Nhân giống cho sản xuất (cấp1, 2)

Các điều kiện cần thiết cho lên men

Giống cho sản xuất Lên men

Thu sinh khối

Trộn với chất mang

Chế phẩm

Qui trình tạo chế phẩm vi sinh: Sinh khối vi sinh vật sau quá trình lên men được ly tâm và trộn với chất mang sạch được lựa chọn là mùn hữu cơ để đạt chế phẩm phân vi sinh có vi sinh vật đạt mật độ 108 cfu/g.

2.2.15. Thử nghiệm, đánh giá chế phẩm vi sinh

Thí nghiệm có 2 công thức :

Công thức 1: Hạt được trồng trên mẫu đất nền cổ lấy từ đảo Trường Sa xử lý sạch về mặt vi sinh vật được phối trộn chất mang mùn dùng làm phân vi sinh cố định đạm xử lý sạch về vi sinh vật làm đối chứng 1.

Công thức 2: Hạt được trồng trên mẫu đất nền cổ lấy từ đảo Trường Sa được xử lý sạch về mặt vi sinh vật phối trộn phân vi sinh cố định đạm từ hai chủng vi khuẩn chụi mặn bản địa.

Mỗi công thức gồm 3 khay ( 3 lần lặp lại). Hạt rau muống sẽ được gieo vào hai giá thể trông cây trên. Quy trình chăm sóc theo hưởng dẫn canh tác rau thông thường.

Các chỉ tiêu theo dõi số lá trên cây, chiều cao cây, khối lượng rễ, trọng

lượng tươi sau 30 ngày gieo hạt.

Thí nghiệm gồm 2 lô: 01 lô đối chứng không nhiễm vi sinh vật chịu mặn cố định đạm bản địa.; 1 lô thực nghiệm có xử lý nhiễm vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp 3 khay.

Các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng của cây rau muống sau 30 ngày tuổi: số lá/cây, chiều cao cây, chiều lá, khối lượng rễ, khối lượng tươi. Các chỉ tiêu được đo đếm theo phương pháp thông thường.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP VI SINH VẬT CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ MẪU ĐẤT LẤY TẠI CÁC ĐẢO THUỘC QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA

Từ 42 mẫu đất được thu thập từ các vi trí khác nhau trên quần đảo Trường Sa, đã phân lập được 185 chủng trên môi trường môi trường NA có bổ sung 3% NaCl.

Từ 185 chủng vi sinh vật phân lập được tiến hành nuôi cấy trên môi trường Burk’s không đạm. Những chủng sinh trưởng được trên môi trường này là những chủng có khả năng cố định nitơ. Đã lựa chọn được 36 chủng.

Kết quả hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật cố định đạm chịu

mặn được trình bày trong bảng 1 phần phụ lục

Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm

Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của chủng STT3 3.1 quan sát dưới vật kính 100X

Hình 3.3: Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của của chủng N 4.1 quan sát dưới vật kính 100X

3.2. KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN PHOSPHATE VÀ SINH IAA CỦA CÁC CHỦNG CHỌN LỌC

Tiến hành nuôi cấy 36 chủng vi khuẩn được lựa chọn trên môi trường Bruck’s để xác định khả năng cố định đạm. Ba mươi sáu chủng trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp amoni khá cao (Hình 3.4). Nồng độ amoni tạo ra từ 12,78 đến 25,18 mg/l. Trong đó hai chủng STT3 3.1 và N4.1 có hoạt tính sinh học đạt kết quả cao nhất lần lượt là 25,18 ± 1,14 mg/l và 19,02 ± 0,21 mg/l sau 72h nuôi cấy. Kết quả tương tự cũng được các tác giả Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Tiệp (2018) công bố, họ đã phân lập được 116 chịu mặn trên môi trường Burk’s từ đất sản xuất lúa - tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang. Tất cả 116 vi khuẩn có khả năng tổng hợp amoni. Trong đó hai dòng PL2, PL9 có cả nitơ cố định nitơ cao, ammoni tổng hợp PL2 đạt 3,73 mg/l, PL9 đạt 2,71 mg/l [31].

Hình 3.4: Đồ thị thể hiện hàm lượng amoni tổng hợp của 36 chủng.

Sàng lọc khả năng phân giải phosphate khó tan từ 36 chủng vi khuẩn cố định đạm phân lập từ đất Trường Sa trên. Tiến hành nuối cấy các chủng vi 3- sinh khuẩn này trên môi trường NBRIP dịch thể để xác định hàm lượng PO4 ra. Thí nghiệm này được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình các lần đo, số liệu được xử lý qua phần mền IRISTART có chỉ số LSD= 1,085. Cv% là 0,5%. Kết quả được trình bày trong hình 3.5.

Trong 36 chủng vi khuẩn phân giải phosphate, hai chủng AB3 1.3, chủng STT3 và chủng N4.1 có hoạt tính đạt hiệu quả cao nhất lần lượt là 307,08 ± 1,08 mg/l và 295,02 ±1,08 mg/l và 282,88± 1,08mg/l sau 96h nuôi cấy, cao hơn so với các chủng còn lại. Thấy rằng tác giả Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2017) [41] cũng đã phân lập được chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối 10%, hoạt tính phân giải phosphate cao nhất khi nồng độ muối 1% là 145,55 mg/l.

Hình 3.5. So sánh khả năng phân giải phosphate của các chủng phân lập

Từ 36 chủng vi sinh vật cố định đạm tiếp tục tiến hành thí nghiệm sàng lọc khả năng sinh IAA. Ba mươi sáu chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B. Kết quả thể hiện trong hình 3.6, thu được 33 chủng có khả năng sinh IAA trong đó chủng N4.1 cho lượng IAA sinh là nhiều nhất đạt 33.49±0,33 mg/l. Các chủng vi khuẩn trong báo cáo này có khả năng sinh

IAA tương đối giống với các chủng được phân lập bởi Nguyễn Thị Thu Hà (2009) [24]. Tác giả này đã phân lập được vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA 5,84 đến 39,64 mg/l, trong đó chủng H4 sinh IAA đạt 39,64 mg/l. Cao Ngọc Diệp (2015)[33] phân lập các chủng vi sinh vật khả năng tổng hợp IAA từ 2,352μg/ml đến 5,741μg/ml. Nồng độ cao nhất là KL39a với nồng độ IAA là 5,741 mg /l. Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Tiệp (2018)[31] đã được phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Burk bổ sung 1% muối. Tất cả 116 chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có khả năng tổng hợp ammonium và axit axetic indole tổng hợp (IAA). Các dòng PL2 và PL9 có cả cố định nitơ và tổng hợp IAA cao: IAA tổng hợp PL2 đạt 45,31mg/mL; PL9 tổng hợp IAA đạt 46,46 mg/l, giống với các chủng trong nghiên cứu này [9]. Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2017) [41] đã phân lập được chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối 10% và sinh IAA đạt 68,79 mg/l.

Hình 3.6.So sánh khả năng sinh IAA của 36 chủng vi khuẩn.

Từ 3 thí nghiệm trên với các số liệu được kiểm tra đánh giá độ tin cậy cao với giá trị LSD đạt trong khoảng 0,31 đến 1,08 là khoảng giá trị đáng tin cậy, chúng tôi đã tuyển chọn được 2 chủng vi sinh vật là N4.1 và STT3 3.1 có các hoạt tính cố định đạm, phân giải phosphate và khả năng sinh IAA cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.3 GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rRNA CỦA HAI CHỦNG CHỌN LỌC N4.1 VÀ STT 3 3.1

DNA tổng số của 2 chủng vi khuẩn được tách chiết bằng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Gen 16S rRNA được khuếch đại và giải trình tự bằng cặp mồi phổ thông 27F và 1492R. Trình tự 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn được xác định trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). Các đoạn trình tự thu được được sắp xếp thẳng hàng với nhau bằng công cụ Seqman trong phần mềm DNASTAR để đạt được trình tự gen 16S rRNA hoàn chỉnh.

Những trình tự 16S rRNA hoàn chỉnh được so sánh với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu GenBank để xác định tỷ lệ tương đồng. Kết quả so sánh 16S rRNA được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của chủng N 4.1 và STT3 3.1

TT Chủng Loài gần nhất Kí hiệu chủng Tương đồng (%)

1 N 4.1 Bacillus aryabhattai MH261073 99

2 STT3 3.1 Bacillus megaterium IAM 13418T 100

Cây phát sinh chủng loại được thực hiện trên chương trình MEGA7. Khoảng cách tiến hóa được tính toán dựa theo thông số của Tamura-Nei. Phương pháp tiến hóa được sử dụng xây dựng cây phát sinh loài loại là Neighbor-joining. Phân tích bootstrap với 1000 sự lặp lại được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và độ tin cậy cho từng nhánh trong cây phát sinh loài. Chủng STT 3 3.1 cùng một phân nhành với loài Bacillus megaterium, chủng N 4.1 cùng một phân nhánh với loài Bacillus aryabhattai (hình 3.7).

Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3 3.1.

Nhóm vi khuẩn được lựa chọn phân lập từ đất trên đảo Trường Sa thuộc chi Bacillus, đây là chi có rất nhiều loài ứng dụng trong nông nghiệp như Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hai chủng có khả năng cố định đạm cao thuộc hai loài Bacillus aryabhattai và Bacillus megaterium. Akinrinlola và cộng sự (2018) [33] đã phân lập được chủng Bacillus megaterium R232 và Bacillus megaterium R18 có khả năng kích thích sinh trưởng cho cây ngô, lúa mì và đậu tương. Hai chủng này có đều có khả năng có định đạm, phân giải cellulose, phân giải phosphate và sinh tổng hợp IAA. Park và cộng sự, (2015) [44] đã phân lập được chủng Bacillus aryabhattai từ đất và rễ lúa khả năng kích thích sinh trưởng thực vật. Shen và cộng sự (2019) [45] đã phân lập được hai chủng Bacillus aryabhattai E7, Bacillus aryabhattai MN1 nội sinh từ rễ cây lúa non có khả năng sinh tổng hộp IAA, cố định nitơ và hòa tan phosphate.

3.4.ẢNH HƯỞNG CỦA NACL LÊN KHẢ NĂNG SINH IAA CỦA CHỦNG N 4.1 VÀ KHẢ NĂNG SINH AMONI CỦA CHỦNG STT3 3.1

Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy chủng N4.1 có khả năng sinh IAA cao, chủng STT3 3.1 có khả năng cố đạm định cao nên chúng tôi tiến

IAA (mg/l)

cfu/ml

3.5

2.5

) l / g m ( A A

1.5

m / u f c t i r i a g o L ( g n ở ư r t h n S

0.5

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

NaCl (%)

hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ muối để khả năng sinh IAA, khả năng cố định đạm và sự phát triển của hai chủng vi khuẩn trên. Hai chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường được bổ sung các nồng độ muối khác nhau 0%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%. Dịch vi khuẩn được nuôi ở trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở 30°C. Sau 72h thu dịch lên men xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút lấy dịch trong nồng độ IAA bằng phương pháp + so màu với thuốc thử Salkowski, hàm lượng NH4 bằng phương pháp Indolephenol blue. Kết quả được thể hiện ở hình 3.8 và hình 3.9.

Hình 3.8: Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp IAA của chủng N4.1

Amoni (mg/l)

cfu/ml

4.5

) l

3.5

) l / g m

2.5

( i

n o m A

1.5

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

0.5

5 NaCl (%)

Hình 3.9 : Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp amoni của chủng STT3 3.1

Qua kết quả thể hiện ở hình 3.8 và 3.9 cho thấy rằng hai chủng vi khuẩn được lựa chọn phát triển tốt, khả năng sinh IAA và tổng hợp amoni cao trong môi trường có nồng độ muối từ 0% - 3%. Khi nồng độ muối càng tăng từ 4%-10% thì sự phát triển của vi khuẩn giảm hoặc ngừng phát triển.

3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG N4.1 VÀ STT 3 3.1

3.5.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng

của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1

Nhiệt độ là yếu tố có tác động đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Tuỳ từng loại vi khuẩn mà nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển khác nhau. Để tìm ra nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng N4.1 và STT3.3.1 tiến hành nuôi cấy các chủng này ở dải nhiệt độ 20, 25, 27, 30, 34, 37, 40 và 450C. Sau 24h lên men, lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào của các thí nghiệm trên.

4.5

3.5

2.5

m / u f c t i r a g o L g n ở ư r t h n S

1.5

0.5

Nhiệt độ

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Kết qủa cho thấy ở nhiệt độ từ 250 C đến 370 C giá trị OD và mật độ tế bào tăng dần điều đó cho thấy chủng N4.1 và STT3.3.1 có khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt độ này. Giá trị OD và mật độ tế bào cao nhất tại nhiệt độ 34-370 C do vậy nhiệt độ 34-370C thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng N4.1 và STT3 3.1. Nhiệt độ từ 400C đến 450 C giá trị OD và mật độ tế bào giảm dần nên ở nhiệt độ này hai chủng sinh trưởng chậm hoặc không có khả năng sinh trưởng.

3.5.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và

STT 3 3.1

pH là yếu tố môi trường có tính chất quan trọng giống như nhiệt độ. pH quá thấp hay quá cao cũng đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Tiến hành các thí nghiệm với dải pH: 5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0, 8,5,9. Dùng dung dịch HCl 10% và NaOH 10% để điều chỉnh pH. Sau 24 giờ nuôi cấy, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục và đếm khuẩn lạc của các mẫu thí nghiệm.

4.5

) l

3.5

2.5

1.5

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t

h n S

0.5

5.5

6.5

7.5

8.5

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.11: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Kết quả cho thấy chủng N4.1 và STT3.3.1 có khả năng sinh trưởng và phát triển trong khoảng pH từ 5,5 đến 8. Giá trị OD và mật độ tế bào đạt cực đại tại pH nằm trong khoảng 6.5 đến 7.5. Giá trị pH thích hợp cho chủng N4.1 phát triển là 7 còn cho chủng STT3.3.1 là 7.5.

3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai

chủng N4.1 và STT 3 3.1

Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng chịu được độ mặn khác nhau và phát triển tốt nhất ở một nồng độ nhất định. Ở thí nghiệm này tiến hành nghiên cứu nồng độ muối NaCl ở các giải nồng độ: 0 - 10%. Sau 24h nuôi cấy tiến hành khảo sát giá trị OD và xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

) l

3.5

/ U F C

2.5

1.5

0.5

t i r i a g o L ( g n ở ư r t h n S

NaCl (%) 5

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.12: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Kết quả thể hiện trong hình 3.12 cho thấy mật độ tế bào giảm rõ rệt khi nồng độ muối tăng từ 6 đến 10g/l. Cả hai chủng vi sinh vật phát triển tốt khi nồng độ muối trong khoảng từ 0-4g/l.

3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan ban đầu đến sự sinh

trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1.

Nồng độ oxy hòa tan ban đầu ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật, trong thí nghiệm này chúng tôi sục khí để điều chỉnh nồng độ oxy hòa tan ban đầu ở các mức: 7,0 - 7,5 - 8,0- 8,5 -9- 9,5 - 10 - 10,5 (mg/l). Nuôi lắc 120 vòng/phút. Sau 24h nuôi cấy chúng tôi tiến hành khảo sát giá trị OD và xác định mật độ tế bào.

3.5

) l

2.5

1.5

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

0.5

7,5

8,5

9,5

10,5

mg/l

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.13: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.13. Chúng tôi hai chủng vi khuẩn này phát triển tốt khi bổ sung oxy hòa tan đầu từ khoảng 9,5mg/l đến 10,5 mg/l, ở nồng độ oxy hòa ban đầu là 10mg/l hai chủng vi khuẩn này phát triển tốt nhất nên chọn bổ sung nồng độ oxy hòa tan là 10 mg/l cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.5.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1

Cacbon là nguồn cung cấp năng lượng, dinh dưỡng quan trọng và không thể thiếu cho tế bào. Với mục đích tìm ra được nguồn cung cấp cacbon thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm với nguồn cacbon là dùng các loại đường như: Glucose, sucrose, fructose, maltose, tinh bột với lượng bổ sung vào môi trường Bruck’s là 10g/l. Kết quả thí nghiệm được đo sau 24h nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc kiểm tra mật độ tế bào.

) l

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

m / U F C t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

Nguồn cacbon

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.14: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Qua đồ thị thể hiện trong hình 3.14 cho ta thấy, chủng N4.1 và STT3 3.1 có khả năng sử dụng tất cả các loại đường nghiên cứu. Khi nguồn cacbon là đường glucose thì chủng N4.1 phát triển tốt nhất, còn với chủng STT3 3.1 phát triển tốt nhất với nguồn cacbon được sử trong môi trường là sucrose.

Để tìm ra nồng độ đường glucose thích hợp nhất cho chủng N4.1 và nồng độ sucrose cho chủng STT3 3.1, tiến hành thí nghiệm với các nồng độ đường là 3, 5, 7,10, 13, 15, 20, 25, và 30g/l. Sau 24h nuôi cấy tiến hành đếm mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Kết quả thể hiện ở hình 3.15 cho thấy mật độ tế bào không thay đổi rõ rệt khi hàm lượng đường tăng từ 5-30g/l. Tuy nhiên, mật độ chủng N4.1 cao nhất khi hàm lượng đường glucose là 20g/l. Còn với chủng STT3 3.1 khi hàm lượng đường sucrose đạt 20g/l.

3.5.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng

N4.1 và STT 3 3.1

Nitơ là thành phần cấu tạo nên tế bào, vì vậy nó có một vai trò quan trọng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các loài vi sinh vật sẽ thích hợp với các nguồn nitơ khác nhau. Khảo sát nguồn nitơ từ cao nấm men, peptone, NH4NO3, (NH4)2SO4, cao thịt.

Môi trường Bruck’s được bổ sung 20g đường làm nguồn cacbon được

N4.1

STT3.3.1

) l

m / U F C t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

peptone

tryptone

cao thịt

NH4NO3 (NH4)2SO4

cao nấm men

Nguồn nitơ

sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tìm nguồn nitơ thích hợp.

Hình 3.16 : Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1.

Ở hình 3.16 kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn nitơ nghiên cứu, nguồn nitơ hữu cơ cho mật độ tế bào cao hơn nguồn nitơ vô vơ. Trong đó, chủng N4.1 sử dụng nguồn nitơ là cao nấm mem thì phát triển tốt nhất, còn với chủng STT3 3.1 thì nguồn nitơ từ cao thịt được vi khuẩn này sử dụng và phát triển mạnh nhất.

Để tìm ra nồng độ cao nấm men thích hợp cho chủng N4.1 và cao thịt thích hợp cho chủng STT3.3.1, tiến hành thí nghiệm với các nguồn nitơ này ở dải nồng độ 5, 7, 10, 12, và 15 g/l. Kết quả thu được cho thấy mật độ tế bào tăng tuyến tính với nồng độ cao nấm men và cao thịt, tuy nhiên ở khoảng hàm lượng cao nấm men từ 10-15 g thì mật độ tế bào không có sự khác biệt đáng kể. Do vậy, hàm lượng cao nấm men được lựa chọn với chủng N4.1 là 12g/l. Tương tự chủng STT3.3.1 với lượng cao thịt thích hợp là 12 g/l

) l

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

g/l

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của cao nấm men đối với sự sinh trưởng của chủng N 4.1 và của hàm lượng cao thit đến sự phát triển chủng STT3 3.1.

Như vậy từ các kết quả trên đã lựa chọn được môi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn phát triển, gọi tên là môi trường M1 với chủng N4.1 có thành phần như sau: glucose 20g/l, cao nấm men 12 g/l, NaCl 4g/l, với các điều kiện lên men như pH 7, nhiệt độ 34 độ C, và nồng độ oxy hòa tan ban đầu là 10 mg/l. Và môi trường M2 với chủng STT3 3.1 gồm sucrose 20 g/l, cao thịt 12 g/l, NaCl 5g/l, với các điều kiện lên men như pH 7.5, nhiệt độ 37 độ C, nồng độ oxy hòa tan là 10mg/l.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, việc phối hợp nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ làm tăng mật độ tế bào, do vậy trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành

thử nghiệm với nguồn nitơ vô cơ là muối NH4NO3 ở dải nồng độ từ 0.5,1, 1.5, 2, 2.5 và 3 g/l.

) l

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

Bruck's M1 M1+0.5 M1+1 M1+1.5 M1+2 M1+2.5 M1+3

Môi trường

N4.1 STT3.3.1

Hình 3.18: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn ni tơ kết hợp bổ sung NH4NO3 đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT 3.3.1

Kết quả thể hiện ở hình 3.17 cho thấy, NH4NO3 được bổ sung vào môi

trường với hàm lượng 1g/l cho hiệu quả lên men cao hơn đối chứng.

3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN NHÂN SINH KHỐI

3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men nhân sinh

khối chủng N4.1

Chủng vi sinh vật cố định đạm được nhân giống trên quy mô pilot với

các điều kiện thích hợp như sau:

- Nhiệt độ: 370C

- pH: 7

- Nguồn đường: glucose 20 g/l

- Nguồn đạm: 12 g/l cao nấm men + 1 g/l NH4NO3

- Nồng độ oxy hòa tan: 10 mg/l.

- NaCl: 0-4 g/l

- Giống bổ sung 4%

Đường dư g/l

Đạm dư g/l

cfu/ml

2.5

) l

1.5

l / g

0.5

m / u f c t i r a g o L ( g n ở ư r t h n S

Giờ

đạm 30 Quá trình nhân sinh khối được lấy mẫu 5 giờ một lần. Dịch lên men được đem xác định các thông số như: mật độ tế bào, lượng đường và lượng đạm đã sử dụng. Kết quả được thể hiện trong hình 3.18 cho thấy ở quy mô pilot, thời gian phù hợp để dừng quá trình lên men nhân sinh khối chủng cố giờ. là định

Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian quá trình lên men thu sinh khối của chủng N 4.1.

3.6.2 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men nhân sinh

khối chủng STT3.3.1

Chủng vi sinh vật STT3.3.1 được nhân giống trên quy mô lớn với các

điều kiện thích hợp như sau:

- Nhiệt độ : 340C

- pH: 7.5

- Nguồn đường bổ sung: sucrose 20g/l

- Nguồn đạm bổ sung: 12g/l cao thịt + 1g/l NH4NO3

- Oxy hòa tan: 10 mg/l

- NaCl: 0- 4 g/l

- Giống bổ sung 4%

Đường dư g/l

Đạm dư g/l

cfu/ml

l / g

Giờ

Quá trình nhân sinh khối được lấy mẫu 5 tiếng một lần. Dịch lên men được đem xác định các thông số như: mật độ tế bào, lượng đường và lượng đạm đã sử dụng. Kết quả trong hình 3.19 cho thấy ở quy mô pilot, thời gian phù hợp để dừng quá trình lên men nhân sinh khối của chủng STT3 3.1 là 30 giờ.

Hình 3.20 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men thu sinh khối của chủng STT3 3.1.

3.7. TIỀN ĐỀ QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI CHỦNG CỐ ĐỊNH ĐẠM

Tiền đề sơ đồ quy trình

Các chất dinh dưỡng

Giống

Tạo môi trường lên men

Nhân giống (cấp1, 2) Lên men

Ly tâm thu sinh khối

Hình 3.21: Tiền đề sơ đồ quy trình nhân sinh khối chủng cố định đạm

Quy trình sản xuất sinh khối chủng vi sinh vật cố định đạm được tiến

hành như nhau:

a. Chuẩn bị môi trường lên men lên men tạo sinh khối: các chất dinh dưỡng được định lượng theo bảng dưới đây:

Bảng 3.3: Môi trường lên men sinh khối của hai chủng N4.1 và STT3 3.1

Thành phần (g/l) NN4.1 STT3.3.1

Sucrose - 20

Glucose 20 -

Cao nấm men 12 -

Cao thịt - 12

1 1 NH4NO3

NaCl 4 4

Nước 1 lít 1 lít

pH 6.5-7

Môi trường được khử trùng ở 1atm, 15 phút

- Sau đó giống được cấy vào môi trường tối ưu đế tạo giống khới động

b. Chuẩn bị giống: - Giống cho sản xuất được bảo quản dưới dạng đông khô. Mỗi đợt sản xuất, giống được hoạt hóa trên môi trường nutrient agar để kiểm tra sự phát triển và sạch của chủng giồng. cho qua trình lên men nhân khối. c. Cấy giống và kiểm soát quá trình nhân sinh khối - Giống được bổ sung vào môi trường lên men tối ưu. - Trong quá trình lên men, kiểm soát các thông số như nhiệt độ 340C/370C, pH 7/7.5, tốc độ khuấy và sục khí để hàm lượng oxi hòa tan từ 10- 10,5 mg/l d. Kết thúc lên men: được - Quá trình lên men kết thúc sau thời gian 30 giờ lên men, sinh khối tạo phân vi sinh. thu hồi chuyển sang giai đoạn ủ để

3.8. SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHỊU MẶN N4.1 VÀ STT3 3.1

Tiền đề sơ đồ sản xuất phân vi sinh cố định đạm

Giống gốc Chất mang

Lên men

Lên men cấp 1 Khử trùng

Ly tâm

Chất mang sạch Lên men cấp 2

Ly tâm thu sinh khối Phối trộn chất mang sạch và sinh khối của chủng vi khuẩn N4.1 và STT33.1 đạt mật độ 108CFU/ml

Phân vi sinh cố định đạm

Hình 3.22: Tiền đề quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn N4.1 và STT3 3.1.

Chúng tôi lựa chọn chất mang là bùn bã mía để tiến hành sản xuất phân

vi sinh có chứa hai chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa được tuyển chọn trên.

Chất mang ban đầu được xử lý sạch về mặt vi sinh vật bằng cách đem

khử trùng ở điều kiện 1 at trong 30 phút.

Sau khi có chất mang ban đầu sạch về mặt vi sinh vật chúng tôi tiến hành phối trộn sinh khối của 2 chủng vi khuẩn cố định đạm đạt mật độ 108 CFU/ml, để ủ 48 giờ.

Hình 3.23: Hình ảnh phân bón vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3.3.1

Chọn tỉ lệ phối trộn giữa đất và phân vi sinh

Chọn mẫu đất nền cổ lấy từ đảo Trường Sa cho các thí nghiệm thử nghiệm. Mẫu đất nền cổ này được khử trùng ở điều kiện 1 at trong 30 phút, cho sạch về mặt vi sinh vật.

Phối trộn theo các tỉ lệ đất và phân như sau: 2 đất :8 phân; 3 đất :7 phân; 4 đất: 6 phân, 5 đất : 5 phân; 6 đất: 4 phân; 7 đất : 3 phân; 6 đất :4 phân;

Qua đánh giá độ tươi xốp, độ kết dính, cảm quan và các các lần thử nghiệm trồng rau trên các mẫu đất trộn phân vi sinh chúng tôi chọn mẫu đất phân phối trộn theo tỉ lệ 6 phân: 4 đất cho thử nghiệm trồng cây tiếp theo. Tỉ lệ phối trộn này đảm bảo được các tiêu chí như:

 “Dinh dưỡng phong phú

 Thoát nước tốt: Nước tưới dư cần được thoát khỏi đất trồng ngay lập tức. Đất trồng thoát nước kém sẽ khiến cho đất thiếu thoáng khí, đồng thời đọng nhiều muối kim loại.’”

 Thông thoáng: ‘Độ lớn của các hạt vật liệu dùng trong đất trồng cần đủ to để có những khe hở li ti (giữa những hạt đất). Những khe hở đó cũng chính là khoảng không cho rễ thở.”

 Giữ nước tốt: Đất trồng cần có khả năng giữ và nhả nước sao cho vùng rễ của cây có “độ ẩm tối thiểu” suốt khỏang thời gian giữa 2 lần tưới.

 Giữ phân bón tốt

 Bình thường đất không bị nứt nẻ. Khi bị ướt thì không đóng bánh.”

 Độ pH hợp lý.

 Trong đất không chứa các chất độc hại hoặc trứng sâu bọ, côn trừng..

Hình 3.24: Hình ảnh đất nền cổ phối trộn với phân vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn bản địa.

Hình 3.25: Hình ảnh giá thể phân đất 6:4

3.9 THỬ NGHIỆM PHÂN VI SINH CỐ CHỊU MẶN CỐ ĐỊNH ĐẠM

Sau khi tiến hành chọn được tỉ lệ đất và phân thích hợp, tiến hành gieo hạt rau muống. Thử nghiệm được tiến hành trên 2 lô thí nghiệm. Lô 1 trồng rau trên giá thể là đất nền cổ có phối trộn chất mang sạch dùng để sản xuất phân vi sinh sạch về mặt vi sinh vật gọi là lô đối chứng. Lô 2 ( lô thử nghiệm) trồng rau trên giá thể là đất và phân vi sinh chứa hai chủng vi khuẩn chụi mặn bản địa trên. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Tiến hành thử nghiệm ở cùng 1 điều kiện, theo dõi sự phát triển của cây trong các khoảng thời gian sau 30 ngày gieo trồng thu được kết quả.

Bảng 3.4: Kết quả sau 30 ngày thử nghiệm trồng rau với giá thể là đất cổ nền trên đảo Trường Sa và phân vi sinh cố định đạm chịu mặn qui mô phòng thí nghiệm

Lô thí nghiệm Số lá trên cây Chiều dài lá thứ 2 từ dưới lên Chiều dài rễ (cm) Chiều cao cây (cm) Khối lượng tươi trong 1 chậu (gram)

4,705 3,56 9.23 95.23 3,26 Đối chứng âm

6.32 5,85 13.34 108.56 4,08 Lô thí nghiệm

Hình 3.26: Rau muống trồng với phân vi sinh cố định đạm chịu mặn

Lô thí nghiệm

Đối chứng âm

Lô thí nghiệm

Đối chứng âm

Lô thí nghiệm

Hình 3.27: Hình ảnh rễ, lá, và chiều dài cây của lô thí nghiệm và mẫu đối chứng

Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy rau muống được trồng trên đất nền cổ có bón phân vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn có số lượng lá trên một cây, chiều dài lá, chiều cao cây và năng suất cao hơn so với rau muống trồng trên giá thể là đất nền cổ và chất mang sạch về mặt vi sinh vật. Điều này chứng tỏ 2 chủng vi khuẩn N41. Và STT3 3.1 có tác dụng nâng cao năng suất và cải thiện độ phì nhiêu của đất Trường Sa.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn N4.1 là loài Bacillus aryabhattai và STT3 3.1 là loài Bacillus megaterium có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate và khả năng sinh IAA cao từ 36 chủng chịu mặn có khả năng cố định đạm của 42 mẫu đất trên 11 đảo thuộc quần đảo Trường Sa. 2 chủng N4.1 và STT3 3.1 có hoạt tính cố định đạm là 25.18 ± 1.14 mg/l và 19.02 ± 0.21 mg/l sau 72h nuôi cấy. Chủng STT3.3.1 và N4.1 đồng thời có hoạt tính phân giải phosphate 295,02 ±1,08 mg/l và 282,88± 1,08mg/l sau 96h nuôi cấy. Ngoài ra chủng N4.1 còn có khả năng đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng IAA sinh với hàm lượng đạt cao nhất là 33.49±0,33 mg/l.

2. Đã xây dựng được quy trình lên men thu sinh khối để sản xuất phân

bón vi sinh phù hợp của 2 chủng vi khuẩn tuyển chọn như sau: - Chủng STT3.3.1: nhiệt độ: 340 C, pH: 7,5, saccharose 20 g/l, 12 g/l cao thịt + 1 g/l NH4NO3, nồng độ oxy hòa tan 10 mg/l, NaCl: 1-4 g/l, với tỷ lệ giống bổ sung 4% và thời gian lên men là 30 h. - Chủng N4.1: nhiệt độ : 370 C, pH: 7, glucose 20 g/l, 12 g/l cao nấm men + 1 g/l NH4NO3, nồng độ oxy hòa tan 10 mg/l, NaCl: 1-4g/l, tỷ lệ giống bổ sung 4% và thời gian lên men là 30 h.

3. Đã tiến hành thử nghiệm trồng rau muống trên nền giá thể là đất nền cổ Trường sa có bón phân vi sinh chịu mặn sản xuất được với tỷ lệ 4/6 theo thể tích và so sánh với đối chứng. Kết quả cho thấy rau trồng có bổ sung phân vi sinh sản xuất được phát triển tốt hơn so với đối chứng.

4.2. KIẾN NGHỊ

1. Cần tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng 2 chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn ở trên vào việc phát triển sản xuất phân bón vi sinh chịu mặn để phục vụ các đảo ven biển và xa bờ trong công tác phát triển nông nghiệp và phòng chống biến đôi khí hậu khi diện tích đất ngập mặn ngày càng tăng nhanh.

2. Cần tiếp tục nghiên cứu và khai thác nguồn gen vi sinh vật quý đối với 185 chủng vi sinh vật phân lập được từ 42 mẫu đất thuộc quần đảo Trường Sa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Ban tuyên giáo Trương Ương, 2015, 100 câu hỏi- đáp về biển dảo dành cho Thanh niên Việt Nam. Nhà Xuất bản Thông tin và Truyền thông.1

[2] Trần Duy Tứ, 1998. Khái quát một số nét về các điều kiện tự nhiên và lớp phủ thổ nhưỡng của một số đảo thuộc quần đảo Trường Sa. Tuyển tập các công trình nghiên cứu về điều kiện tự nhiên và tài nguyên thiên nhiên vùng quần đảo Trường Sa. Nxb. Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội. Tr. 271-276.

[3] Vũ Ngọc Quang, Trần Duy Tứ, 1998. Đặc điểm lớp phủ đất quần đảo Trường Sa. Tuyển tập các công trình nghiên cứu về điều kiện tự nhiên và tài nguyên thiên nhiên vùng quần đảo Trường Sa. Nxb. Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội. Tr. 263-270

[4] Franche C., Lindström K., Elmerich C., 2009 Nitrogen-fixing bacteria associated with leguminous and non-leguminous plants. Plant Soil. ;321:35–59

[5] Christoph Kneip, Peter Lockhart, Christine Voß & Uwe-G Maier, 2007, Nitrogen fixation in eukaryotes – New models for symbiosis, BMC Evolutionary Biology volume 7, Article number: 55 .

[6] Arnold W., Rump A., Klipp W., Priefer UB., Pühler A.,1988, Nucleotide sequence of a 24,206-base-pair DNA fragment carrying the entire nitrogen fixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae . J Mol Biol., , 203:715–738.

[7] Ertan YILDIRIM, Metin TURAN, Melek EKINCI, Atilla DURSUN and Ramazan CAKMAKCI, 2011, Plant growth promoting rhizobacteria ameliorate deleterious effect of salt stress on lettuce, Scientific Research and Essays Vol. 6(20), pp. 4389-4396.

[8] Torres AR., Kaschuk G., Saridakis GP., Hungria M., 2012, Genetic variability in Bradyrhizobium japonicum strains nodulating soybean Glycine max (L.) Merrill. World J Microbiol Biotechnol. 28:1831– 1835.

[9] Sergeeva E., Liaimer A., Bergman B. , 2002, Evidence for production by indole-3-acetic phytohormone the

of acid cyanobacteria, Planta 215 229–238 10.1007/s00425-002-0749.

[10]

James E.K., Olivares F.L., Baldani J.I., Dobereiner J., 1997, Herbaspirillum, an endophytic diazotroph colonizing vascular tissue of Sorghum bicolor L. Moench. J Exp Bot. ;48:785–798

by Herbaspirillum

[11] Monteiro R.A., Schmidt M.A., de Baura V.A., Balsanelli E., Wassem R., Yates M.G., Randi MAF., Pedrosa F.O., de Souza E.M., Early colonization pattern of maize (Zea mays L. Poales, Poaceae) seropedicae (Burkholderiales, roots Oxalobacteraceae). Genet Mol Biol. 2008;31:932–937

[12]

Pedrosa FO., Monteiro RA., Wassem R., Cruz LM., Ayub RA., Colauto NB., Fernandez MA., Fungaro MHP., Grisard EG., Hungria M., và cs.,2011, Genome of Herbaspirillum seropedicaestrain SmR1, a specialized diazotrophic endophyte of tropical grasses. PLoS Genet

[13] Zeffa, D. M., Perini, L. J., Silva, M. B., de Sousa, N. V., Scapim, C. A., Oliveira Azeredo Gonçalves, L. S., 2019, Azospirillum brasilense promotes increases in growth and nitrogen use efficiency of maize genotypes. PloS one, 14(4).

[14] Modder I.W., 1998, Structure and magnetism of metallic

systems, Ph.D. Thesis, University of Amsterdam, Amsterdam.

[15] Lương Đức Phẩm, 2016, Công nghệ vi sinh, p97-155.

[16] Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đường,Nguyễn Thị Thanh Phụng, Trần Thị Cẩm Vân, Hoàng Lương Việt,1979, Giáo trình Vi sinh vật học trồng trọt. 255 tr.

[17] Trần Ánh Nguyệt, Trần Minh Trí, Hà Thanh Đạt, Trần Thu Thảo, Hồ Viết Thế, 2017, Phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng cố định đạm của một số chủng vi khuẩn nốt sần ở rễ cây đậu phộng (Arachis Hypogaea. L), Kỷ yếu Khoa học công nghệ kỷ niệm 35 năm hội nhập và phát triển 1982-2017. Trường Đại học Công nghệ thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh.

[18] Upadhyay S. K., Singh D. P., Saikia R. (2009). Genetic diversity of plant growth promoting rhizobacteria isolated from rhizospheric soil of wheat under saline condition. Curr. Microbiol. 59 489–496. 10.1007/s00284-009-9464-1

[19] Zhang H., Xie X., Kim MS., Kornyeyev DA., Holaday S., Paré PW., 2008,Soil bacteria augment Arabidopsis photosynthesis by decreasing glucose sensing and abscisic acid levels in planta. Plant J, 56:264–273

[20] Egamberdiyeva D., “Plant-growth-promoting

rhizobacteria isolated from a calcisol in a semi-arid region of Uzbekistan:biochemical characterization and effectiveness”, J Plant Nutr Soil Sci.,168, 2000, 168.

[21] Nabti E, Sahnoune M, Adjrad S, Van Dommelen A, Ghoul M, Schmid M, Hofmann A, Rothballer M, Schmid M Hartmann A, 2012, Enhancement and Restoration of growth of durum wheat (Triticumdurum var. waha) on saline soil by using Azospirillum brasilense NH and marine alga Ulva lactuca In: Algae: Ecology, Economic Uses and Environmental Impact. Marine Biology (Edt) Nova Science Publishers, Inc, New York, pp. 29-52.

[22]

Siddikee MA, Chauhan PS, Anandham R, Han GH, Sa T, 2010, Isolation, characterization, and use for plant growth promotion under salt stress, of ACC deaminase-producing halotolerant bacteria derived from coastal soil. .J Microbiol Biotechnol.20(11):1577-84

[23] Yang A, Akhtar SS, Iqbal S, Amjad M, Naveed M, Zahir ZA ,Jacobsen S-E, 2016, Enhancing salt tolerance in quinoa by halotolerant bacterial inoculation. Functional Plant Biology.

[24] Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải, Phạm Thúy Hồng, 2002, Biểu hiện gen mã hóa beta-amylase của đậu tương trong nấm men Pichia pastoris, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 40(3), tr. 14-19.

[25] Lâm Bạch Vân, 2008, Đánh giá khả năng cố định đạm của dòng vi sinh vậtbản địa lên đặc tính sinh trưởng và năng suất cây lúa trên

đất phèn. Luận văn Thạc Sĩ chuyên ngành trồng trọt, Khoa Nông nghiệp. Đại học Cần Thơ

[26] Lê Thị Diễm Ái, 2010, Hiệu quả phân vi sinh và phân hóa học lên năng suất lúa cao sản trồng tại tỉnh An Giang. Luận văn Thạc Sĩ Công Nghệ Sinh học. Đại học Cần Thơ.

[27] Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2012Đánh giá khả năng cố định đạm của vi sinh vậtnội sinh đến năng suất, chất lượng của trái khóm trồng tại huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang. Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học. Đại học Cần Thơ.

[28] Nguyễn Minh Hưng và cộng sự, 2007, Phân bón vi sinh,

http://www.vinachem.com.vn/, số 3 năm 2007.

[29] Phạm văn Toản, nghiên cứu phát triển phân bón vi sinh ở Việt

Nam, tr 593-608

[30]

Park et al., 2017,“Bacillus aryabhattai SRB02 tolerates oxidative and nitrosative stress and promotes the growth of soybean by modulating the production of phytohormones” PLoS One. 12(3): e0173203

[31] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7538-2:2005 (ISO 10381 - 2 : 2002) về Chất lượng đất - Lấy mẫu - Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành

[32] Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ đất sản xuất lúa - tôm ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(1B): 7-12.

[33] Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng, “Đặc tính vi khuẩn nội sinh phân lập trong cây khóm trồng trên đất phèn Vĩnh Thuận tỉnh Kiên giang”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ,15a, 2015, 54-63.

[34] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173:697–703

[35]

Julie D. Thompson, Toby J. Gibson, Frédéric Plewniak, François Jeanmougin* and Desmond G. Higgins, 1997, The CLUSTAL_X windows interface flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools , Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 24

[36] RandaN.Albdaiwi, Hala Khyami-Horani, Jamal

and Rabea Al-Sayaydeh, Isolation 2019,

Y. Ayad, and Characterization of Halotolerant Plant Growth Promoting Rhizobacteria From Durum Wheat (Triticum turgidum subsp. durum) Cultivated in Saline Areas of the Dead Sea Region, Microbiol.

[37] Rodríguez H., and Fraga R., 1999, “Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion,” Biotechnology Advances, vol. 17, pp. 319–339

[38] Glickmann E., Dessaux Y., 1996, “A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria”, Appl. Environ. Microbiol., 61(2), 793–796

Lowry và cộng sự, 1951, J. Biol. Chem. (Tạp chí Hóa sinh), 199,

[39]

p. 265

[40] TCVN 6168:1996: Phân bón VSV – Thuật ngữ định nghĩa.

[41] Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sư, “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kalikhó tan từ đất trồng cà phê tại khu vực Tây Nguyên”, Tạp chí Khoa học nông nghiệp, 60(5), 2018, 5-10.

[42] Costacurta, A., V. Keijers and J. Vanderleyden, 1994. Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole- 3-pyruvate decarboxylase gene. Mol. Gen. Genet, 243: 463-472.

[43] Balaji N., Lavanya S.S., Muthamizhselvi S., Tamilarasan K., “Optimization of fermentation condition for indole acetic acid

species”, Int J Adv Biotechnol

production by Pseudomonas Res.,2013, 797–803

[44]

Park J. M., Radhakrishnan R., Kang S. M., Lee, I. J., 2015, “IAA producing Enterobacter sp. I-3 as a potent bio-herbicide candidate lettuce growth for weed control: a special reference with inhibition”, Ind. J. Microbiol., 55(2), 207–212.

[45]

Shen et al., 2019, “Screening of Rice Endophytic Biofertilizers and Plant Growth-Promoting Tolerance

with Fungicide Characteristics”, Sustainability, 11, 1133

PHỤ LỤC

Kết phân tích hàm lượng amoni sinh ra bằng phần mền

IRISTART.

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Ket qua amoni

VARIATE V003 AMONI mg/l

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

================================================================

=============

1 NHACLAI 2 .751501 .375751 1.00 0.376 3

2 CHUNG 35 657.893 18.7969 49.90 0.000 3

* RESIDUAL 70 26.3673 .376676

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 107 685.012 6.40198

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE AMONI 11/10/20 10:55

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

BALANCED ANOVA FOR VARIATE AMONI FILE AMONI 11/10/20 10:55

Ket qua amoni

MEANS FOR EFFECT NHACLAI

-------------------------------------------------------------------------------

NHACLAI NOS AMONI

1 36 15.6763

2 36 15.8203

3 36 15.8738

SE(N= 36) 0.102290

5%LSD 70DF 0.288488

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT CHUNG

-------------------------------------------------------------------------------

CHUNG NOS AMONI

1 3 14.5933

2 3 17.5596

3 3 16.9575

4 3 13.1253

5 3 16.6026

6 3 15.2984

7 3 17.2037

8 3 15.6101

9 3 13.4878

10 3 25.3477

11 3 14.7523

12 3 12.0995

13 3 14.0103

14 3 17.1475

15 3 12.4785

16 3 17.9021

17 3 12.7056

18 3 17.7935

19 3 13.8142

20 3 15.3412

21 3 13.6309

22 3 15.4196

23 3 13.9642

24 3 18.2145

25 3 15.4192

26 3 19.5634

27 3 17.6757

28 3 14.7525

29 3 17.2173

30 3 16.8049

31 3 14.2331

32 3 15.9134

33 3 17.8424

34 3 16.8141

35 3 13.1755

36 3 13.9734

SE(N= 3) 0.354343

5%LSD 70DF 0.999353

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE AMONI 11/10/20 10:55

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

Ket qua amoni

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NHACLAI |CHUNG |

(N= 108) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

AMONI 108 15.790 2.5302 0.61374 3.9 0.3757 0.0000

3- sinh ra bằng phần mền IRISTART

Kết phân tích hàm lượng PO4

BALANCED ANOVA FOR VARIATE PHOTPHAT FILE PP1 11/10/20 8:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Ket qua pp

VARIATE V003 PHOTPHAT mg/L

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

================================================================ =============

1 NHACLAI 2 1.47266 .736331 1.66 0.196 3

2 CHUNG 35 521389. 14896.8 ****** 0.000 3

* RESIDUAL 70 31.1246 .444638

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 107 521422. 4873.10

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PP1 11/10/20 8:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

Ket qua pp

MEANS FOR EFFECT NHACLAI

-------------------------------------------------------------------------------

NHACLAI NOS PHOTPHAT

1 36 137.127

2 36 136.854

3 36 136.917

SE(N= 36) 0.111135

5%LSD 70DF 0.313435

-------------------------------------------------------------------------------

Kết quả phân tích hàm lượng Photphat bằng phần mền IRISTART

MEANS FOR EFFECT CHUNG

-------------------------------------------------------------------------------

CHUNG NOS PHOTPHAT

1 3 117.231

2 3 307.818

3 3 275.206

4 3 80.1625

5 3 57.2597

6 3 62.0619

7 3 65.0171

8 3 141.114

9 3 86.6270

10 3 282.875

11 3 133.023

12 3 64.8691

13 3 103.471

14 3 100.697

15 3 114.369

16 3 117.324

17 3 74.6277

18 3 106.611

19 3 101.070

20 3 94.7905

21 3 191.019

22 3 130.633

23 3 79.2153

24 3 242.026

25 3 127.220

26 3 295.021

27 3 136.018

28 3 96.0637

29 3 152.353

30 3 87.3841

31 3 203.121

32 3 153.412

33 3 97.1913

34 3 86.5260

35 3 231.425

36 3 135.934

SE(N= 3) 0.384984

5%LSD 70DF 1.08577

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PP1 11/10/20 8:56

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

Ket qua pp

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NHACLAI

|CHUNG |

(N= 108) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

PHOTPHAT 108 136.97 69.808 0.66681 0.5 0.1964 0.000

Kết quả phân tích hàm lượng IAA sinh ra bằng phần mền IRISTART

BALANCED ANOVA FOR VARIATE IAA FILE IAA 11/10/20 11:15

------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Ket qua IAA

VARIATE V003 IAA mg/L

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

SQUARES SQUARES LN

================================================================

=============

1 NHACLAI 2 .523683E-01 .261842E-01 0.71 0.497 3

2 CHUNG 35 7099.75 202.850 ****** 0.000 3

* RESIDUAL 70 2.56644 .366635E-01

-----------------------------------------------------------------------------

* TOTAL (CORRECTED) 107 7102.37 66.3773

-----------------------------------------------------------------------------

TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IAA 11/10/20 11:15

------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

Ket qua IAA

MEANS FOR EFFECT NHACLAI

-------------------------------------------------------------------------------

NHACLAI NOS IAA

1 36 11.5200

2 36 11.5417

3 36 11.4881

SE(N= 36) 0.319129E-01

5%LSD 70DF 0.900038E-01

-------------------------------------------------------------------------------

MEANS FOR EFFECT CHUNG

-------------------------------------------------------------------------------

CHUNG NOS IAA

1 3 0.560000

2 3 0.203333

3 3 0.560000

4 3 4.57333

5 3 6.53000

6 3 11.2433

7 3 3.56000

8 3 23.1733

9 3 15.2467

10 3 19.6167

11 3 33.4900

12 3 2.55333

13 3 6.28667

14 3 5.64000

15 3 4.86333

16 3 0.000000

17 3 5.61333

18 3 5.90333

19 3 18.9700

20 3 18.5433

21 3 17.6667

22 3 23.2467

23 3 15.5800

24 3 18.6433

25 3 14.5933

26 3 17.0700

27 3 13.6567

28 3 16.5567

29 3 12.6367

30 3 13.6900

31 3 17.0800

32 3 0.000000

33 3 14.5133

34 3 17.6967

35 3 0.000000

36 3 14.8367

SE(N= 3) 0.110549

5%LSD 70DF 0.311782

-------------------------------------------------------------------------------

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IAA 11/10/20 11:15

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

Ket qua IAA

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1

VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NHACLAI |CHUNG |

(N= 108) -------------------- SD/MEAN | | |

NO. BASED ON BASED ON % | | |

OBS. TOTAL SS RESID SS | | |

IAA 108 11.517 8.1472 0.19148 1.7 0.4975 0.0000

Bảng : Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất lấy tại Trường Sa

TT ĐẢO GRAM KÍ HIỆU HÌNH THÁI KHUẨN LẠC HÌNH DẠNG TẾ BÁO

AB1 2.1 1 Màu trắng, tròn, viền nhăn, khô Gram dương Hình que phân nhánh que

AB3 1.3 Hình que Gram âm 2

Tròn,trắng đục, đường kính 1 mm, viền trơn, bề mặt bóng An Bang

AB3 2.2 Hình que 3 Tròn,bề mặt bóng, sinh sắc tố, đường kính 3 mm Gram dương

AB4 2.2 Hình que 4 Tròn,bề mặt nhăn, trắng, viền nhăn Gram dương

N N4.1 Hình que 5 Gram dương Tròn, viền nhăn, màu ngà vàng, đường kính 2 mm,,lồi bóng,

NY1 2.3 Gram âm 6 Xạ khuẩn, trắng, tròn, đường kính1 mm Que phân nhánh Nam yết

NY1 6.1 Hình que 7 Gram dương Viền nhăn, trắng đục, đường kính 2 mm, bề mặt nhăn

NY3 1.2 Hình que Gram âm 8 Tròn,trắng đục, đường kính 1 mm, viền trơn, bề

mặt bóng

NY3 2.2 Hình tròn Gram âm 9 Tròn, nhỏ, đường kính 1 mm, màu trắng đục.

NY3 3.1 Hình cầu Gram âm 10

Tròn, vàng ngà, đường kính 2 mm, viền trơn, lồi bằng

NY5 2.1 11 trắng vàng, đường kính 1,5 mm, tròn

NY5 5.1 Hinh ưue 12 Trắng đục, đường kính 1 mm, tròn, bằng Gram dương

Hình que 13 TSL1 5.1 Tròn, trắng trong, bề mặt lồi, đường kính 1 mm Gram dương

Hình cầu Gram âm 14 TSL3 4.1 Tròn, trắng trong, đường kính 2 mm, bề mặt lồi, viền trơn.

15 Hình que Gram dương Trường Sa lớn TSL3 4.2 Tròn,viền không đều, trắng đục, mặt nhăn.

Hình tròn 16 Gram dương TSL4 2.2 Tròn trong suốt, nhầy , đường kính2 mm, viền trơn

Hình tròn Gram âm 17 TSL4 2.3 Trong suốt, đường kính 2 mm, nhầy, viền trơn tròn

18 Sơn ca K1 2.2 Hình que Gram dương Trắng sữa, viền nhăn, đường kính 2 mm, bề mặt lồi lõm

19 K1 8.3 Hình que Gram dương Trắng đục, tròn, viên trơn, đường kính 1 mm, lồi bóng.

20 Hình ovan Gram âm STĐ4 1.1 Sinh Tồn Đông Tròn, nhỏ, lồi, đường kính 1 mm, bóng, trắng sửa

21 Hình que STT5 4.1 Gram dương Trắng sữa, viền nhăn, đường kính 2 mm, bề mặt lồi lõm

22 Hình cầu Gram dương STT5 3.1 Trắng đục, đường kính 2 mm, tròn, bằng

23 Hình que Gram dương STT1 4.2 Tròn, bề mặt phẳng, đường kính 2 mm, viền nhăn, trắng sửa

24 Hình que Gram Âm STT1 5.1 Tròn, lồi, bóng. đường kính 1 mm, trắng đục

Sinh Tồn Tây

25 Hình que Gram âm STT2 2.1 Tròn, lồi, bóng, trắng nâu, đường kính 1,5 mm, viền trơn

26 Hình que STT2 6.2 Gram dương Tròn, bề mặt phẳng, đường kính 2 mm, viền nhăn, trắng sửa

27 Hình que Gram âm STT3 1.3 Trắng đục, đường kính 2 mm, tròn, bề mặt khuẩn lạc bằng

28 Trắng đục, viền trơn tròn Hình que STT3 Gram

3.1 dương

Hình que 29 STT4 1.2 Trắng đục, đường kính 1 mm,tròn, lồi, bề mặt bóng Gram dương

Hình cầu Gram âm 30 STT4 5.1 Tròn, nhỏ, đường kính 1 mm, màu trắng đục.

Hình tròn 31 STT5 1.2 Gram dương Tròn, vàng ngà, đường kính 2 mm, viền trơn, lồi bằng

Hình tròn Gram âm 32 PVA1 2.1 Vàng ngà, tròn, bóng trơn, đường kính 1 mm.

Phan Vinh A

Hình que 33 PVA1 4.1 Gram dương Trắng sữa, đường kính 3 mm, viên nhăn, bề mặt phẳng.

34 ĐL1 1.1 Hình cầu Gram dương Màu nâu nhạt, đường kính 1,5 mm, viên trơn, bề mặt phẳng

35 Đá Lát ĐL1 9.1 Hình tròn Gram dương Trong suốt, nhầy, đường kính 2 mm, bề mặt bóng, viền trơn

36 ĐL1 5.1 Hình tròn Gram dương Màu trắng, đường kính 1 mm, viền trơn, bề mặt bóng

Kết quả giải trình tự gen bằng 16S rDNA của chủng N4.1

Sequences 16S rDNA of N 4.1:

ATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGAC GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAA GACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATC TTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTT ACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCA CACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCACAGACACCTACGGGAGGCAGCAGT AGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGC GTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAA GAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACCTAACC AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA GGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAG GCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGA GGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCG GAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACA CCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCGGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCTCTTTAG TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCG CAAGACTGAAACTCAAAGGAAGTGACGGGGGCCCGCACGAGCGG TGGAGCATGTGGTTTATTTCGAAGCAACGCGAGAACCATACCAGG TCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCG This sequence is similarity 99,8 % with Bacillus aryabhattai MH26107

Kết quả giải trình tự gen bằng 16S rDNA của chủng STT3 3.1

Sequence 16S rDNA of STT3 3.1: ATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAG CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTG GGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTC CTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGA TGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA

AGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG AATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA GTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA CAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGA AAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCG GTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGT CATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATT CCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGT GGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTG CAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA CTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCG This sequence is similarity 100 % with Bacillus megaterium IAM 13418T.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cải tạo đất trồng rau trên quần đảo Trường Sa

Trần Thị Nguyệt

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

Hà Nội - 2020

3-(mg/l)

3

2.5

2

1.5

m n 0 3 5 D O

1

0.5

0

0

20

40

60

80

100

IAA (µg/mL)

y = 0.0121x - 0.0335 R² = 0.9912

3.8. SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHỊU MẶN N4.1 VÀ STT3 3.1

Ket qua amoni

Kết quả phân tích hàm lượng Photphat bằng phần mền IRISTART

Kết quả phân tích hàm lượng IAA sinh ra bằng phần mền IRISTART

Có thể bạn quan tâm

Đo đạc một số đặc trưng san hô đảo Phan Vinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng