Phân lập và đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn bacillus licheniformis KG7 ưa nhiệt tại nguồn nước nóng kênh gà Ninh Bình

HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6<br /> <br /> PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI<br /> KHUẨN Bacillus licheniformis KG7 ƢA NHIỆT TẠI NGUỒN NƢỚC NÓNG<br /> KÊNH GÀ NINH BÌNH<br /> NGUYỄN QUỐC TRUNG<br /> <br /> Học viện Nông nghiệp Việt Nam<br /> NGÔ THỊ HIỀN<br /> <br /> Chi c c Qu n lý chấ<br /> <br /> ng nông lâm th y s n Thanh Hóa<br /> <br /> Enzyme là m t s n phẩm quan trọng từ sinh vật mà chúng ta có th<br /> , c biệt là từ<br /> ố ư ng vi sinh vật. V i ho t l<br /> ư t tr i so v i các ch<br /> ơ, z<br /> c<br /> s<br /> i nh ng thành t u to l n cho nhi ĩ<br /> ư:<br /> ghiệp, nông nghiệp, y học,<br /> b o vệ<br /> ườ<br /> ệc khai thác và s d<br /> z<br /> ư c r t nhi<br /> ư c trên thế<br /> gi<br /> H<br /> ă<br /> ường enzyme trong công nghiệp trên thế gi<br /> t trên 3,3 tỉ USD<br /> ă<br /> ư<br /> t 4,4 tỉ USD trong 2015 (BBC research, 2011).<br /> Tuy nhiên v i b n ch t là protein enzyme r t dễ b biến tính bởi nh<br /> u kiện c<br /> củ<br /> ườ<br /> c biệt là bởi nhiệ<br /> Hơ<br /> a hầu hết các quá trình s n xu<br /> u cần thiết<br /> diễn ra ở nhiệ<br /> ă<br /> ệu su t ph n ứng, tiết kiệm nhiên liệu s n xu<br /> Vì ậy việc<br /> nghiên cứu và khai thác các enzyme b n nhiệt là m t yêu cầu bứ<br /> ư<br /> t ra. Trong<br /> ,<br /> ẩ ư<br /> ệ ường sống ở<br /> ường có nhiệ<br /> ườ<br /> ư: ối<br /> ư c nóng, núi l a, núi r<br /> ồn tài nguyên sinh vật quan trọng s d ng trong s n xu t<br /> các enzyme b n nhiệt.<br /> Việ N<br /> ư c có nguồn suố ư c nóng r<br /> ư<br /> ệc khai thác các nguồn<br /> l i từ vi sinh vậ<br /> ư c quan tâm. Suố ư c nóng Kênh Gà, huyện Gia Viễn,<br /> N<br /> ì<br /> ư c nghiên cứu khai thác từ , ư<br /> ệ<br /> và tính ch t của nguồ ư<br /> b<br /> ổi theo thời gian. Vì vậy cần thiết ph i k p thời nghiên cứu và khai thác hiệu qu nh ng<br /> tác d ng tr liệu của nguồ ư , c biệt là nguồn tài nguyên vi sinh vậ ư<br /> ệt t<br /> m<br /> ư ng t i các ứng d ng công nghiệp.<br /> I. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> từ<br /> <br /> Vật liệu: Mẫ<br /> ế<br /> <br /> ư c l y từ nguồn khoáng nóng Kênh Gà – Ninh Bình. Thời gian tiến hành:<br /> ă<br /> <br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> Phân lập vi khuẩ<br /> hiệt: Mẫ ư<br /> ư cc<br /> ường th ch LB l ng (trong<br /> 1 lít: Trypton 1g, Yeast extract 0.5g, NaCl 1g, bổ sung Agar và dẫ ư<br /> ến 1L), ở nhiệ<br /> 50oC. Theo dõi hình thái khuẩn l c, tế bào, Gram +/-, kh ă<br /> phân lập các chủng<br /> khác nhau. L a chọn các chủng có khuẩn l c rõ, kh ă<br /> ưởng, phát tri n m nh ở<br /> u<br /> kiện nhiệ<br /> cao<br /> Chẩn lo i phân tử vùng DNA-16S: Tách chiết DNA từ d ch nhân nuôi vi khuẩn (trong môi<br /> ường LB, lắc sau 24h) theo quy trình của Ferris (1996) có bổ<br /> K<br /> ệm chiết<br /> phá thành tế bào của vi khuẩn b n nhiệ (PT N ĩ ,<br /> ) Nhân b n gen DNA 16S b ng<br /> ph n ứng PCR v i c p mồ RI<br /> F ( ‟- gag ttt gat ccc ggc tca g- ‟) RI<br /> R ( ‟- gtc acc ttg<br /> o<br /> tta cga ctt - ‟)<br /> ỳ nhiệt (95oC- ‟,<br /> ỳ: 94o- ”, o- ”, o- ”<br /> - ‟) S n<br /> phẩ P R ư c ki m tra trên gel agarose 1% và tinh s ch b ng kit QIAquick (Qiagen). S<br /> d ng s n phẩ P R<br /> ch làm khuôn trong PCR v i từng mồ ơ RI<br /> F RI<br /> R<br /> 1768<br /> <br /> HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6<br /> <br /> DTCS Quick Start Master Mix (Beckman coulter) v<br /> NTP<br /> u huỳnh quang. Chế<br /> o<br /> o<br /> nhiệt: 1 chu kỳ: 96o- ”<br /> - ”<br /> - ‟ S n phẩ P R ư c tinh s ch m t lần n a b ng kit<br /> QIA<br /> ọc b ng máy CEQ8000 (Beckman Coulter, Mỹ). Trình t<br /> NA<br /> nh<br /> RNA S ư<br /> ọc c 2 chi u và lắp ghép l i. So sánh trình t trên genebank s d ng công c<br /> BLAST N 2.2.31, NCBI.<br /> Xá<br /> <br /> ịnh<br /> <br /> h h ởng c a các yếu tố<br /> i<br /> ng: Ản ưởng của pH: chủng vi khuẩ ư c<br /> ường LB l ng lắc ở 50oC, 150 vòng/phút trong 24h v i 12 mức pH (5,5 - 6,0 6,5 - 7,0 - 7,5 - 8,0 – 8,5 – 9,0 – 9,5 – 10,0). Sau mỗi 2h tiế<br /> ậ<br /> vi khuẩn b ng máy<br /> ổ ở ư c sóng 600 nm. Số liệ ư c s d<br /> xây d<br /> ườ<br /> ưởng<br /> nh pH tố ư<br /> ủng vi khuẩ X<br /> nh<br /> ưởng của nhiệ<br /> : Chủng vi khuẩn<br /> ư c l a chọ ư<br /> ường LB l ng lắc ở pH tố ư ,<br /> v i 7 mức nhiệt<br /> (40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC). Sau mỗi 2h tiế<br /> ậ<br /> vi khuẩn<br /> b<br /> ổ ở ư c sóng 600 nm. Số liệ ư c s d<br /> xây d<br /> ường cong<br /> ưở<br /> nh nhiệ<br /> tố ư<br /> ủng vi khuẩn<br /> Thử kh ă g i h e z e g i bào: D ch nuôi c y vi khuẩn ở<br /> u kiện tố ư<br /> ư c ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và tiế<br /> nh ho t tính enzyme amylase,<br /> protease và cellulase b<br /> ươ<br /> ế<br /> ĩ<br /> X<br /> nh<br /> ưởng của<br /> nhiệ<br /> t i ho t tính của enzyme ngo<br /> ươ<br /> A<br /> i tiến (Yang và Wang,<br /> 1994) s d<br /> H<br /> dừng ph n ứng.<br /> II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả phân lập<br /> Sau khi phân lậ<br /> ường LB rắ ,<br /> ơ<br /> b<br /> ư c 8 chủng vi khuẩn (KG1, KG2, KG3, KG4,<br /> KG5, KG , KG<br /> KG )<br /> ưởng m nh ở<br /> u kiện<br /> 50oC. Các chủ<br /> ư<br /> ư<br /> ầu v hình<br /> thái, kh ă<br /> tc ư<br /> nh là lo i<br /> G<br /> ươ<br /> Đ tiến hành các thí nghiệ<br /> u<br /> kiện nuôi c y tố ư<br /> t tính các enzyme ngo i bào,<br /> chúng tôi l a chọn chủng KG7 có tố<br /> ưởng m nh<br /> nh<br /> nh danh d a trên trình t<br /> n gen mã hóa rRNA<br /> 16S Đ<br /> m hình thái chủng KG7: khuẩn l c màu trắng,<br /> trong, tròn, nhẵn và có vá<br /> c trên b m t. Tế bào Gram<br /> ươ , ì<br /> ue và có kh ă<br /> ng m nh.<br /> 2. Kết quả định danh chủng KG7<br /> DNA của chủ KG ư c tách chiết b ng quy trình<br /> Ferris, 1996 c i tiến khi tế bào vi khuẩn không b phá vỡ ở<br /> u kiện nhiệ<br /> ,<br /> khắc ph c enzyme protease K<br /> b n nhiệ ư c bổ<br /> ệm chiết. DNA tổng số của<br /> chủ KG ư c ki m tra trên gel Agarose 1% cho ch t<br /> ư ng tố , ă<br /> NA<br /> , é,<br /> ứt gãy (hình 2).<br /> Mẫu DNA chủ KG ư c s d<br /> nhân dòng<br /> n gen RNA 16S gi a 2 c p mồi RIB16 F&R. S n phẩ P R ư c ki m tra b<br /> ện di<br /> ư cd<br /> ng 770 bp. S n phẩm PCR tinh s ch tiế<br /> ọc tr c tiếp trên<br /> máy CEQ8000 theo 2 chi<br /> (RI<br /> F)<br /> ư (RI<br /> R)<br /> é ì<br /> . Kết qu<br /> <br /> 1769<br /> <br /> HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6<br /> <br /> trình t so sánh v i chủng Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 thu ư<br /> ư Hì<br /> và Hình 4 cho th y chủng KG7 thu c chi Bacillus, t<br /> t tên là Bacillus licheniformis KG7.<br /> Đ<br /> ẩn có ti<br /> ă ứng d ng to l n trong công nghiệp v i kh ă<br /> z<br /> ngo i bào r<br /> ng: proteases, pectate lyases, lipases and nhi u lo i enzyme phân hủy<br /> polysaccharide (Veith, 2004). Toàn b genome củ<br /> ư c gi i trình t v i tên chủng<br /> Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 (Genbank, NCBI).<br /> <br /> Hình 3: So sánh trình tự của chủng KG7 với chủng Bacillus licheniformis<br /> DSM 13=ATCC 14580 trên Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov)<br /> <br /> Hình 4: Cây phân loại chủng KG7 xây dựng bằng phần mềm BLASTN 2.2.31<br /> (www.ncbi.nlm.nih.gov) (NQTrung, 2009)<br /> 3. Kết quả ác định ảnh hƣởng của nhiệ độ, pH tối ƣ<br /> Chủ KG<br /> ưởng<br /> ường LB l ng, lắc m nh nh t ở pH 7,5-8,0, các mức<br /> o<br /> pH 8,<br /> u ức chế<br /> ưởng của vi khuẩn (Hình 5). Nhiệ<br /> tố ư<br /> ,<br /> nhiệ<br /> tối thích cho loài Bacillus licheniformis nói chung (Veith, 2004). Chủ KG ư c<br /> 1770<br /> <br /> HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6<br /> <br /> phân lập từ nguồ ư c nóng nên có ti<br /> công nghiệp, vì vậy chúng tôi tiếp t<br /> chủng này.<br /> <br /> ă<br /> <br /> z<br /> ă<br /> <br /> n nhiệt r t h u ích trong<br /> t số enzyme ngo i bào của<br /> <br /> Hình 5: Đƣờng c ng inh ƣởng trong 24h của chủng KG7<br /> ở các điều kiện pH (trái) và nhiệ độ (phải)<br /> 4. Đánh giá enz<br /> <br /> e ng ại bào chủng KG7<br /> <br /> Các chủng vi khuẩ ư c nuôi c<br /> ường LB l ng, lắc và sau 24h hút d ch<br /> z<br /> th ho t tính. Ho t tính củ<br /> z<br /> ư c th b<br /> ươ<br /> ế<br /> ĩ<br /> th ch. Sau khi th ho t tính, chúng tôi nhận th y chủng KG7 có kh ă<br /> i<br /> enzyme: amylase, protease, cellulase.<br /> <br /> a. Amylase<br /> <br /> b. Protease<br /> <br /> c. Cellulase<br /> <br /> Hình 6: Vòng phân giải cơ chất của dịch ngoại bào chủng KG7 (NQTrung, 2009)<br /> Tiếp t<br /> t tính xúc tác của<br /> 3 enzyme ở các mức nhiệ<br /> khác nhau<br /> ( ì<br /> )<br /> ư c amylase có ho t tính xúc<br /> tác cao nh t ở 60oC, protease và cellulase<br /> có ho t tính xúc tác cao nh t ở 70o N ư<br /> vậy 3 enzyme ngo i bào của chủng KG7<br /> u có th xếp vào nhóm b n nhiệt<br /> (thermophilic enzyme) v i kho ng nhiệt<br /> ho<br /> ng trên 60oC. Trong công<br /> nghiệp, việc ứng d<br /> z<br /> ồng thời<br /> v i nâng nhiệ<br /> x lý nguyên, vật liệu sẽ<br /> ă<br /> ố<br /> ph n ứng, ă<br /> ă<br /> t và Hình 7: Ảnh hƣởng của nhiệ độ đến hoạt tính<br /> gi m chi phí. Vì vậy, cần tiếp t<br /> của các enzyme amylase, protease, cellulase<br /> tiến t i khai thác các enzyme b n nhiệt<br /> từ chủng vi khuẩ ư<br /> ệt KG7 từ nguồn khoáng nóng của Việt Nam.<br /> 1771<br /> <br /> HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6<br /> <br /> III. KẾT LUẬN<br /> Đ<br /> ậ<br /> ư c chủng KG7 thu c loài Bacillus licheniformis, t<br /> t tên là<br /> Bacillus licheniformis KG7. Kết qu<br /> ường LB l , KG<br /> ưởng tốt<br /> nh t ở 50oC và pH 7.5-8.0. Tiếp t<br /> ă<br /> z<br /> n nhiệt của chủng KG7<br /> ư c ho t tính của 3 lo i enzyme ngo i bào là: amylase, cellulase, protease. Ho t tính<br /> cao nh t của enzyme amylase là 60oC (195,2U/ml), của cellulase là 70oC (205U/ml) và protease<br /> là 70oC (223,4U/ml).<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Dereeper A., S. Audic, J.M. Claverie, G. Blanc, 2010. BLAST-EXPLORER helps you<br /> building datasets for phylogenetic analysis. BMC Evol Biol (PubMed)<br /> 2. Ferris, M. J., G. Muyzer, D.M. Ward, 1996. Applied Environmental Microbiology, 62(2):<br /> 340-6.<br /> 3. Phan Tuấn Nghĩ , Ng ễn Quốc Trung, Nguyễn Cảnh Thắng, Nguyễn Thị Thanh<br /> Hƣơng, Lê T ấn Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Bảo, 2007. Phân lập chủng vi<br /> khuẩn sinh enzyme amylase ngo i bào b n nhiệt từ suố ư c nóng Bang, Qu ng Bình. T p<br /> chí Di truy n học và Ứng d ng, 3 (4): 37-43.<br /> 4. Veith, B., C. Herzberg, S. Steckel, J. Feesche, K. H. Maurer, P. Ehrenreich, S. Bäumer,<br /> A. Henne, H. Liesegang, R. Merkl, A. Ehrenreich, G. Gottschalk, 2004. Journal of<br /> Molecular Microbiology Biotechnology, 7(4): 204-211.<br /> 5. Yang SS., JY. Wang, 1999. Protease and amylase production of Streptomyces rimosus in<br /> submerged and solid state cultivations. Bot. Bull. Acad. Sin. 40: 259-265<br /> 6. Zhang Z., S. Schwartz, L. Wagner, W. Miller, 2000. A greedy algorithm for aligning<br /> DNA sequences. J Comput Biol 2000; 7(1-2): 203-214.<br /> 7. Enzymes in Industrial Applications: Global Markets 2011. BBCresearch.<br /> <br /> ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR ENZYMES<br /> OF THERMOPHILIC Bacillus licheniformis KG7 STRAIN IN KENH GA HOT<br /> SPRING, NINH BINH<br /> NGUYEN QUOC TRUNG, NGO THI HIEN<br /> <br /> SUMMARY<br /> A potentially new thermophilic bacteria strain (code name KG7) was from Kenh Ga hot<br /> spring, Ninh Binh province. It is rod-shaped, high mobility and Gram-positive bacteria. Study<br /> on DNA sequence of rRNA 16S between primers pair (RIB16F&R) identified KG7 strain was<br /> belong to Bacillus genus with 98% homologous to Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC<br /> 14580 strain (GenBank). In this study, we named KG7 strain as Bacillus licheniformis KG7.<br /> Growth curve of KG7 strain was constructed in 24h in liquid LB medium and optimal condition<br /> was determined as in 50oC and pH 7.5-8.0. Extracellular enzyme assay revealed activities of<br /> protease, amylase and celullase after growing KG7 strain in 24h. Thermostability of these<br /> z<br /> w<br /> z w<br /> f<br /> A<br /> ‟<br /> Highest activity of amylase was in 60oC<br /> (195,2U/ml), cellulase was in 70oC (205U/ml) and protease was 70oC (223,4U/ml). The result of<br /> thermophilic bacteria isolation and thermostable enzymes characterization was one of the<br /> constribution to utilization of micro-organism resource of Vietnam.<br /> 1772<br /> <br />