Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG<br /> VI<br /> KHUẨN LACTIC CÓ TIỀM NĂNG PROBIOTIC<br /> Phan Thị Thanh Diễm1<br /> Tóm tắt: Vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo<br /> ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Ngoài ra chúng còn tạo ra các<br /> chế phẩm probiotic đáp ứng nhu cầu sức khỏe của con người. Từ các nguồn thực phẩm lên men<br /> khác nhau chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được bốn chủng vi khuẩn có khả năng sinh lactic<br /> acid cao đó là L1, L2, L4 và L6. Tiếp tục kiểm tra tiềm năng probiotic của các chủng trên cho thấy<br /> cả 4 chủng đều có khả năng đối kháng mạnh với E. coli và có khả năng sống sót trong điều kiện<br /> pH thấp. Trong đó L1 là chủng có tiềm năng probiotic cao nhất.<br /> Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Probiotic.<br /> <br /> 1.<br /> <br /> Mở đầu<br /> <br /> Cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người, cuộc cách mạng khoa học<br /> kỹ thuật đưa con người bước vào nền văn minh hiện đại. Khi những nhu cầu về vật chất được đáp<br /> ứng, con người ngày càng quan tâm đến sức khỏe của mình hơn. Vì vậy, con người đã và luôn đi<br /> tìm một sản phẩm hoàn thiện vừa chăm sóc và bảo vệ sức khỏe, vừa có thể là dược phẩm để trị<br /> liệu một số bệnh của thời đại. Probiotic là sản phẩm đáp ứng được các yêu cầu đó. Dù ngàn năm<br /> trước con người đã biết sử dụng probiotic như một thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những<br /> năm gần đây probiotic mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn.<br /> Các nhà khoa học đã tìm ra hầu hết vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến trong những sản<br /> phẩm lên men thông thường để tạo ra các chế phẩm probiotic chất lượng phục vụ cho con người<br /> như: sữa uống Yakult, men vi sinh sống hỗ trợ điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa… Về mức độ an toàn<br /> thì probiotic luôn đứng ở vị trí đầu so với các phương thức khác, vì tác động của probiotic xuất<br /> phát từ cơ chế điều hòa tự nhiên, không gây nên bất cứ một sản phẩm phụ có hại nào hay một tác<br /> động xấu nào đến cơ thể sinh vật chủ. Tuy nhiên, để có được một chế phẩm probiotic thỏa mãn<br /> tất cả những yêu cầu được đặt ra với hoạt tính cao cần thiết, nhất định phải nói đến quá trình chọn<br /> lọc các chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic. Đây là bước cực kỳ quan trọng, bởi vì nó được<br /> xem là yếu tố quyết định vai trò, tác dụng của chế phẩm probiotic lên đối tượng cần quan tâm.<br /> Một chủng vi khuẩn có được xem là có khả năng sinh probiotic hay không phụ thuộc vào kết quả<br /> của khâu tuyển chọn này. Bài báo này trình bày một số kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng<br /> vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic.<br /> 2.<br /> <br /> Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> 2.1 . Vật liệu<br /> <br /> 1<br /> <br /> . ThS. Khoa Lý-Hóa-Sinh, trường Đại học Quảng Nam<br /> <br /> Các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men như yaourt, dưa cải chua, men<br /> tiêu hóa sống có trên thị trường.<br /> Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn lacticMôi trường MRS: peptone: 10 g; cao thịt: 10 g; cao nấm men: 5 g; glucose: 10 g; Tween: 1ml;<br /> K2HPO4: 2 g; natrium acetate: 5 g; ammonium citrate: 2 g; MgSO4: 0,2 g; MnSO 4: 0,2 g; agar:<br /> 20g; nước cất thêm đủ: 1000 ml<br /> Môi trường sơ chọn giống carbonate-agar: cao nấm men: 5 g; glucose: 20 g; CaCO3: 10 g;<br /> agar: 20g; nước cất: 1000 ml.<br /> Môi trường lên men: glucose: 10 g; peptone: 10 g; cao thịt: 1 g; NaCl: 5 g; nước cất thêm<br /> đủ 1000 ml; pH: 7,4.<br /> Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật kiểm định: cao thịt: 5 g; peptone: 5 g; NaCl:<br /> 5 g; agar: 20 g, nước cất thêm đủ 1000 ml.<br /> -<br /> <br /> Các hóa chất được mua từ Đức (Merck), Trung Quốc.<br /> 2.2 . Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1.<br /> <br /> Phương pháp pha loãng và phân lập<br /> <br /> Dịch lên men được pha loãng bằng nước cất vô trùng theo sơ đồ ở Hình 1.<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ mô tả phương pháp pha loãng<br /> Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch lên men ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến 10-8,<br /> nhỏ lên môi trường MRS-agar pH=5,5; trong điều kiện kỵ khí và nhiệt độ nuôi ủ ở 370C. Sau 2448 giờ những khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặc trưng về màu sắc, hình dạng và kích thước.<br /> 2.2.2. Chọn giống có khả năng sinh lactic acid bằng cách thử khả năng phân giải CaCO3<br /> Sau khi phân lập trên môi trường MRS-agar, chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, cấy ria trên môi<br /> trường carbonate-agar, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện kỵ khí. Sau 72 giờ chọn các<br /> chủng sinh lactic acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng<br /> lớn chứng tỏ lượng axít sinh ra càng nhiều.<br /> 2.2.3.<br /> <br /> Chọn giống có khả năng sinh lactic acid bằng thuốc thử Uphenmen<br /> <br /> Dùng que cấy vô trùng lấy các chủng vi khuẩn đã thuần khiết cấy vào bình tam giác chứa 20<br /> ml môi trường MRS dịch thể, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó dịch nuôi cấy<br /> được ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút lấy dịch nuôi cấy để loại bỏ tế bào vi khuẩn, thu lấy dịch<br /> trong. Lấy 3 ml dịch cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml thuốc thử Uphenmen, quan sát sự đổi<br /> màu của thuốc thử. Tiến hành đồng thời 2 thí nghiệm đối chứng:<br /> -<br /> <br /> Đối chứng 1: 3 ml lactic acid 2% + 2 ml thuốc thử<br /> <br /> -<br /> <br /> Đối chứng 2: 3 ml MRS dịch thể không cấy vi khuẩn + 2 ml thuốc thử<br /> Quan sát sự đổi màu ở các ống nghiệm để xác định chủng vi khuẩn tạo ra lactic acid nhiều<br /> <br /> nhất.<br /> 2.2.4.<br /> <br /> Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn<br /> <br /> Cấy vi khuẩn phân lập được lên bề mặt môi trường MRS-agar sao cho tạo được những khuẩn<br /> lạc tách rời. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau 72 giờ quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.<br /> Quan sát tế bào vi khuẩn lactic dưới kính hiển vi vật kính 40X, mô tả sơ bộ hình thái tế bào của<br /> các chủng nghiên cứu.<br /> 2.2.5.<br /> <br /> Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic<br /> <br /> Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic bằng cách tiến hành các thí<br /> nghiệm: kiểm tra khả năng sống sót trong pH thấp, kiểm tra khả năng đối kháng với vi sinh vật<br /> kiểm định, tạo chất kháng khuẩn.<br /> 2.2.5.1. Kiểm tra khả năng sống sót trong pH thấp<br /> Chuẩn bị môi trường MRS đã điều chỉnh pH từ 2, 3, 4 và 5 bổ sung 1 ml dịch vi khuẩn đã<br /> hoạt hóa, ủ kị khí ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm 4000 vòng<br /> trong 15 phút, thu lấy sinh khối, hòa với nước muối sinh lý và bổ sung đủ thể tích ban đầu đem ly<br /> tâm. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 610 nm. Ống đối chứng làm tương tự nhưng không<br /> chỉnh pH.<br /> 2.2.5.2. Kiểm tra khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ<br /> thạch.<br /> Các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể<br /> ở 37 C, sau 48 giờ ly tâm 5000 vòng/7 phút thu được dịch trong suốt. Vi sinh vật kiểm định nuôi<br /> trên môi trường MPA ở 300C, sau đó dùng khoan khoan lỗ thạch có đường kính d=10 mm. Hút 10<br /> µl dịch trong suốt cho vào lỗ thạch đã khoan đặt trong tủ lạnh 40C, sau 12-24 giờ chuyển sang nuôi<br /> trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Kiểm tra vòng vô khuẩn.<br /> 0<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic<br /> 3.1.1.<br /> <br /> Phân lập<br /> <br /> Từ các nguồn yaourt, nước dưa cải chua, sữa proby (men tiêu hóa sống) chúng tôi đã tiến<br /> hành phân lập trên môi trường MRS-agar và đã làm thuần được 7 chủng vi khuẩn có đặc tính<br /> probiotic ký hiệu từ L1-L7. Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 1.<br /> Bảng 1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic<br /> Nguồn phân lập<br /> <br /> STT<br /> <br /> Ký hiệu chủng<br /> <br /> 1<br /> <br /> L1<br /> Yaourt<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> <br /> L2<br /> L3<br /> Sữa chua proby<br /> <br /> 4<br /> <br /> L4<br /> <br /> 5<br /> <br /> L5<br /> <br /> 6<br /> <br /> L6<br /> Dưa cải chua<br /> <br /> 7<br /> L7<br /> Để phân biệt được các chủng trên chúng tôi dựa vào sự khác nhau về hình dạng, màu sắc,<br /> kích thước của khuẩn lạc và hình thái của tế bào vi khuẩn.<br /> 3.1.2.<br /> <br /> Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic<br /> <br /> Mục đích của thí nghiệm là tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid lactic, do đó chúng<br /> tôi tiến hành khảo sát khả năng phân giải CaCO3, khảo sát đặc điểm nuôi cấy và hình thái khuẩn<br /> lạc của chủng tuyển chọn, khảo sát bằng phản ứng tạo acetaldehyt và thử phản ứng với thuốc thử<br /> Uphenmen để chọn ra các chủng có khả năng sinh axít mạnh.<br /> 3.1.2.1. Khả năng phân giải CaCO3<br /> Với 7 chủng phân lập được và đã thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường<br /> thạch đĩa carbonate-agar. Sau 72 giờ nuôi cấy, nhận thấy rằng tất cả các chủng đều xuất hiện vòng<br /> phân giải trong suốt xung quanh khối tế bào vi khuẩn. Qua đó, ta thấy trong quá trình sinh trưởng<br /> phát triển chúng đã tạo ra acid lactic, mức độ sinh ra acid lactic của mỗi chủng là khác nhau. Kết<br /> quả thu nhận được trình bày ở Bảng 2.<br /> Bảng 2. Khả năng làm tan CaCO3 của 7 chủng vi khuẩn tuyển chọn<br /> STT<br /> <br /> Nguồn phân lập<br /> <br /> 1<br /> <br /> Ký hiệu chủng<br /> <br /> Khả năng sinh acid<br /> lactic (D-d mm)<br /> <br /> L1<br /> <br /> 12<br /> <br /> L2<br /> L3<br /> <br /> 10<br /> 8<br /> <br /> Yaourt<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> Sữa chua proby<br /> <br /> 4<br /> <br /> L4<br /> <br /> 11<br /> <br /> 5<br /> <br /> L5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> L6<br /> <br /> 10<br /> <br /> Dưa cải chua<br /> 7<br /> L7<br /> 9<br /> Qua Bảng 2 nhận thấy khả năng phân giải CaCO 3 của chủng L1, L2, L4, L6 cao hơn các<br /> chủng L3, L5, L7. Chứng tỏ các chủng L1, L2, L4, L6 sinh ra lượng acid lactic nhiều hơn trong<br /> quá trình sinh trưởng.<br /> <br /> Hình 2. Khả năng làm tan CaCO3 của các chủng L1, L2<br /> <br /> Hình 3. Khả năng làm tan CaCO3 của các chủng L4, L6<br /> 3.1.2.2. Khảo sát khả năng sinh lactic acid của các chủng phân lập được bằng thuốc thử<br /> Uphemen<br /> <br />