Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích đa dạng di truyền của ba loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HÀ

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ

(EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA)

LÀM CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HÀ

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ

(EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA) LÀM

CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

\

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Nguyễn Việt Cƣờng

Hà Nội - 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Cƣờng - Bộ môn Lai giống – Viện NS Giống và CNSH lâm nghiệp, ngƣời đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; Ban lãnh đạo Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp cùng các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi gửi lời cảm ơn đến bạn bè và ngƣời thân trong gia đình đã động

viên, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dào

sức khỏe, thành công trong sự nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2017

Học viên

Trần Thị Thu Hà

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC ......................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................... 3

1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn ................................... 3

1.1.1. Trên thế giới .......................................................................................... 3

1.1.2. Tại Việt Nam ........................................................................................... 6

1.2. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật ADN ........................................ 8

1.3. Ƣu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử ......................................... 13

1.4. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di

truyền và chọn giống cây lâm nghiệp ............................................................. 15

1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 15

1.4.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20

CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 25

2.1. Mục tiêu .................................................................................................... 25

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25

2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu ............................................. 25

2.3.1. Đối tượng .............................................................................................. 25

2.3.2. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 27

2.3.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 27

2.3.4. Hóa chất ................................................................................................ 27

2.3.5. Thiết bị ................................................................................................... 28

iii

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 28

2.4.1. Các phương pháp sử dụng trong phòng thí nghiệm ............................. 28

2.4.2. Các phương pháp ngoài hiện trường .................................................... 35

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 37

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 40

3.1. Phân tích đa dạng di truyền của các cây bố mẹ đã chọn .......................... 40

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................ 40

3.1.2. Kết quả phản ứng PCR từ ADN tổng số của các mẫu bạch đàn với các

mồi SSR ........................................................................................................... 40

3.1.3. Kết quả phân tích quan hệ di truyền giữa các cây bố mẹ chọn lai

giống................................................................................................................41

3.2. Xây dựng các tổ hợp lai ........................................................................... 45

3.2.1. Xác định thời điểm nở hoa, kết quả của các cây bố mẹ tham gia lai giống 45

3.2.2. Lai giống ............................................................................................... 46

3.2.3. Khảo nghiệm các tổ hợp bạch đàn lai tại Trường Sơn – Lương Sơn -

Hòa Bình ......................................................................................................... 48

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 55

4.1. Kết luận .................................................................................................... 55

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 56

Tiếng Việt: ....................................................................................................... 56

Tiếng Anh: ....................................................................................................... 58

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 62

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribonucleic

AFLP

Amplified fragment length polymorphism

APS

Amonium Persulfate

ARN

Axit Ribonucleic

bp

Base pair

cM

Centi Morgan

CTAB

Cetyltrimethyl Amonium Bromide

CTPT

Chỉ thị phân tử

cs

Cộng sự

CU

Dòng bạch đàn lai E. camaldulensis x E. urophylla

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetra Acetic Acid

ISSR

Inter-Simple sequence repeat

kb

Kilo base

MAS

Marker Assisted Selection

Nu

Nucleotide

PCR

Polymerase chain reaction.

PU

Dòng bạch đàn lai giữa E. pellita và E. urophylla

QTL

Quantitative trait locus

RAPD

Random Amplified Polymosphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

v

Single nucleotide polymorphism

SNP

Simple sequence repeats

SSR

Sequence Tagged Sites

STS

Tris-Boric Acid-EDTA

TBE

Tris-EDTA

TE

UC

Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. camaldulensis

UE

Dòng bạch đàn lai E. urophylla và E. exserta

UP

Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. pellita

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1. Danh mục các cây bạch đàn bố mẹ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

..............................................................................................................................26

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 31

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền giữa 19 cây bạch đàn ................................. 41

Bảng 3.2. Vật hậu học của các loài cây tham gia lai giống ............................ 45

Bảng 3.3. Danh mục 61 tổ hợp lai giữa 3 loài bạch đàn ................................. 46

Bảng 3.4. Sinh trƣởng các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình.. ............................. 48

Bảng 3.5. Sinh trƣởng của các tổ hợp bạch đàn lai thuận nghịch ................... 51

Bảng 3.6. Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình .................... 51

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

Hình 2.1. Cây bố mẹ U4 (D1.3=17,9 cm) (U4 - sinh trƣởng chậm) ....................... 27

Hình 2.2. Cây bố mẹ U3 (D1.3=39,8cm) (U3 – sinh trƣởng nhanh)……………….27

Hình 2.3. Mẫu lá bảo quản ........................................................................................ 29

Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ................................................................... 32

Hình 2.5. Lắp đặt dàn giáo lai giống ......................................................................... 36

Hình 2.6. Chọn hoa và khử đực …………………………………………………...36

Hình 2.7. Chụp bao cách ly …………………………………………………………36

Hình 3.1. Kết quả điện di tinh sạch ADN tổng số 19 cây bạch đàn ......................... 40

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của mồi EMBRA229 và EMBRA165

với 19 mẫu bạch đàn trên gel polyacrylamide 4,5% ................................................. 41

Hình 3.3. Cây phân loại di truyền của 19 cây bạch đàn ............................................ 42

Hình 3.4. Quan hệ di truyền giữa 19 cây bạch đàn ................................................... 42

Hình 3.5. Tổ hợp bạch đàn lai C4U4 ở Hòa Bình ..................................................... 53

1

MỞ ĐẦU

Bạch đàn là cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh, có khả năng thích nghi

với nhiều vùng sinh thái nên đƣợc xem là một trong những loài cây dẫn đầu

về trồng rừng sản suất trên thế giới với tổng diện tích đạt 20,07 triệu ha vào

năm 2014. Gỗ bạch đàn đƣợc sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất,

nguyên liệu chế biến ván ép, ván dăm và ngành công nghiệp giấy cũng nhƣ

sản phẩm sinh khối cho ngành năng lƣợng.

Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chƣơng

trình cải thiện giống cây rừng, với mục tiêu chính là tăng nâng cao chất lƣợng

sản phẩm gỗ, cải thiện các đặc tính sinh học nhƣ: tính chống chịu điều kiện

ngoại cảnh bất lợi, chống chịu sâu, bệnh…

Hiện nay, ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền làm

cơ sở cho quá trình chọn giống là hƣớng nghiên cứu có triển vọng. Có nhiều

loại chỉ thị phân tử nhƣ: AFLP, RFLP, RAPD, SSR, STS, SNP,…mỗi kỹ

thuật có ƣu nhƣợc - điểm riêng, trong đó đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị

RAPD và SSR.

Chỉ thị RAPD phù hợp cho nghiên cứu những loài mới chƣa biết rõ

thông tin về trình tự ADN và chƣa có nghiên cứu nào phát triển bộ chỉ thị cho

loài này. Do chỉ thị RAPD là mồi đơn với trình tự là một chuỗi nucleotide

ngắn (5-12 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên ở nhiều vị trí nên khi sử dụng chỉ

thị RAPD trong nghiên cứu, kết quả của mỗi lần thí nghiệm có thể khác nhau,

vì vậy cần phải có sự lặp lại các thí nghiệm. Trong khi đó, chỉ thị SSR là các

cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên hai đầu của các đoạn lặp lại có trình

tự rất đặc hiệu và thống nhất chung cho cùng một đoạn ADN không phân biệt

các cá thể trong cùng một loài, nhƣng giữa các cá thể trong cùng một loài thì

số lần lặp lại là khác nhau. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị SSR cho kết quả chính

xác hơn so với chỉ thị RAPD và thƣờng đƣợc sử dụng cho nghiên cứu các loài

2

đã có những bộ chỉ thị phát triển riêng cho loài hoặc những loài trong cùng

một chi.

Năm 2001, tại trƣờng Đại học Tasmania của Úc, Steane và cs đã sử dụng

12 cặp mồi có kí hiệu EMCRC dùng để nhân bản các chỉ thị SSR ở cây bạch

đàn. Ngoài ra còn khoảng 30 cặp mồi mang các đoạn lặp lại (CA)n và

(CAG)n cũng đƣợc tạo ra bằng việc sử dụng thƣ viện bộ gen [41].

Cho đến nay với đối tƣợng cây bạch đàn, số lƣợng chỉ thị SSR đã lên

đến hàng nghìn, nhƣng bộ chỉ thị phân tử SSR đang đƣợc sử dụng trong

nghiên cứu phổ biến nhất là EMBRA, có 300 mồi SSR với tên gọi EMBRA

đã đƣợc các nhà khoa học tại Braxin phát triển [25].

Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ “Phân tích đa dạng di truyền của ba

loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ

sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài”, học viên đã ứng dụng

phƣơng pháp chỉ thị phân tử SSR để phân tích đa dạng di truyền cho 19 cây

bố mẹ tham gia lai giống của 3 loài bạch đàn (E. urophylla, E. exserta,

E. camaldulensis), là cơ sở để cho các nhà lai tạo giống biết bản chất quan hệ

di truyền giữa các cây trong loài và giữa các loài với nhau để chọn đƣợc bố

mẹ lai thích hợp nhất.

Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn

lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cƣờng

làm chủ nhiệm đề tài và tôi có tham gia thực hiện một số phép lai giống và

phân tích đa dạng di truyền các loài cây bố mẹ trong phòng thí nghiệm.

3

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn

1.1.1. Trên thế giới

Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc bộ Sim (Myrtales), họ

Sim (Myrtaceae). Hiện nay, chi này gồm hơn 700 loài, hầu hết có nguồn gốc

từ Úc, còn một số loài khác có xuất xứ từ New Guinea và Indonesia. Các loài

bạch đàn đã đƣợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu

Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán

đảo Ấn Độ, Đông Nam Á…[45].

Bạch đàn là cây sinh trƣởng nhanh, gỗ đƣợc dùng làm nguyên liệu giấy,

ván dăm, ván sợi ép, đồ mộc, gỗ xây dựng, cột chống... Ngoài ra, lá của một

số loài bạch đàn còn đƣợc sử dụng để tách chiết tinh dầu và chế biến dƣợc

phẩm. Trên thế giới, bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích

ngày càng đƣợc mở rộng. Theo số liệu công bố, rừng trồng bạch đàn đến năm

2009 đã đạt khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và

Châu Á-Thái Bình Dƣơng. Ấn Độ là nƣớc có diện tích rừng trồng bạch đàn

lớn nhất thế giới, năm 2009 ƣớc tính có khoảng 3,9 triệu ha [46].

Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến

lƣợc cải thiện giống cây rừng. Các chƣơng trình khảo nghiệm giống bạch đàn

ở một số quốc gia đã và đang đƣợc chú trọng.

Tại Nam Phi, từ năm 1973 đến năm 1983, Darrow đã tiến hành 9 khảo

nghiệm phối hợp 26 xuất xứ Bạch đàn caman (E. camaldulensis), 23 xuất xứ

Bạch đàn tere (E. tereticornis) và 23 xuất xứ Bạch đàn grandis (E. grandis).

Kết quả cho thấy, ở những vùng ẩm thì Bạch đàn grandis cho năng suất cao

nhất, sau đó đến Bạch đàn tere. Còn ở những vùng khô hạn và có sƣơng giá

thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn [30].

4

Chew T.K. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 nơi khác nhau trên bán

đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trƣởng tốt nhất là loài

Bạch đàn caman (2 xuất xứ Bắc Úc) và Bạch đàn degluta, các loài triển vọng

khác là Bạch đàn brassiana, Bạch đàn urô và Bạch đàn tere [29].

Rao D.V. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của

Bạch đàn caman, Bạch đàn tere tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana

của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trƣởng cho thấy có 10 xuất xứ Bạch đàn caman

và 5 xuất xứ Bạch đàn tere sinh trƣởng tốt [38].

Viện nghiên cứu lâm nghiệp Dehra Dun ở Ấn độ đã tạo đƣợc 2 giống

bạch đàn lai ký hiệu là F.R.I-4 và F.R.I-5, có sức sinh trƣởng nhanh và có tính

thích nghi rộng hơn loài thuần, tại tuổi 4 cây lai có khối lƣợng thể tích gấp 3

lần Bạch đàn tere cùng tuổi. Tổ hợp lai Bạch đàn tere x Bạch đàn grandis có

khả năng sinh trƣởng tốt trên đất khô và nghèo dinh dƣỡng mà chính ở đó

Bạch đàn grandis lại sinh trƣởng rất kém. Chứng tỏ ƣu thế lai thể hiện mạnh

nhất ở nơi trồng không thuận lợi cho loài thuần [33], [32].

Từ năm 1989, Viện lâm nghiệp nhiệt đới Trung Quốc cũng tạo ra 204

cây lai từ các cặp bố mẹ giữa Bạch đàn urô với các loài Bạch đàn tere, Bạch

đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn ƣớt và Bạch đàn

pellita. Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn

tere và Bạch đàn urô x Bạch đàn caman đã có ƣu thế lai rõ rệt về sinh trƣởng

so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vƣợt bố mẹ với các trị số tƣơng

ứng là 120,7% và 89,4% [40].

Theo Turvey (1995), tổ hợp lai giữa Bạch đàn grandis với Bạch đàn urô có năng suất rừng trồng lên 45,5 m3/ha (2,5 tuổi) trong lúc xuất xứ Wetar tốt nhất của bạch đàn urô chỉ đạt 29,31 m3/ha [42].

Nghiên cứu ƣu thế lai về năng suất đƣợc thực hiện trên các tổ hợp Bạch

đàn grandis x Bạch đàn urô, Bạch đàn pellita x Bạch đàn urô, kết quả cho thấy

5

chúng là những tổ hợp lai có ƣu thế lai vƣợt hơn các loài thuần và là giống

sản xuất ở Braxin và Congo [21].

Chƣơng trình cải thiện giống bạch đàn dựa trên phép lai đôi và lai ba

cũng đƣợc thực hiện tại Braxin. Sinh trƣởng về thể tích ở tuổi 7 của những cá

thể lai ba [Bạch đàn urô x (Bạch đàn caman x Bạch đàn grandis)] là 0,331 m3/cây đã vƣợt các cây lai tốt nhất của các tổ hợp lai đôi (GU, GC, UC) có các trị số tƣơng ứng là 0,290m3/cây; 0,253 m3/cây; 0,234 m3/cây và loài thuần Bạch đàn urô, Bạch đàn grandis với các trị số tƣơng ứng là 0,229 m3/cây và 0,247 m3/cây(Assis, 2000) [18].

Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai giữa Bạch

đàn ƣớt (E. saligna) với Bạch đàn liễu (E. exserta) tạo ra đƣợc một số tổ hợp

lai có khả năng vƣợt trội hơn loài Bạch đàn liễu tới 82% về thể tích thân cây,

trong đó tổ hợp lai nghịch Bạch đàn liễu x Bạch đàn ƣớt có sinh trƣởng nhanh

hơn tổ hợp lai thuận Bạch đàn ƣớt x Bạch đàn liễu. Hiện các giống lai đƣợc

trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng

thời sinh trƣởng nhanh [40].

Thông thƣờng ƣu thế lai thể hiện rõ hơn trong những điều kiện môi

trƣờng sống bất lợi và chúng có phạm vi thích ứng rộng hơn mức bình

thƣờng. Nghiên cứu của Verryn (2000) cho thấy những tổ hợp lai có khả năng

chống chịu với điều kiện môi trƣờng bất lợi tốt là Bạch đàn grandis x Bạch

đàn caman, Bạch đàn grandis x Bạch đàn tere, Bạch đàn grandis x Bạch đàn

urô. Ƣu thế lai về sinh trƣởng và tính chịu lạnh đƣợc tìm thấy ở tổ hợp lai

Bạch đàn grandis x Bạch đàn niten, còn ƣu thế lai về sinh trƣởng và chống

chịu bệnh loét thân thể hiện ở tổ hợp lai Bạch đàn grandis x Bạch đàn urô [43].

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn các cặp bố mẹ trong lai giống

có tác động nhiều đến biểu hiện của ƣu thế lai, thƣờng các cặp bố mẹ có sinh

trƣởng tốt cho ƣu thế lai mạnh hơn các cặp bố mẹ có sinh trƣởng kém. Ngoài

6

ra các nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hƣởng của việc chọn loài để lai cũng tác

động đến biểu hiện ƣu thế lai, các loài có quan hệ di truyền xa nhau cho ƣu

thế lai mạnh hơn những loài có quan hệ gần gũi [22].

1.1.2. Tại Việt Nam

Bạch đàn đƣợc du nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, đến nay đã

trở thành nhóm cây trồng chủ lực trong các chƣơng trình trồng rừng tập trung

và phân tán ở nƣớc ta. Tổng diện tích trồng bạch đàn đến năm 2001 là

348.000 ha chiếm 30% diện tích trồng rừng cả nƣớc. Cùng với nhóm loài keo,

rừng trồng bạch đàn đã góp phần đáng kể đáp ứng nhu cầu gỗ nguyễn liệu,

ván dăm, gỗ trụ mỏ góp phần cải thiện đời sống cho ngƣời dân làm nghề rừng.

Các kết quả nghiên cứu ở giai đoạn trƣớc đã xác định đƣợc một số loài

bạch đàn có triển vọng trong trồng rừng là Bạch đàn urô chủ yếu cho các tỉnh

miền Bắc và Tây Nguyên ; Bạch đàn caman và Bạch đàn tere chủ yếu cho các

tỉnh miền Trung và miền Nam ; Bạch đàn pellita cũng là một loài rất có triển

vọng trên các vùng sinh thái trong cả nƣớc. Một số loài có triển vọng nhƣ

Bạch đàn uro, Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn pellita cũng đã đƣợc

xây dựng rừng giống và vƣờn giống [8],[14].

Từ năm 1991, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã tiến hành chọn

lọc cây trội và ghép một số cây Bạch đàn urô (U), Bạch đàn caman (C) và

Bạch đàn liễu (E). Giai đoạn 1996 – 2000, Trung tâm đã nghiên cứu và tiến

hành lai giống thuận nghịch cho ba loài nói trên bằng phƣơng pháp thụ phấn

có kiểm soát và tạo ra nhiều tổ hợp lai UC, CU, UE, EU, CE, EC và UU. Qua

khảo nghiệm đã chọn lọc đƣợc 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai đều có sinh

trƣởng nhanh hơn các loài bố mẹ. Các giống lai này đã đƣợc Bộ nông nghiệp

và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật theo quyết định số

4356 ngày 19/9/2001 và tác giả là GS. Lê Đình Khả cùng tập thể cán bộ

Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng [7].

7

Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) đã nghiên cứu chọn giống bạch đàn theo

sinh trƣởng và kháng bệnh, cho thấy 3 loài bạch đàn là Bạch đàn caman, Bạch

đàn brassiana và Bạch đàn tere có nhiều xuất xứ sinh trƣởng khá, có khả năng

kháng bệnh hại, đề tài chọn đƣợc số dòng có sinh trƣởng nhanh và kháng

bệnh cao. Qua nghiên cứu và kế thừa ở các giai đoạn trƣớc đề tài đã thu đƣợc

các kết quả sau: Tuyển chọn đƣợc 8 dòng bạch đàn có chỉ số bệnh thấp, sinh

trƣởng nhanh từ khu khảo nghiệm 50 dòng ở Sông Mây, trong đó 2 dòng

SM16 và SM23 đã đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật. Hai dòng này sinh trƣởng nhanh đạt trên 25 m3/ha/năm và chống chịu tốt với bệnh hại lá tại

Bình Dƣơng và Bình Phƣớc [11].

Dự án Sida-SAREC nghiên cứu cải thiện giống cây rừng trong đó có

nghiên cứu về lai giống giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn pellita, kết quả năm

2005-2006 đã tạo ra đƣợc 60 tổ hợp lai UP và PU, qua khảo nghiệm ở Hà

Nội, Nghệ An, Quảng Trị, Bình Dƣơng cho thấy có sự khác biệt về sinh

trƣởng ở các tổ hợp lai và các lập địa, kết quả có 3 tổ hợp lai có triển vọng

U70P28, U87P22, U87P8 cho lập địa Ba Vì và 2 tổ hợp lai cho Đông Hà

Quảng Trị là U70P48, U87P22 [9].

Đề tài “Nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông”

của TS. Nguyễn Việt Cƣờng đã chọn đƣợc 25 dòng bạch đàn lai (CU89,

UE35, UE52, GU94, UE34, UE46, UE69, UC80, UE27, UE30, UE73, UU9,

UE24, UE3, UE85, UE23, UC2, UU80, UG24, CU98, CU82, UG54, UG55,

TU104, TP12) có sinh trƣởng nhanh hơn các đối chứng U6, GU8, PN2 và

PN14 ở giai đoạn từ tuổi 2 đến tuổi 6. Trong số đó, có 5 dòng đã đƣợc công

nhận là giống quốc gia là UE24, UC80, UG24, CU82, CU98 [5].

Nhƣ vậy, bạch đàn lai đƣợc đánh giá có ƣu thế lai và sinh trƣởng tốt hơn

bố mẹ của chúng [6]. Cho đến nay, nhiều tổ hợp lai có sinh trƣởng vƣợt trội

hơn bố mẹ đã đƣợc công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật.

8

1.2. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật ADN

Sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử từ năm 1980 đã đem đến sự

tiến bộ ở tất cả các lĩnh vực của sinh học hiện đại, mở ra triển vọng có thể

nắm bắt và tiến tới cải biến cũng nhƣ điều khiển các gen quy định tính trạng

quan trọng.

Chỉ thị phân tử là các gen hoặc các đoạn ADN hệ gen. Chúng có thể dựa

trên cơ sở kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát hiện các locus

đơn gen hoặc đa gen, có thể đòi hỏi hoặc không đòi hỏi trình tự, có thể khác

nhau về mức độ tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng nhƣ bản chất

của sự đa hình mà chúng phát hiện.

Kỹ thuật chỉ thị phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật

liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền đƣợc nghiên

cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lƣợng lớn sự đa hình tạo

ra do tỷ lệ đột biến cao và vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị

hình thái.

Chỉ thị ADN đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền,

phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền,

nhận biết gen; trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận

biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất

lợi của môi trƣờng, năng suất và phẩm chất giống.

Mỗi loại chỉ thị ADN đƣợc phát triển bằng một kỹ thuật tƣơng ứng. Kỹ

thuật chỉ thị ADN lý tƣởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và

phân bố đều trong genom; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về di truyền, tạo

nhiều chỉ thị độc lập và chính xác; đơn giản, nhanh và ít tốn kém; cần ít mẫu

và ADN; liên kết với kiểu hình nhất định; có thể lặp lại trong các nghiên cứu,

mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm

lƣợng thông tin cao), không cần biết trƣớc thông tin về genom và cơ thể.

9

Một số chỉ thị ADN hiện đang đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị Đa hình

độ dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP ) và các chỉ thị dựa vào PCR nhƣ đa hình

các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD), mircosatellite hay còn gọi là đa

hình các đoạn lặp lại ngẫu nhiên (SSR), đa hình độ dài các đoạn nhân chọn

lọc (AFLP)…

 Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn - Restriction

Fragment Length Polymorphism):

Enzyme giới hạn là các nuclease có khả năng nhận biết những đoạn

ADN có trình tự nucleotide xác định, nó sẽ bám vào đoạn ADN đó và cắt cả

hai sợi của phân tử ADN vào giữa 2 nucleotide đối xứng nhau tại điểm cắt

hạn chế.

Kỹ thuật RFLP đƣợc xây dựng dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các

chuỗi nucleotide trong phân tử ADN và khi ADN bị cắt bởi enzyme giới hạn

thì tạo ra những phân đoạn khác nhau về kích thƣớc hay chiều dài [1].

 Chỉ thị phân tử RAPD (đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên -

Random Amplified Polymorphism DNA):

RAPD đƣợc hình thành dựa trên phƣơng pháp PCR. Nếu thực vật có bộ

gen hoàn toàn giống nhau, khi nhân bằng PCR với các mồi ngẫu nhiên thì các

đoạn ADN thu đƣợc sẽ hoàn toàn giống nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi

điện di trên gel thì kết quả nhân gen sẽ thu đƣợc số băng, vạch ADN ở những

vị trí giống nhau trên bản gel. Nếu bộ gen khác nhau thì kết quả thu đƣợc trên

điện di đồ là không giống nhau.

RAPD là kỹ thuật dựa trên PCR với một mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên

gồm khoảng từ 5÷12 nucleotide, các mồi này thƣờng có hơn 60 % (G + C) để

đạt đƣợc liên kết với mẫu đủ mạnh. Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở

hai tiêu điểm có sự định hƣớng ngƣợc nhau trong khoảng 2000 nucleotide dọc

theo nhiễm sắc thể. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, càng dễ

10

thực hiện phản ứng RAPD – PCR, ngƣợc lại khi mồi càng dài thì khả năng

bắt cặp càng khó nhƣng tính chính xác thì cao hơn, thông thƣờng sử dụng mồi

có 10 nucleotide. Do mồi sử dụng có 10 nucleotide nên xác suất bắt cặp một

đoạn nucleotide trong genom có 10 gốc bổ trợ vào khoảng 1/410 ≈ 1/106 =

1/1000000. Nhƣ vậy cứ khoảng một triệu gốc nucleotide sẽ có một vị trí gồm

10 nucleotid của khuôn ADN có trình tự bổ sung với mồi ngẫu nhiên.

RAPD tạo ra các đoạn ADN không mang chức năng mã hoá, có kích

thƣớc từ nhỏ hơn 100 bp đến nhiều hơn 2 kb. Sự khác nhau của các đoạn nói

chung là do đột biến ở vị trí gắn mồi làm ngăn trở việc bắt cặp của mồi. ADN

đƣợc nhân lên sau đó đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm

với ethidium bromide và quan sát dƣới đèn tử ngoại (Li, 1999) []. Số liệu thu

đƣợc là sự có mặt hoặc vắng mặt của các đoạn này, chỉ thị RAPD đƣợc xem

nhƣ các yếu tố “trội” trong di truyền Mendel ở một cơ thể lƣỡng bội [1].

 Chỉ thị phân tử AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn cắt nhân bội -

Amplified Fragment Length Polymorphism). AFLP gồm hai nội dung cơ bản:

- Cắt ADN bằng các enzyme giới hạn (Restrition Enzyme) có bổ sung

các adaptor đặc hiệu, tạo thành các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng

cho các mồi đã đƣợc chọn từ trƣớc.

- Nhân đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR với hai loại mồi khác nhau.

 Chỉ thị phân tử STS (Vị trí chuỗi đánh dấu - Sequence Tagged Sites):

Trong nghiên cứu lập bản đồ gen ở ngƣời năm 1989, Olson và cs đã nêu

ra ý tƣởng sử dụng những vị trí đánh dấu trình tự STS, dựa vào một loại locus

đã biết (gen, cDNA, hoặc gen tách dòng) đƣợc nhân lên bởi mồi PCR thiết kế

dựa và trình tự đầu cuối của những locus đặc trƣng này.

Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó

không đòi hỏi sự phân lập nhƣng đòi hỏi trình tự. Mồi có 18 - 20bp đƣợc thiết

kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự sự đa hình

11

nói chung đƣợc xác định nhƣ sự khác nhau về kích thƣớc của sản phẩm PCR

trên gel agarose.

 Chỉ thị phân tử EST (Expressed Sequence Tag): Là một chỉ thị dựa

trên cơ sở PCR với mồi dài 18 – 20 nucleotide đƣợc thiết kế từ những phần

trình tự đã biết trên hệ gene nhƣ các đoạn cADN, nó không đòi hỏi sự phân

lập nhƣng đòi hỏi trình tự và phat hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen

nên thích hợp đối với lập bản đồ. Sự đa hình nói chung đƣợc phát hiện bởi sự

khác nhau về kích thƣớc của sản phẩm PCR. Tuy nhiên, việc thiết kế và

chuẩn hóa mồi có thể đòi hỏi sự đầu tƣ đáng kể.

 Chỉ thị SCAR (Vùng nhân bản chuỗi đƣợc mô tả - Sequence

Characterised Amplified Regions):

Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCAR. Các chỉ thị

này dựa trên việc tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD đƣợc quan tâm, từ

trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thƣờng dùng trong RAPD (24

nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của đoạn RAPD ban đầu.

 Chỉ thị CAPS (Chuỗi đa hình nhân bản đƣợc cắt hạn chế - Cleaved

Amplified Polymorphic Sequences): cũng là một ví dụ của STS, đƣợc tạo ra

bằng cách cắt các sản phẩm PCR với một enzyme hạn chế. Chỉ thị DNA này

vẫn mang những ƣu điểm cơ bản của PCR là chỉ cần một lƣợng nhỏ

nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ kết quả huỳnh quang. Các mồi

PCR dài hơn (15 - 25 nucleotide) dùng cho CAPs có xu hƣớng tạo ra những

sản phẩm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ thuật mồi ngẫu nhiên khác [1].

 Chỉ thị SSR (Các chuỗi lặp lại đơn giản - Simple Sequence Repeat):

SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, hay còn gọi là

phƣơng pháp vi vệ tinh (microsatellite) đƣợc Litt và Luty phát triển thành một

kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989. Microsatellite có chứa các trình tự ADN,

hiện nay đã có những nghiên cứu về vai trò chức năng của chúng trong hệ gen

12

của cây bạch đàn. Chỉ thị microsatellite đóng một vai trò quan trọng trong cây

bạch đàn ở các cấp độ khác nhau của sự cải thiện di truyền. Các chỉ thị

microsatellite có tiềm năng phân tích đƣợc sự liên quan chặt chẽ giữa các cá

thể và ngày càng phát hiện đƣợc nhiều hơn nữa các SSR trên các nhóm liên

kết và các nghiên cứu di truyền khác. Hiện nay, đã phát hiện đƣợc một số

lƣợng lớn các microsatellite có mối liên hệ từ nhóm liên kết (LG) đến vị trí

vật lý (Murugan Sumathi and Ramasamy Yasodha, 2014) [36].

Sự thay đổi các alen xảy ra ở locus SSR là kết quả của sự thay đổi số lần

lặp lại của các đơn vị. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR đƣợc phát hiện bởi

sự nhân đoạn ADN nhờ PCR dùng một cặp mồi oligonucleotide có trình tự bổ

sung với SSR. Kích thƣớc của sản phẩm PCR đƣợc xác định một cách chính

xác bằng điện di trên gel polyacrylamide. Sự khác nhau về độ dài có thể rất

nhỏ (2bp). SSR thích hợp cho lập bản đồ, nghiên cứu QTL và in dấu ADN

(DNA fingerprinting).

SSR cho thấy mức độ đa hình cao ở hầu hết các loài thực vật, thậm chí

trong các kiểu gen có quan hệ gần gũi, với số lƣợng lớn các alen tìm thấy ở

mỗi locus và dị hợp tử đƣợc đánh giá thƣờng lớn hơn 0,7. Di truyền đồng trội

đƣợc quan sát ở các alen này ở nhiều loài khác nhau [31],[39].

Vì SSR đƣợc phân tích nhờ PCR, chỉ đòi hỏi một lƣợng nhỏ ADN mẫu,

phản ứng có thể hoàn thành (từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kiểu gen) chỉ

trong hai ngày. Mỗi mồi có từ 1 đến 12 locus đƣợc tổ hợp trong một phản ứng

PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locus, điều này tiết kiệm

đáng kể thời gian và hoá chất.

Có thể tóm lại một số ƣu điểm của chỉ thị SSR đƣợc các nhà di truyền và

chọn giống thực vật quan tâm là:

- Chúng có tính đa hình rất cao cho phép phân biệt một cách chính xác

các cá thể có quan hệ họ hàng gần;

13

- Là chỉ thị “đồng trội” (có thể phân biệt đƣợc đồng hợp tử AA, hay BB,

hoặc dị hợp tử AB);

- Kỹ thuật đơn giản, tiện lợi;

- Chúng tồn tại rất nhiều và phân bố đều trong bộ gen thực vật;

- Một trong những ƣu điểm đặc biệt là số liệu khi phân tích chỉ thị SSR

có tính lặp lại rất cao và có thể dễ dàng chia sẻ giữa các nhóm nghiên cứu và

phòng thí nghiệm [23]. Chính vì những ƣu điểm trên đây mà chỉ thị SSR đã

ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu chọn giống cây trồng theo hƣớng

chọn lọc các tính trạng có lợi nhƣ chống chịu sâu bệnh, trong các nghiên cứu

phân tích sự đa dạng bộ gen, trong các nghiên cứu lập bản đồ gen [44].

Hạn chế của chỉ thị SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc

xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình, bao gồm việc tách

dòng và đọc trình tự một số lƣợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR [26]..

Mỗi kỹ thuật chỉ thị phân tử đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng.

Đề tài đã nghiên cứu, sử dụng chỉ thị SSR làm công cụ để phân tích đa dạng

di truyền cho 3 loài cây bạch đàn bố mẹ tham gia lai giống.

1.3. Ƣu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử

Các cá thể trong cùng một quần thể của một loài sinh sản hữu tính sẽ có

một mức độ của sự biến đổi di truyền gây ra bởi đột biến, chèn/mất

(INDELS), đảo đoạn, trùng lặp, và đảo vị trí. Biến đổi nhƣ vậy có thể đƣợc

phát hiện và sàng lọc bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử. Chỉ thị phân tử là

locus gen có thể dễ dàng theo dõi và định lƣợng trong một quần thể và có thể

đƣợc liên kết với một gen hoặc đặc điểm đặc biệt quan tâm.

Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể đƣợc xác định tại bất kỳ

giai đoạn nào và ở bất kỳ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể.

Số lƣợng các chỉ thị phân tử là cực lớn, trong khi số lƣợng của các chỉ thị

hình thái là hạn chế.

14

Các alen của chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân

biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chỉ thị hình

thái thƣờng tƣơng tác theo kiểu trội – lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong

nhiều tổ hợp lai.

Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thƣờng làm sai lệch việc

đánh giá các cá thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc

cộng tính rất hiếm gặp.

Sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ chỉ thị phân tử phụ thuộc

vào các yếu tố:

- Bản đồ di truyền với một số lƣợng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các

vùng tƣơng đồng (uniformly-spaced polymorphic markers) để định vị chính

xác QTL hay gen quan tâm.

- Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen hay các QTL. Có 3 kiểu quan

hệ giữa chỉ thị và gen quan tâm:

+ Chỉ thị phân tử đƣợc định vị ngay trong gen đƣợc quan tâm. Đây là

trƣờng hợp lý tƣởng nhất cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS), nhƣng

rất khó tìm thấy loại chỉ thị này.

+ Chỉ thị có mối liên kết không cân bằng (linkage disequilibrium - LD)

với gen đƣợc quan tâm. Đây là nhóm chỉ thị có khuynh hƣớng di truyền cùng

nhau. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần

nhau.

+ Chỉ thị có mối liên kết cân bằng (linkage equilibrium - LE) với gen

đƣợc quan tâm. Đây là trƣờng hợp khó cho việc ứng dụng MAS.

- Mức độ chính xác của MAS phụ thuộc rất lớn vào mối liên kết chặt

giữa gen quan tâm và chỉ thị phân tử. Mặc dù chỉ thị và gen có mối quan hệ

về di truyền, nhƣng mối liên kết này có thể bị phá vỡ do có sự tái tổ hợp giữa

chúng. Mối liên kết giữa chỉ thị phân tử và gen quan tâm đƣợc tính bằng

khoảng cách di truyền, phản ánh tỷ lệ tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị.

15

Vì thế, để có độ tin cậy cao, làm giảm sự tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ

thị chỉ áp dụng MAS với những chỉ thị cách gen quan tâm không quá 5 cM và

với những nhóm chỉ thị nằm cả 2 phía của gen. Theo lý thuyết, với những chỉ

thị cách gen trong khoảng 5cM, độ chính xác thu đƣợc khi sử dụng MAS là

99,75% hoặc có thể cao hơn.

1.4. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng

di truyền và chọn giống cây lâm nghiệp

1.4.1. Trên thế giới

Chỉ thị phân tử có thể đƣợc sử dụng để nghiên cứu các mô hình di

truyền, biến đổi gen, hiện tƣợng tiến hóa và chọn lọc, mối liên kết alen-alen,

và các liên kết giữa alen và kiểu hình. Các ứng dụng của chỉ thị phân tử có

thích hợp hay không phụ thuộc vào tính chất vật lý của nó và vị trí của bộ

gen, các chi phí liên quan, dễ sử dụng, và hiệu suất cần thiết. Chỉ thị phân tử

đã đƣợc áp dụng thành công trong khoa học thực vật theo hƣớng di truyền và

lập bản đồ vật lý của bộ gen, xác định các gen kiểm soát quá trình khác nhau

và kiểu hình, đa dạng di truyền và phân tích tiến hóa, trợ giúp cho cải thiện

giống cây trồng [20].

Trƣớc đây, vị trí của một chỉ thị gen thƣờng không rõ và không cần thiết

cho mục đích của sự đa dạng và phân tích và ứng dụng giống tiến hóa. Với

những tiến bộ trong công nghệ gen, sử dụng chỉ thị phân tử khi biết vị trí gen

và điều kiện môi trƣờng đang trở nên phổ biến hơn và đƣợc áp dụng ngày

càng phổ biến với phạm vi mục tiêu ngày càng đa dạng.

Chỉ thị phân tử cung cấp các ứng dụng phong phú trong nghiên cứu di

truyền phân tử và chọn giống. Mặc dù ngày nay khả năng tiếp cận và cải tiến

các công nghệ gen ngày càng phát triển, nhƣng chỉ thị phân tử vẫn là thành

phần thiết yếu của tất cả các phân tích di truyền quy mô lớn, không chỉ bằng

việc lắp ráp bộ gen mà còn chứng minh đƣợc giá trị của chúng trong kiểu gen,

16

so sánh và tiến hóa gen, lập bản đồ tính trạng, chọn giống. Chỉ thị phân tử đó

có khả năng tiếp tục đƣợc phát triển và áp dụng thành công đối với tiến bộ

gen thực vật trong nhiều năm tới [20].

Chỉ thị phân tử thƣờng đƣợc phân thành chỉ thị dựa trên cơ sở phép lai

ADN và các chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng PCR. Chỉ thị phân tử đƣợc sử

dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lập bản đồ gen phục vụ cho chọn tạo

giống cây trồng ở nhiều đối tƣợng khác nhau. Tính ƣu việt của các chỉ thị

phân tử không những ở tiềm năng nghiên cứu về đa dạng di truyền giữa các

giống trong cùng một loài mà còn theo dõi đƣợc sự di truyền bền vững và ổn

định của những chỉ thị này trong các thế hệ sau. Sự xuất hiện của các chỉ thị

còn cho phép dự đoán khả năng di truyền của những tính trạng quan trọng liên

kết với nhau trên cùng một nhiễm sắc thể. Khác với các tính trạng về hình

thái, sinh lý dễ bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng, các chỉ thị phân tử không bị biến

đổi dƣới tác động ngoại cảnh, có mặt trong tất cả các giai đoạn sinh trƣởng

của cây.

Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây rừng đã đƣợc thực hiện tại

nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nƣớc có nền lâm nghiệp phát triển

mạnh và mang tính hàng hóa cao nhƣ Thụy Điển, Braxin, Úc, Trung Quốc...

Việc chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử là công cụ tiềm năng giúp

tăng cƣờng hiệu quả công tác chọn tạo giống.

Khoa Tế bào sinh học của trƣờng Đại học Brasilia (Braxin) đã nghiên

cứu phát triển lập bản đồ gen liên kết sử dụng chỉ thị SSR cho Bạch đàn

grandis và Bạch đàn urô. Nghiên cứu này xây dựng một số lƣợng lớn các chỉ

thị SSR có thể sử dụng đƣợc đối với các loài bạch đàn, các chỉ thị SSR này

chứa đựng rất nhiều thông tin hữu ích cho việc thiết lập bản đồ và xác định

các đặc điểm cá thể và đã chứng minh đƣợc khả năng xây dựng một bản đồ

liên kết dựa vào các chỉ thị SSR một cách hoàn thiện. Họ đã xây dựng đƣợc

17

một bộ bao gồm 70 chỉ thị SSR ký hiệu từ EMBRA1 đến EMBRA70 với tính

đa hình cao khi sử dụng cho Bạch đàn grandis và Bạch đàn urô [23], [24].

Tại trƣờng Đại học Tasmania - Úc, Bundock và cs (2000) cũng đã

nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD và SSR để lập bản đồ liên kết của

cho cây Bạch đàn globulus. Trong nghiên cứu này nhóm tác giả đã sử dụng

các chỉ thị SSR phát triển cho loài Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis để lập

bản đồ liên kết cho cây Bạch đàn globulus. Các chỉ thị SSR đƣợc sử dụng nhƣ

EMBRA17, EMBRA18, EMBRA5, EMBRA12, EMBRA16, EMCRC7,

EMCRC6, CSIRO03, CSIRO10, CSIRO13 ... Kết quả nghiên cứu đã lập đƣợc

các bản đồ sử dụng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR cho cả nhóm cây bố và cây

mẹ. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các chỉ thị SSR phát triển cho các

loài bạch đàn có quan hệ gẫn gũi với nhau nhƣ các loài bạch đàn trên đều có

thể sử dụng để lập bản đồ liên kết [27].

Năm 2002, tại Mỹ, Agrama và cs công bố đã lập bản đồ gen liên kết cho

Bạch đàn caman, nhóm tác giả đã sử dụng các dữ liệu phân ly từ 92 cây con

Bạch đàn trắng có quan hệ gần gũi với nhau, kỹ thuật để xây dựng bản đồ gen

liên kết dựa vào các chỉ thị phân tử RAPD, RFLP và SSR. Các dữ liệu đƣợc

phân tích mối liên kết sử dụng phần mềm lập bản đồ gen JOINMAP. Phân

tích mối liên kết đã xác định đƣợc 168 chỉ thị phân tử bao phủ bộ gen của

Bạch đàn caman với độ dài 1.236 cM. Số lƣợng các nhóm liên kết đƣợc xác

định tƣơng đƣơng với số lƣợng chromosomes (n=11) của loài bạch đàn. Bản

đồ gen này đƣợc sử dụng để xác định các vùng hay các đoạn gen của loài

Bạch đàn caman liên quan đến một số tính trạng quan trọng nhƣ xác định chất

lƣợng gỗ, tinh dầu. Trong số 18 chỉ thị SSR sử dụng để nghiên cứu phân tích

đã có tới 14 chỉ thị là EMBRA1, EMBRA2, EMBRA3, EMBRA5, EMBRA8,

EMBRA9, EMBRA10, EMBRA11, EMBRA14, EMBRA15, EMBRA16,

EMBRA17, EMBRA19 và EMBRA20 đƣợc dùng để lập bản đồ gen liên kết.

18

Với 14 chỉ thị SSR này mang lại thông tin rất có ý nghĩa trên bản đồ gen của

bạch đàn Bạch đàn caman [17].

Trƣờng Đại học Tasmania của Úc cũng đã sử dụng 12 cặp mồi có kí hiệu

EMCRC dùng để nhân bản các chỉ thị SSR ở cây bạch đàn [41]. Ngoài ra còn

khoảng 30 cặp mồi mang các đoạn lặp lại (CA)n và (CAG)n cũng đƣợc tạo ra

bằng việc sử dụng thƣ viện bộ gen (Ottewell và cs, 2005) [37]. Mặc dù số

lƣợng các đoạn mồi dùng cho việc phân tích chỉ thị SSR rất đa dạng, tuy

nhiên cho đến nay, hệ thống mồi EMBRA đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong

các nghiên cứu chọn dòng, thiết lập bản đồ di truyền liên kết cho các cặp lai

và phân tích các locus tính trạng số lƣợng (QTL) có lợi [34]. Có thể thấy rằng

việc kết hợp giữa chỉ thị SSR và thông tin về trình tự nucleotide đã làm cho

phƣơng pháp sử dụng SSR trở thành công cụ khá hiệu quả, nhanh chóng và

chính xác trong công tác chọn giống cây trồng.

Tiếp theo, vào năm 2006, Brondani và cs đã mô tả sự phát triển của một

bộ mới bao gồm 230 chỉ thị SSR, ký hiệu EMBRA 71 - EMBRA395 cho bạch

đàn. Từ 380 chỉ thị ban đầu đƣợc nghiên cứu đánh giá, có 230 chỉ thị có tính

đa hình cao, có thể dễ dàng dùng để giải thích cho các kiểu gen, các kiểu gen

này có thể sử dụng để đánh dấu các cá thể độc lập và lập bản đồ gen liên kết.

Trong số các chỉ thị SSR này, đã có 48 chỉ thị phát triển riêng cho Bạch đàn

globulus (đặt tên là EMCRC), 8 chỉ thị phát triển cho Bạch đàn niten (ký hiệu

EMEn), 8 chỉ thị cho Bạch đàn sieberi (ký hiệu EMEs), 13 chỉ thị cho Bạch

đàn leucoxyon (ký hiệu EMEl). Và gần đây đã có thêm 35 chỉ thị SSR đƣợc

phát triển dựa vào chuỗi ADN lục lạp (cp-ADN) của Bạch đàn globulus [25].

Bundock và cs (2008) nghiên cứu về ứng dụng chỉ thị RAPD và SSR cho

sinh trƣởng về đƣờng kính của Bạch đàn globulus, đã xác định đƣợc 3 QTL

có mức đóng góp biến dị kiểu hình là 7,8 -17,9%. Tuy nhiên chọn lọc theo

phƣơng pháp này cho thấy mức đóng góp cho biến dị kiểu hình không vƣợt

19

quá 20%, hơn thế nữa nó cũng có những hạn chế nhất định nhƣ QTL xác định

ở quần thể này khó áp dụng cho các quần thể khác vì nền tảng di truyền của

các quần thể khác nhau cũng nhƣ điều kiện môi trƣờng khác nhau [28].

Thumma và cs (2010) đã phát hiện 36 QTL liên kết với một số tính trạng

chất lƣợng gỗ ở Bạch đàn niten và kết luận rằng nghiên cứu QTL là những

cách tiếp cận hữu ích để khám phá sự kiểm soát di truyền của các tính trạng di

truyền thấp và có thể làm sáng tỏ về sự kiểm soát phân tử của kiểu hình chƣa

đƣợc hiểu rõ nhƣ tăng trƣởng cây [19].

Freeman và cs (2013) nghiên cứu về tính ổn định của các locus của tính

trạng số lƣợng cho sự tăng trƣởng và thuộc tính gỗ trên nhiều phả hệ và môi

trƣờng tƣơng phản trong loài Bạch đàn globulus đã chỉ ra đƣợc vị trí của QTL

cho các thuộc tính và sự tăng trƣởng của gỗ. Nghiên cứu này đã xây dựng

đƣợc bản đồ liên kết bão hòa bằng cách sử dụng 663 kiểu gen từ bốn gia đình

riêng biệt, đƣợc trồng tại ba địa điểm cách xa nhau, và đã đƣợc sử dụng để

xây dựng một bản đồ sự đồng thuận. Bản đồ này đã đƣợc sử dụng để phân

tích QTL của các tính trạng tăng trƣởng, tỷ trọng gỗ và đặc tính hóa học gỗ,

bao gồm cả sản lƣợng bột giấy. 98 QTL đã đƣợc xác định qua các gia đình và

các địa điểm: trong đó có 87 QTL cho các thuộc tính gỗ và 11 QTL cho tăng

trƣởng. Những QTL ánh xạ tới 38 khu vực riêng biệt, một số trong đó có

đồng vị trí với gen mục tiêu. Mặc dù 16% các QTL đã đƣợc xác nhận trong

các họ khác nhau, nhƣng có tới 24% QTL cho tính chất gỗ và 38% QTL cho

tăng trƣởng đƣợc biểu hiện nhờ sự tƣơng tác môi trƣờng. Nghiên cứu này đã

đánh giá về tác động của môi trƣờng đến sự phát hiện QTL của các phả hệ,

mặc dù môi trƣờng của mỗi phả hệ khác nhau rõ rệt, nhƣng có nhiều QTL ổn

định, kết quả này đã mang đến nhiều hứa hẹn cho chọn giống nhờ sự trợ giúp

của chỉ thị phân tử.

20

1.4.2. Tại Việt Nam

Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn giống cây lâm

nghiệp còn hạn chế. Đề tài “Chọn giống và nhân giống cho một số loài cây

trồng rừng chủ yếu” giai đoạn 1996-2000 do GS. TS Lê Đình Khả làm chủ

nhiệm đề tài đã kết hợp với Tổ chức khoa học và công nghệ Úc (CSIRO) ứng

dụng chỉ thị di truyền để nhận biết các dòng Keo lá tràm, đề tài sử dụng 3

microsatellite là Am030, Am136 và Am770 để xác định quan hệ di truyền

giữa các dòng Keo lá tràm, tác giả kết luận dòng Aa81 và Aa85 đều có alen

giống nhau, còn 6 dòng Aa18, Aa25, Aa28, Aa30, Aa32, Aa35 đƣợc chọn

trong số 40 dòng tham gia khảo nghiệm ở Cẩm Quỳ là khác nhau và khác các

dòng Aa81, Aa82, Aa83, Aa84 và Aa85 [7].

Nguyễn Hoàng Nghĩa và cs (2005) sử dụng chỉ thị RADP và ADN lục

lạp để đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh. Kết quả nghiên

cứu ở đây chỉ ra sự khác biệt rất rõ rệt đối với ba xuất xứ Lim xanh ở Cầu

Hai, Nghệ An và Quảng Ninh [10].

Nguyễn Việt Cƣờng và cs (2007) đã ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và

ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Keo tai

tƣợng đƣợc tuyển chọn tại 5 lâm trƣờng tại Tuyên Quang (trong đó có 34 cây

trội và 6 dòng là các xuất xứ Ingham, Mossman, Carwell, Wipim, Pongaki,

Iron Range). Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của

hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC10, OPC18, OPC19, OPC20 và OPB17 và 1

gen lục lạp trnL. Kết quả cho thấy 40 dòng Keo tai tƣợng nghiên cứu có mức

độ đa dạng di truyền thấp. Xuất xứ Carwell (C1) có quan hệ di truyền xa hơn

cả đối với các xuất xứ khác và các dòng Keo tai tƣợng khác. Xuất xứ Carwell

(C1) có thể nhận biết bằng sự vắng mặt phân đoạn 700bp sau khi cắt sản

phẩm PCR với mồi trnL bằng enzym TaqI. Từ kết quả nghiên cứu về đa dạng

di truyền của các cây trội, có thể ứng dụng để lựa chọn và bố trí các cặp bố

21

mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vƣờn giống, nhằm giảm thiểu

thụ phấn cận huyết [4].

Ứng dụng của chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu

đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận có tên địa

phƣơng là cây Cóc hành (Azadirachta excelsa) đƣợc tuyển chọn trong rừng

khộp tự nhiên khô hạn ở 6 xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh

Ninh Thuận. Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của

hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13

và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL. Kết quả cho thấy 40 dòng

cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) có mức độ đa dạng

di truyền thấp, mặc dù các cây trội đƣợc chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có

khoảng cách về không gian khá xa. Từ bảng hệ số tƣơng đồng của các dòng

cây trội, có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây

dựng vƣờn giống nhằm nâng cao khả năng tổ hợp chung của các cây trong

vƣờn giống khi giao phối với nhau. Các dòng có quan hệ di truyền quá gần

gũi cần phải loại bỏ là X11, X22, X35, X37, X43, X50, nhƣ vậy 34 dòng còn

lại vẫn đáp ứng đƣợc tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -

2006 về xây dựng vƣờn giống [3].

Đề tài “Nghiên cứu lai giống một số loài bạch đàn, tràm, keo và thông”

giai đoạn 2006-2010 do TS. Nguyễn Việt Cƣờng làm chủ nhiệm đề tài đã ứng

dụng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp để nghiên cứu quan hệ di truyền

của một số xuất xứ Tràm ta (M. cajuputi). Đề tài đã nghiên cứu genom và gen

lục lạp của 12 mẫu cây Tràm ta ở 12 vùng khác nhau của Việt Nam bằng các

chỉ thị RAPD và lục lạp. Nghiên cứu các mẫu trên với các chỉ thị RAPD đã

phát hiện đƣợc 100 băng đa hình. Đối với các gen lục lạp đã thu đƣợc 59 băng

đa hình và đi đến kết luận: Các xuất xứ Tràm ở Việt Nam rất đa dạng về mặt

di truyền. Các xuất xứ Tràm ở miền Bắc (Thái Nguyên, Đại Lải – Vĩnh Phúc)

có độ khác biệt về di truyền lớn so với các xuất xứ Tràm ở miền Trung và miền

22

Nam. Các xuất xứ Quảng Trị vùng đồi và Quảng Trị vùng cát, Đồng Hới và

Huế, Đà Lạt và Vũng Tàu có thể là các cặp xuất xứ có cùng nguồn gốc. Cũng

trong đề tài này một nghiên cứu khác là bƣớc đầu ứng dụng chỉ thị phân tử

RAPD trong đánh giá sinh trƣởng của các giống bạch đàn lai, vật liệu nghiên

cứu là 5 dòng bạch đàn trong đó có 4 dòng đƣợc đánh là sinh trƣởng nhanh

sau khảo nghiệm hậu thế (các dòng này đều đƣợc công nhận giống tiến bộ kỹ

thuật PN2, PN14, U6 và công nhận giống quốc gia UE24) và 1 dòng UE4

luôn luôn có sinh trƣởng tƣơng đối thấp từ năm thứ nhất đến năm thứ 6. Mục

tiêu nghiên cứu là tìm ra một số chỉ thị phân tử có liên quan đến tính trạng

sinh trƣởng nhanh và sinh trƣởng chậm. Qua nghiên cứu, đề tài đã tìm ra

đƣợc 2 chỉ thị là OPC9 và OPB8 cho những phân đoạn có sự khác biệt giữa

các dòng sinh trƣởng nhanh và chậm. Với mồi OPB8 các mẫu cây bạch đàn

sinh trƣởng nhanh (UE24, U6, PN2, PN14) đều cho 7 băng, trong khi cây sinh

trƣởng chậm (UE4) chỉ cho 1 băng (500bp). Tƣơng tự với mồi OPC9 ở các

cây sinh trƣởng nhanh đều cho 2 băng (1.300bp và 1.400bp), nhƣng ở cây

sinh trƣởng chậm chỉ cho 1 băng (1.300bp) [5].

Nghiên cứu của Nguyễn Minh Thanh và cs (2010) về đánh giá sự khác

biệt giữa các xuất xứ Mây nếp bằng chỉ thị phân tử cho thấy mức độ đa dạng

di truyền của loài Mây nếp là thấp. Cũng trong nghiên cứu này tác giả còn sử

dụng chỉ thị phân tử để xác định nhanh giới tính (tỉ lệ đực cái trong Mây nếp).

Việc xác định nhanh và sớm giới tính của Mây nếp cho phép nhà sản xuất chủ

động lựa chọn cây giống đực hay cái phù hợp với mục tiêu kinh doanh của

mình cũng nhƣ cho phép chủ động đƣợc phƣơng pháp lai tạo khi xây dựng

vƣờn giống [13].

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo

lá tràm cho vùng Nam bộ” do TS. Vƣơng Đình Tuấn làm chủ nhiệm đề tài

giai đoạn 2005-2009. Đây có thể nói là đề tài đầu tiên đã tổng kết về ứng

dụng chỉ thị phân tử (RAPD và SSR) trong chọn giống cây rừng nói chung và

23

Keo lá tràm nói riêng. Tuy nhiên, đề tài lại không đạt đƣợc mục tiêu đạt ra là

chọn đƣợc chỉ thị phân tử có liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của

các cá thể Keo lá tràm vùng Đông Nam bộ. Đề tài đã sử dụng 33 mồi SSR của

Keo tai tƣợng và 12 mồi RAPD cũng nhƣ 5 mồi liên quan đến sinh trƣởng

nhanh là C1, C2, R3 và sinh trƣởng chậm là P1 và OS1. Nghiên cứu bằng 33

chỉ thị SSR cho 100 cá thể Keo lá tràm cho thấy chƣa có chỉ thị SSR nào liên

kết chặt chẽ với nhóm sinh trƣởng theo mong đợi, và 5 cặp mồi liên quan đến

sinh trƣởng cũng không tìm thấy mồi nào có liên quan đến tính trạng sinh

trƣởng trong quần thể nghiên cứu [16].

Đề tài “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong

chọn giống Bạch đàn urô” giai đoạn 2006-2010 do TS. Trần Hồ Quang làm

chủ nhiệm đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: Đã xác định đƣợc mối tƣơng

quan giữa chỉ thị phân tử và các tính trạng chọn giống với chỉ thị SSR là

EMBRA57 có tƣơng quan thấp với đƣờng kính ngang ngực. Cũng trong

nghiên cứu này, tác giả chỉ ra đƣợc các chỉ thị SNP có liên quan đến tính

trạng chất lƣợng (hàm lƣợng lignin), xác định đƣợc các chỉ thị SNP khác biệt

giữa nhóm cây có hàm lƣợng lignin cao và thấp (6 SNP khác biệt cho gen

CCR và 4 SNP khác biệt cho gen CAD2) [12].

Năm 2009-2012, đề tài nghiên cứu của Trần Thanh Trăng về “Chọn

giống Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá

(Cryptosporiopsis eucalypti) bằng chỉ thị phân tử” cũng đã thu đƣợc một số

kết quả nhất định, tuy nhiên vấn đề chọn giống kháng bệnh tác giả chƣa làm

rõ đƣợc các tính trạng nghiên cứu có khả năng di truyền đƣợc cho thế hệ sau

hay không. Đây cũng là hạn chế của đề tài [15].

Nhƣ vậy, các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã đem đến sự tiến bộ ở tất cả các

lĩnh vực của sinh học hiện đại, đặc biệt là trong các nghiên cứu về chọn giống

cây rừng và bảo tồn nguồn gen. Chỉ thị phân tử là phƣơng tiện hữu hiệu trợ

24

giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà

công tác chọn giống truyền thống khó giải quyết. Bằng việc đánh giá cấu trúc

di truyền quần thể và mức độ tự thụ phấn, mức độ giao phấn chéo… đã giúp

cho công tác cải thiện giống cây rừng có hiệu quả hơn. Các kết quả nghiên

cứu về di truyền phân tử là cơ sở cần thiết để các nhà chọn giống truyền thống

đề ra những bƣớc đi thích hợp trong công tác cải thiện giống cây rừng. Trong

công tác bảo tồn gen cây rừng, việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền và mối

quan hệ di truyền của các loài cây bản địa quý hiếm và có giá trị kinh tế sẽ

góp phần vào việc định hƣớng những chiến lƣợc bảo tồn và phát triển bền

vững loài.

Tại Việt Nam, ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây lâm nghiệp

là một lĩnh vực mới đƣợc áp dụng và đã đạt đƣơc một số kết quả khích lệ.

25

CHƢƠNG 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu

- Xác định đƣợc quan hệ di truyền giữa ba loài cây bạch đàn bố mẹ đã chọn

- Xác định đƣợc các cặp bố mẹ lai có sinh trƣởng triển vọng

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Phân tích đa dạng di truyền của các cây bố mẹ đã chọn bằng chỉ thị SSR

- Xây dựng các tổ hợp lai

- Đánh giá sinh trƣởng một số tổ hợp lai tại mô hình trồng khảo nghiệm

ở Trƣờng Sơn – Lƣơng Sơn - Hòa Bình

2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.3.1. Đối tượng

Đối tƣợng nghiên cứu là 19 cây bố mẹ của 3 loài bạch đàn (Bạch đàn urô

- E. urophylla, Bạch đàn caman - E. camaldulensis, Bạch đàn liễu - E. exserta)

với các tính trạng đối lập về sinh trƣởng (nhanh – chậm). Tiêu chí xác định

sinh trƣởng nhanh và chậm theo Tiêu chuẩn ngành 04 TCN 147 – 2006, cụ

thể cây trội đƣợc chọn ở rừng trồng phải đồng tuổi ở giai đoạn thành thành

thục công nghệ hoặc gần thành thục công nghệ, có sinh trƣởng trung bình trở

lên, có độ vƣợt so trị số trung bình của đám rừng (30-40 cây chung quanh) ít

nhất 1,2Sx (độ lệch chuẩn) về đƣờng kính và chiều cao, hoặc 25% về đƣờng

kính và 10% về chiều cao.

Cây sinh trƣởng chậm đƣợc chọn là những cây sinh trƣởng kém trong

quần thể thuần loài và đồng tuổi cùng hiện trƣờng chọn cây trội, nhƣng có khả

năng ra hoa, kết quả.

26

Bảng 2.1. Danh mục các cây bạch đàn bố mẹ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

Nhận

Độ vƣợt

Hvn

Độ vƣợt

D1.3

TT Tên cây đƣợc lựa chọn Địa điểm

xét sinh

(cm)

(%)

(m)

(%)

trƣởng

Bắc Giang

40,6

36,7

27,5

25,0 Nhanh

1 E.urophylla 1 (U1)

Bắc Giang

41,1

38,4

27,0

22,7 Nhanh

2 E.urophylla 2 (U2)

Phú Thọ

39,8

48,5

25,0

19,0 Nhanh

3 E. urophylla 3 (U3)

Bắc Giang

17,9

-39,7

18,5

-15,9

Chậm

4 E. urophylla 4 (U4)

Bắc Giang

17,2

-42,1

18,0

-18,2

Chậm

5 E. urophylla 5 (U5)

Phú Thọ

17,5

-34,7

17,5

-16,7

Chậm

6 E. urophylla 8 (U8)

Hà Nội

38,7

35,3

26,5

22,3 Nhanh

7 E. urophylla 29 (U29)

42,2

24,0

20,0 Nhanh

36,7

8 E. camaldulensis 1 (C1) Bắc Giang

40,2

25,0

28,2 Nhanh

34,2

9 E. camaldulensis 3 (C3) Vĩnh Phúc

14,8

-39,3

17,0

-12,8

Chậm

10 E. camaldulensis 4 (C4) Vĩnh Phúc

15,7

-39,1

17,0

-15,0

Chậm

11 E. camaldulensis 5 (C5) Bắc Giang

31,1

27,5

24,0

23,1 Nhanh

12 E. camaldulensis 7 (C7) Vĩnh Phúc

16,6

-32,0

17,5

-10,3

Chậm

13 E. camaldulensis 13 (C13) Vĩnh Phúc

40,3

38,7

25,5

27,3 Nhanh

14 E. exserta 1 BV (E1BV)

Ba Vì - Hà Nội

Vĩnh Phúc

24,1

31,7

19,5

14,7 Nhanh

15 E. exserta 1 (E1)

Vĩnh Phúc

11,4

-37,7

13,0

-23,5

Chậm

16 E. exserta 2 (E2)

Vĩnh Phúc

24,9

36,1

20,5

17,6 Nhanh

17 E. exserta 5 (E5)

Vĩnh Phúc

13,6

-25,7

14,0

-17,6

Chậm

18 E. exserta 6 (E6)

Vĩnh Phúc

25,1

37,2

21,0

20,6 Nhanh

19 E. exserta 7 (E7)

27

Hình 2.1. Cây bố mẹ U4 (D1.3=17,9 cm) Hình 2.2. Cây bố mẹ U3 (D1.3=39,8cm)

(U4 - sinh trƣởng chậm)

(U3 – sinh trƣởng nhanh)

2.3.2. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

- Nghiên cứu này sử dụng 34 cặp mồi đƣợc tổng hợp sƣu tập từ các bài

báo có liên quan và một số cặp mồi đƣợc chọn từ dữ liệu các cặp mồi

EMBRA trên Gen Bank (Phụ lục 1).

2.3.3. Địa điểm nghiên cứu

- Các nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành tại

Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp

- Khảo nghiệm các tổ hợp lai tại Trƣờng Sơn – Hòa Bình

2.3.4. Hóa chất

- Hóa chất tách chiết ADN tổng số: đệm CTAB 4% (Thành phần đệm

CTAB 4% (100ml): 10ml 1M Tris pH 8: 28ml 5M NaCl, 4ml 0,5M EDTA

pH8, 2g CTAB, 1ml 14M BME, 67ml dH2O), isopropanol, cồn tuyệt đối, cồn

70%, Chloroform:Isoamin alcohol (24:1), Rnase, nƣớc dezion, nƣớc cất, nito

lỏng và một số hóa chất khác.

- Hóa chất chạy điện di ADN trên gel agarose: dung dịch đệm TAE 50X ,

dung dịch đệm TAE 1X, Agarose 1% ; Ethidium bromide (EtBr) 0,5µg/ml.

28

Đệm kiểm tra mẫu ADN (Loading buffer: Bromophenol Blue, Xylene Cyanol

FF, glycerol)

- Hóa chất chạy PCR: Taq Polymerase, Buffer, dNTPs.

- Các hóa chất chạy điện di trên gel Polyacrylamide 4,5%: Gel 4,5%

acrylamide, TEMED, APS 10%, 10XTBE, đệm load mẫu loading dye SSR,

AgNO3, Sodiumcarbonat, Sodium Thiosulfat, Formaldehyde, Formamide,

Thang chuẩn Ladder ADN 100.

2.3.5. Thiết bị

Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di gel agarose

Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, BioRad,

Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy điện di,

máy Vortex, máy khuấy từ, máy ly tâm, máy ổn nhiệt... và các trang thiết bị

khác.

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Các phương pháp sử dụng trong phòng thí nghiệm

* Phương pháp thu và bảo quản mẫu lá

Mẫu lá sử dụng cho nghiên cứu là lá bánh tẻ, không già và không quá

non. Lá sau khi thu đƣợc bỏ vào túi giấy và bảo quản trong thùng mát suốt

quá trình vận chuyển để tránh trƣờng hợp lá bị hấp hơi và bị ủng, héo. Sau đó đƣợc rửa sạch, lau khô, gói trong túi giấy và bảo quản ở nhiệt độ lạnh -20oC đến -84oC, hoặc bảo quản khô bằng silicagel ở nhiệt độ môi trƣờng trong túi

nilon để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

29

A- Mẫu lá tươi trước khi

B- Mẫu lá bảo quản khô

bảo quản (bên trái) và

bằng silicagel ở nhiệt độ

C- Mẫu lá tươi bảo quản ở -20oC; mẫu lá

mẫu lá bảo quản khô

môi trường trong túi

non (bên trái), mẫu lá

(bên phải)

nilon.

bánh tẻ (bên phải)

Hình 2.3. Mẫu lá bảo quản

* Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá

ADN tổng số của bạch đàn đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp CTAB có

cải tiến bao gồm các bƣớc sau:

- Cân 200mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột

mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml.

- Thêm 0,9 ml đệm tách (CTAB 4%), trộn đều, ủ ở 650C trong 60 phút,

15 phút lắc ống 1 lần.

- Thêm 0,8ml C:I (24:1), đảo đều trong 10 phút.

- Ly tâm 12.000rpm trong 15 phút

- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,6ml C:I (24:1), đảo đều trong 10

phút, ly tâm 12.000rpm trong 15 phút

- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,8ml isopropanol lạnh, ủ ở -200C

trong 2h

- Ly tâm 12.000rpm trong 15 phút. Thu tủa

- Thêm 0,6ml ethanol 70% lạnh, ly tâm 8000rpm trong 6 phút.

- Làm khô tủa, hòa tan trong đệm TE

30

- Đo độ sạch của ADN bằng phƣơng pháp quang phổ kế

- Bảo quản ADN tổng số trong -200C để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.

* Phương pháp đo nồng độ bằng quang phổ kế

Sau khi tách chiết sẽ đƣợc đo nồng độ trên máy đo quang phổ UV-1601

(UV-Visible Spectrophotometer, Shimadzu).

Nguyên lý:

- Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm của các base

purine và pyrimidine, ngƣời ta sẽ đo đƣợc giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng

260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu và cho phép xác định

nồng độ trong mẫu dựa vào tƣơng quan sau: một đơn vị OD260nm tƣơng ứng

với một nồng độ là 50ng/µl cho một dung dịch sợi đôi. Do đó nồng độ trong

mẫu đƣợc tính theo công thức sau:

50

Độ pha loãng

C (ng/µl) = OD260nm

- Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở bƣớc

sóng 280nm (OD280nm). Ở bƣớc sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao

nhất, nhƣng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm nhƣ các

axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một

dung dịch axit nucleic đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số

OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.

Các bƣớc tiến hành:

- Lấy 1ml dung môi hòa tan (TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng)

cho vào cuvette đo làm đối chứng.

- Cho 5µl dung dịch cần đo nồng độ vào 995µl dung môi hòa tan (pha

loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bƣớc sóng 260nm và

280nm.

- Từ kết quả đo, tính nồng độ theo công thức trên

31

- Dựa vào nồng độ để pha loãng ra nồng độ 25ng/µl bằng nƣớc cất 3 lần

để chuẩn bị chạy PCR với các mồi RAPD theo công thức:

N1 × V1 = N2 × V2

Trong đó: N1: Nồng độ ban đầu

N2: Nồng độ cần pha

V1: Thể tích cần lấy để pha

V2: Thể tích cần pha

- In kết quả đo đƣợc.

* Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Pha

-

0,2ml

-

.

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích (µl)

ADN

3

1

2,5

dNTPs (10 mM) Buffer dream Taq Mồi xuôi (10 pmol/µl)

1

Mồi ngƣợc (10 pmol/µl)

1

0,2

11,3

Taq ADN polymerase (5 u/µl) dH2O Tổng thể tích phản ứng

20

32

35 chu kỳ

72oC

72oC

94oC 3 phút

94oC 1 phút

10 phút

1 phút

50-60oC

1 phút

40C ∞

Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR

* Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

Các bƣớc tiến hành:

- Cân 0,8g agarose, đong 100ml TAE 1X cho vào bình Duran.

- Đun trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn tạo thành một dung

dịch đồng nhất.

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5 l ethidium bromide

(10mg/ml) và lắc đều.

- Chuẩn bị khay và lƣợc. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho

không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.

- Đặt khay gel vào bể điện di, rút lƣợc. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel.

- Tra sản phẩm PCR đã đƣợc trộn với Loading Dye Buffer vào giếng

(tỷ lệ 5 ADN:1Dye). Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn

phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với

ladder 100bp.

- Soi gel trên máy soi cực tím và chụp ảnh bản gel.

* Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5%

Chuẩn bị kính:

- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần

bằng ethanol 70%, để khô sau mỗi lần lau.

33

- Lau tấm kính ngắn với giấy lụa tẩm dung dịch chống bám dính Rain-X.

Để 5 phút cho khô dung dịch.

Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính dài.

- Lau tấm kính dài với dung dịch dính đƣợc tạo thành bằng cách thêm

2,5 l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.

- Để cho tấm kính khô.

- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.

Chuẩn bị gel polyacrylamide:

- Đổ 60ml dung dịch gel 4,5% acrylamide vào 1 cốc đong 100ml. Thêm

180 l 10% APS (ammonium persulfate) và 60 l TEMED (N,N,N’,N’-

Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.

- Đổ từ từ dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.

- Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng

kẹp cố định lƣợc.

- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.

Điện di:

- Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính.

- Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 0,5X vào buồng đệm trên và dƣới.

- Rút lƣợc, dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trong giữa 2 tấm kính.

- Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện là 50 - 60A, công

suất 92 - 100W cho bản gel nóng lên 500C thì load mẫu.

- Trộn sản phẩm PCR với 5 l Loading dye SSR. Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 10 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên

trên ít nhất 5 phút.

34

- Tra vào mỗi giếng 5 l sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu

chạy với ladder 100 bp.

Thời gian tra mẫu không quá dài để tránh bản gel bị nguội.

- Tiến hành điện di với công suất 60W, thời gian chạy ngắn hay dài tùy

kích thƣớc từng mồi sử dụng.

Nhuộm bạc:

+ Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml

glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.

- Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan

1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml

formaldehyd (H2CO) 37%.

- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat

(Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở 40C.

Chú ý. (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 400 l

natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).

+ Tiến hành nhuộm

Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bƣớc sau:

- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên

trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và lắc nhẹ trong khoảng 30 phút.

Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý: Giữ lại dung dịch này để dùng cho

bƣớc sau.

- Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần, mỗi lần 3 phút. Cho gel vào dung dịch

nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào

35

dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa nhanh bằng nƣớc cất trong 5

- 10 giây.

- Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho

gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel

bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.

2.4.2. Các phương pháp ngoài hiện trường

* Nghiên cứu thời kỳ ra hoa

Nghiên cứu thời kỳ ra hoa theo phƣơng pháp quan sát trực tiếp, các cây

đƣợc quan sát có đánh số và đeo nhãn cho các cành để theo dõi quá trình hình

thành nụ, nở hoa và kết quả.

Các hiện tƣợng cần quan sát ghi lại:

- Thời kỳ bắt đầu xuất hiện nụ.

- Thời kỳ bắt đầu nở hoa.

- Thời kỳ hoa nở rộ.

- Thời kỳ kết thúc nở hoa.

* Phương pháp lai giống

Lai giống (thụ phấn có kiểm soát) theo phƣơng pháp của Moncur (1995),

phép lai đƣợc tiến hành cho từng cặp cây bố mẹ riêng biệt, nhằm xác định khả

năng lai giống và ƣu thế lai cho từng cặp lai cụ thể.

Các bƣớc tiến hành:

- Chọn lọc những cành có hoa và cắt bỏ các nụ hoa còn non hoặc hoa đã

nở, chỉ để lại những nụ hoa đã chuyển từ màu xanh sang vàng nhạt.

- Khử đực bằng cách cắt bỏ toàn bộ chỉ nhị và bao phấn.

- Sau khi khử đực xong, chụp bao ngay để tránh nhiễm phấn lạ.

- Tiến hành thụ phấn sau 3-4 ngày khử đực, kết thúc thụ phấn vẫn chụp

bao cách ly cho tới khi vòi nhụy không còn khả năng tiếp nhận hạt phấn nữa,

36

tiến hành đeo nhãn cho cành có hoa đã thụ phấn và ghi lại những thông tin

cần thiết.

Túi thụ phấn đƣợc làm từ vật liệu polyester không dệt có kích thƣớc

16cm x 40cm x 16cm với một ô cửa sổ bằng nhựa PVC có kích thƣớc 10cm

x25cm ở phía trƣớc mặt túi.

Hình 2.5. Lắp đặt dàn giáo lai giống

Hình 2.6. Chọn hoa và khử đực Hình 2.7. Chụp bao cách ly

37

* Khảo nghiệm giống

Khảo nghiệm giống đƣợc thiết kế theo William, E. R & Matheson, A. C.,

(1994), và tiêu chuẩn ngành 04TCN 147-2006 về khảo nghiệm giống. Tất cả

các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo khối hàng ngẫu nhiên đầy đủ, với mỗi

công thức là 32 cây/4 lặp, mật độ 1.660 cây/ha, trồng cây cách cây 2m hàng

cách hàng 3m, kích thƣớc hố đào (50x50x50)cm. Phân bón mỗi hố 3kg phân

chuồng hoai + 200g lân nung chảy + 200g NPK.

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

* Phương pháp thu thập và xử lý số liệu sinh trưởng

- Các chỉ tiêu sinh trƣởng đƣờng kính ngang ngực (D1.3), chiều cao vút

ngọn (Hvn), Chiều cao dƣới cành (Hdc) đƣợc đo đếm định kỳ hằng năm 1 lần

theo các phƣơng pháp thông dụng trong điều tra rừng (giáo trình Điều tra

rừng - Vũ Tiến Hinh, Phạm Ngọc Giao, 1997; quy phạm xây dựng rừng giống

và vƣờn giống QPN 15-93).

- Thu thập số liệu về chỉ tiêu chất lƣợng cây nhƣ: độ thẳng thân, độ nhỏ

cành, phát triển ngọn, màu sắc lá… theo phƣơng pháp mục trắc và cho điểm

(Lê Đình Khả, Dƣơng Mộng Hùng, 2003):

+ Độ thẳng thân (Dtt) đƣợc cho điểm theo 5 cấp (1 - 5 điểm):

Cây rất cong:1 điểm

Cây cong: 2 điểm

Cây hơi cong: 3 điểm

Cây thẳng: 4 điểm

Cây rất thẳng: 5 điểm

+ Độ nhỏ cành (Dnc) đƣợc cho điểm theo 5 cấp (1 - 5 điểm):

Cành rất lớn ( > 1/3 đƣờng kính gốc cành): 1 điểm

Cành lớn (1/4 - 1/3 đƣờng kính gốc cành): 2 điểm

Cành trung bình (1/6 - 1/5 đƣờng kính gốc cành): 3 điểm

38

Cành nhỏ (1/9 - 1/7 đƣờng kính gốc cành): 4 điểm

Cành rất nhỏ (< 1/10 đƣờng kính gốc cành): 5 điểm

+ Phát triển ngọn (Ptn) đƣợc cho điểm theo 5 cấp (1 - 5 điểm):

Cây rất kém phát triển (ngọn bị teo hoặc mất ngọn chính, tán lá rất thƣa

hoặc lá úa vàng): 1 điểm

Cây kém phát triển (ngọn chính thiếu sức sống, tán lá thƣa và xanh

nhạt): 2 điểm

Cây phát triển trung bình (ngọn chính phát triển bình thƣờng, tán lá vừa

phải): 3 điểm

Cây phát triển khá (ngọn chính phát triển khá, tán lá phát triển lá xanh):

4 điểm

Cây rất phát triển (ngọn chính rất phát triển, cây khoẻ mạnh, có sức

sống, tán lá cân đối, lá xanh có ánh vàng): 5 điểm

+ Màu sắc lá ( Msl) đƣợc cho điểm theo năm cấp (1 - 5 điểm):

Màu lá rất vàng : 1 điểm

Màu lá vàng: 2 điểm

Màu lá hơi vàng: 3 điểm

Màu lá xanh: 4 điểm

Màu lá xanh có ánh vàng: 5 điểm

+ Độ rậm tán lá (Drt) cho điểm theo năm cấp (1 - 5 điểm):

Tán lá rất thƣa và không đầy đủ: 1 điểm

Tán lá hơi thƣa; ít đầy đủ: 2 điểm

Tán lá phát triển trung bình và tƣơng đối đầy đủ: 3 điểm

Tán lá tốt tƣơng đối đồng đều: 4 điểm

Tán lá phát triển tốt và đầy đủ: 5 điểm

+ Thể tích thân cây cả vỏ (V) đƣợc tính theo công thức 1:

1.3

(1)

D2 V = ----------------- .Hvn.f

4

39

Trong đó f là hệ số hình dạng, đƣợc ƣớc tính = 0,5.

+ Tính tỷ lệ đậu quả bằng công thức (2): ∑ số quả đậu x 100

Tỉ lệ đậu quả = (%) (2)

∑ số hoa thụ phấn

Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng chƣơng trình DATAPLUS,

GENSTAT (Williams & Matheson, 1994) và phần mềm EXCEL 5.0 (Nguyễn

Hải Tuất và Ngô Kim Khôi, 1996). Các chƣơng trình này đang đƣợc dùng

phổ biến để phân tích và xử lý các số liệu trong nghiên cứu sinh học và cải

thiện giống cây rừng.

* Nguyên tắc xác định các phân đoạn

Sau khi điện di sẽ đƣợc xác định vị trí và kích thƣớc từng băng ADN

trên bản gel. Số liệu đƣợc lập thành bảng theo vị trí và kích thƣớc các băng

ADN so với kích thƣớc các băng ADN marker 100bp trên bản gel để thuận

tiện cho việc theo dõi, ghi nhận số liệu và phân tích. Số liệu thu nhận đƣợc

nhập vào phần mềm excel để phân tích số liệu.

* Phân tích cấu trúc di truyền

Chạy các phần mềm GenAIEx 6.501, Treeview 1.6.6, GDA 1.0 để đánh

giá quan hệ di truyền giữa các cây bạch đàn trong loài và khác loài. Thông qua

đó đƣa ra những nhận xét, nhận định về quan hệ di truyền của các cây bạch đàn

nghiên cứu.

40

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích đa dạng di truyền của các cây bố mẹ đã chọn

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

Sau khi tiến hành tách chiết ADN tổng số, đề tài đã tiến hành kiểm tra độ

tinh sạch, nồng độ và chất lƣợng ADN bằng phƣơng pháp điện di trên gel

agarose 0,8%. Mẫu ADN sạch và không bị đứt gãy là yếu tố đầu tiên cho

phản ứng PCR –SSR thành công cũng nhƣ cho cả quá trình nghiên cứu.

Kết quả đo nồng độ ADN và kiểm tra chất lƣợng ADN trên gel agarose

0,8% cho thấy tất cả ADN tập trung một băng chính, hình ảnh rõ nét, không

bị đứt gãy, nhƣ vậy các mẫu ADN đều có chất lƣợng tốt, đủ điều kiện để tiến

hành các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.1).

C1 C13 C3 C4 C5 C7 E1 E1BV E2 E5 E6 E7 U1 U2 U3 U4 U5 U8 U29

.

Hình 3.1. Kết quả điện di tinh sạch ADN tổng số 19 cây bạch đàn

3.1.2. Kết quả phản ứng PCR từ ADN tổng số của các mẫu bạch đàn với

các mồi SSR

Để nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cây bạch đàn, đề tài đã sử

dụng 34 mồi SSR có tên và trình tự tại phụ lục 1. Sau khi hoàn thành phản

ứng PCR sản phẩm đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 4,5% để phân tích

đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu. Kích thƣớc băng ADN thu đƣợc đƣợc

phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu.

41

400bp

300bp

200bp

E229

100bp

E165

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của mồi EMBRA229 và EMBRA165 với 19 mẫu bạch đàn trên gel polyacrylamide 4,5%

3.1.3. Kết quả phân tích quan hệ di truyền giữa các cây bố mẹ chọn lai

giống

Kết quả phân tích đƣợc thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.4 và hình 3.5:

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền giữa 19 cây bạch đàn

42

Hình 3.3. Cây phân loại di truyền của 19 cây bạch đàn

Hình 3.4. Quan hệ di truyền giữa 19 cây bạch đàn

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy giữa các mẫu nghiên cứu có khoảng cách di

truyền nằm trong khoảng 0,28-3,882. Trong đó, giá trị 0,28 là khoảng cách di

43

truyền giữa hai cây C4-C13; khoảng cách di truyền giữa hai cây C3 và E1BV

là 3,882.

Sử dụng công cụ của phần mềm phân tích để xây dựng biểu đồ quan hệ

di truyền giữa 19 cây bạch đàn nghiên cứu (hình 3.4). Biểu đồ thể hiện góc

nhìn rõ hơn mối quan hệ giữa từng đối tƣợng và từng nhóm đối tƣợng với nhau.

Cây di truyền trên thể hiện mối quan hệ xa giữa các loài bạch đàn. Từ

hình 3.5 cho thấy có 2 nhánh, nhánh một gồm có Bạch đàn caman và Bạch

đàn liễu, nhánh hai chỉ có Bạch đàn urô và ở hình này cũng chỉ ra sự khác biệt

ở khoảng cách di truyền giữa các loài thậm chí trong cùng loài. Trong loài

Bạch đàn caman hai cây C1 (Bắc Giang) và C4 (Vĩnh Phúc) có hệ số tƣơng

đồng di truyền giống nhau, nhƣng trên thực tế ở hiện trƣờng hai cây này đƣợc

đánh giá về hình thái là sinh trƣởng nhanh (D1.3 = 36,7cm) và sinh trƣởng

chậm (D1.3 = 14,8cm). Đây chính là phản ảnh của môi trƣờng sống với từng

cá thể, tuy cùng có hệ số tƣơng đồng di truyền nhƣng sinh trƣởng khá khác

biệt ở hai lập địa khác nhau là Bắc Giang và Vĩnh Phúc.

Từ biểu đồ quan hệ di truyền (hình 3.4) kết hợp với bảng khoảng cách di

truyền (bảng 3.1) giữa các đối tƣợng nghiên cứu nhóm thực hiện nhận thấy

trung bình khoảng cách di truyền giữa các đối tƣợng trong nhóm Bạch đàn

caman là thấp hơn cả với nhóm loài khác (0,712). Khoảng cách di truyền

trong nhóm này thấp nhất là 0,28 và cao nhất đạt 1,69. Tiếp theo là nhóm

Bạch đàn liễu với khoảng cách di truyền trong nhóm này thấp nhất là 0,896 và

cao nhất đạt 3,319; khoảng cách di truyền trung bình trong nhóm đạt 1,183.

Cuối cùng là khoảng cách di truyền của nhóm Bạch đàn urô, giá trị thấp nhất

là 0,284 và cao nhất nhất là 2,537; giá trị trung bình của nhóm là 0,836. Qua

các số liệu thu đƣợc cho thấy rằng, khoảng cách di truyền giữa các mẫu

nghiên cứu trong cùng loài là rất khác nhau trong khi loài Bạch đàn caman chỉ

có 1,41 thì Bạch đàn liễu, Bạch đàn urô lần lƣợt là 2,495 và 2,254.

44

Với quan hệ di truyền giữa các nhóm khác nhau ta có khoảng cách di

truyền thấp nhất là nhóm Bạch đàn caman với Bạch đàn liễu (1,535); giá trị

cao nhất là nhóm Bạch đàn liễu với Bạch đàn urô (1,702); hiệu số khoảng

cách di truyền của nhóm Bạch đàn caman với Bạch đàn liễu (2,987), Bạch

đàn caman với Bạch đàn urô (1,336), và Bạch đàn liễu với Bạch đàn urô có

giá trị (2,1). Theo lý thuyết thì khoảng cách di truyền giữa từng nhóm đối

tƣợng hay từng đối tƣợng nghiên cứu càng xa nhau thì càng có ý nghĩa trong

việc thực hiện các phép lai nhằm đạt đƣợc các giống lai có hệ số tăng thu di

truyền cao nhất.

Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy E1BV có giá trị trung bình về khoảng cách

di truyền là (2,545) và khoảng cách giữa E1BV với từng đối tƣợng [1,955;

3,882], đứng thứ hai là U29 với giá trị trung bình đạt (1,961) trong khi

khoảng cách với từng đối tƣợng [1,254; 2,537]. E2, U3 thuộc nhóm có giá trị

trung bình khoảng cách di truyền thấp nhất lần lƣợt (1,226) và (1,227).

Kết quả phân tích cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các cây, cây trong

cùng nhóm loài và các nhóm là tƣơng đối khác biệt và biểu đồ quan hệ di

truyền của 19 cây phù hợp với bảng phân loại mối quan hệ giữa các loài bạch

đàn của Pryor, Johnson (1971) và Willcox (1997). Trong đó loài Bạch đàn

caman và Bạch đàn liễu có quan hệ họ hàng gần nhau hơn so với Bạch đàn

urô, do vậy khi lai giống giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn liễu và Bạch đàn

caman các tổ hợp lai thƣờng có ƣu thế lai nhiều hơn so với tổ hợp lai thuận

nghịch giữa Bạch đàn caman với Bạch đàn liễu.

Tóm lại: Khoảng cách di truyền giữa 19 cây nằm trong khoảng [0,28;

3,882] và đƣợc chia thành nhiều nhánh có sự sai khác lớn, các cây trong cùng

một loài tạo thành nhánh riêng biệt. Quan hệ giữa cây khác nhóm loài có ý

nghĩa lớn trong chọn giống và lai giống. Thông qua kết quả phân tích đa dạng

di truyền của 19 cây bố mẹ bằng 34 chỉ thị SSR, đề tài đã chọn ra các cặp bố

mẹ lai giống, với những cây bạch đàn có cùng hệ số tƣơng đồng di truyền thì

45

chỉ chọn một cây trong số đó để tiến hành lai giống với cây bạch đàn thuộc

loài khác với mục đích tạo nên các tổ hợp bạch đàn lai xa.

3.2. Xây dựng các tổ hợp lai

Trƣớc khi thực hiện xây dựng các tổ hợp lai cần xác định đƣợc thời điểm

nở hoa của từng cây bố mẹ tham gia lai giống để chuẩn bị thu phấn hoa và

dựng dàn lai giống.

3.2.1. Xác định thời điểm nở hoa, kết quả của các cây bố mẹ tham gia lai giống

Bảng 3.2. Vật hậu học của các loài cây tham gia lai giống (2012-2014)

Địa điểm

T T

Cây bố mẹ

Bắc Giang U1 Bắc Giang U2 Phú Thọ U3 Bắc Giang U4 Bắc Giang U5 U8 Phú Thọ U29 Hà Nội Bắc Giang C1 Vĩnh Phúc C3 Vĩnh Phúc C4 Bắc Giang C5 C7 Vĩnh Phúc C13 Vĩnh Phúc

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 E1BV Hà Nội 15 16 17 18 19

Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc

E1 E2 E5 E6 E7

Theo dõi các pha chính của vật hậu học (ngày/tháng) Nở hoa Quả Hình chín thành nụ Nở rộ 11-17/5 11-18/9 10-21/4 22-28/5 16-24/9 01-15/5 11-16/5 10-19/9 10-22/4 13-16/5 12-15/9 19-26/4 26/5-2/6 13-27/9 07-12/5 10-20/5 11-18/9 13-21/4 08-16/5 10-19/9 04-11/5 08-17/8 04-08/4 04-16/7 13-16/8 04-15/4 09-18/7 11-22/8 12-19/4 10-19/7 13-18/8 09-16/4 10-15/7 13-16/8 04-13/4 08-17/7 14-20/8 05-12/4 06-15/7 14-20/5 16-22/6 12-19/3 11-16/5 15-20/6 10-18/3 14-16/5 14-22/6 08-15/3 13-19/5 15-21/6 12-18/3 16-21/5 15-22/6 14-20/3 11-17/5 12-18/6 13-20/3

Kết thúc 17-23/10 21-29/10 19-24/10 18-27/10 28/10-06/11 15-18/10 22-27/10 12-18/5 10-16/5 22-29/5 20-24/5 11-17/5 09-18/5 08-15/7 04-12/7 02-07/7 04-12/7 10-17/7 07-14/7

Bắt đầu 03-15/8 13-21/8 02-08/8 04-06/8 09-15/8 01-12/8 04-12/8 11-17/3 13-22/2 24/2-03/3 20-28/2 11-17/2 10-16/2 14-20/5 10-19/5 08-17/5 13-20/5 13-20/5 13-20/5

Ghi chú: Theo dõi hình thành nụ và nở hoa trong năm (2012, 2013), thu hái quả

chín tương ứng vào năm sau (2013, 2014)

Bảng 3.2 cho thấy, thời gian từ lúc hình thành nụ tới khi quả chín của cả

3 loài bạch đàn tại Bắc Giang, Phú Thọ, Hà Nội và Vĩnh Phúc đều khoảng 13

tháng, trong đó Bạch đàn liễu hình thành nụ vào giữa tháng 3, Bạch đàn urô

46

hình thành nụ từ giữa tháng 4 tới giữa tháng 5 (phụ thuộc vào từng địa điểm)

và Bạch đàn caman là trung tuần tháng 7.

Các pha vật hậu của Bạch đàn caman và Bạch đàn liễu diễn ra đồng đều

và tập trung hơn so với Bạch đàn urô, ví dụ thời kỳ hình thành nụ của các cây

Bạch đàn caman đều từ tuần thứ nhất tới tuần thứ hai của tháng 7, hay thời kỳ

quả chín của Bạch đàn liễu là tuần thứ hai đến tuần thứ ba của tháng 5. Tuy

nhiên các cây Bạch đàn urô có các pha vật hậu diễn ra không tập trung, có thể

thấy dù cùng ở Bắc Giang nhƣng có cây hình thành nụ từ giữa tháng 4 (U1),

có cây tới đầu tháng 5 (U2). Sự khác biệt này đƣợc xác định là do ảnh hƣởng

của môi trƣờng sống, những cá thể ở nơi có độ ẩm cao hơn thƣờng ra hoa

muộn hơn.

3.2.2. Lai giống

Đề tài tiến hành lai giống giữa các cây bố mẹ ở bảng 2.1, thu đƣợc 61 tổ

hợp lai, gồm 20 tổ hợp lai có bố mẹ cùng sinh trƣởng nhanh; 19 tổ hợp lai có

mẹ sinh trƣởng nhanh, bố sinh trƣởng chậm; 13 tổ hợp có mẹ sinh trƣởng

chậm, bố sinh trƣởng nhanh và 9 tổ hợp có bố mẹ cùng sinh trƣởng chậm. Tỉ

lệ đậu quả của các loài khác nhau là khác nhau, nhìn chung đậu quả cao nhất

là loài Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu, tùy vào từng phép lai mà có tỉ lệ đậu

quả cao hay thấp. Trong thực tế lai giống cho thấy, Bạch đàn caman khi khử

đực cũng nhƣ chọn cành để lai giống đều không đƣợc nhƣ mong muốn, cành

thƣờng yếu, dễ gãy khi có gió to, đây chính là nguyên nhân khiến tỉ lệ đậu quả

không cao ở một số tổ hợp lai.

Bảng 3.3. Danh mục 61 tổ hợp lai giữa 3 loài bạch đàn

STT

Tổ hợp lai

Xtb

1 2 3 4 5

E1C1 E1C3 E1C5 E1E2 E1U2

Sinh trƣởng của bố mẹ lai N - N N - N N - C N - C N - N

Số lƣợng hoa thụ 399 452 456 346 28

Tỷ lệ đậu quả (%) Số lƣợng quả đậu 198 197 124 152 13

49,6 43,6 27,2 43,9 46,4

47

223 168 102 19 26 38 51 46 146 231 41 108 398 54 112 79 78 48 45 33 132 29 49 53 42 76 89 55 45 121 39 86 26 76 23 99 41 77 100 69 33 28 53 63

N - N N - C N - C C - C N - N N - C N - N N - C N - N N - C N - C C - N C - N C - N C - N C - C C - C N - N N - N N - C N - C N - N N - N N - N N - C N - C N - N N - C N -N N - C N - N N - C C - N C - N C - C C - N C - N C - C C - C C - N C - C C - N N - N N - C

112 121 30 6 4 15 16 11 75 31 24 70 171 21 64 54 31 13 23 17 19 9 13 10 29 20 37 17 14 38 7 5 13 32 11 46 16 57 43 18 2 3 27 28

50,2 72,0 29,4 31,6 15,4 39,5 31,4 23,9 51,4 13,4 58,5 64,8 43,0 38,9 57,1 68,4 39,7 27,1 51,1 51,5 14,4 31,0 26,5 18,9 69,0 26,3 41,6 30,9 31,1 31,4 17,9 5,8 50,0 42,1 47,8 46,5 39,0 74,0 43,0 26,1 6,1 10,7 50,9 44,4

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

E1U3 E1U4 E1U8 E2U4 E5C3 E5C5 E5E1 E5E6 E5U3 E5U4 E5U8 E6C1 E6C3 E6U2 E6U3 E6U4 E6U8 E7C3 E7U3 E7U4 E7U8 C1U1 C1U2 C1U3 C1U4 C1U8 C1E1 C1E2 C1E5 C1E6 C3U2 C3U4 C4E1 C4U3 C4U4 C5U3 C5U2 C5U4 C5U5 C5E5 C5U8 C5U1 C7E1 C7E2

48

67 75 64 84 71 57 72 92 33 89 71 79

N - N N - C N - N N - N N - C N - C N - N C - N C - N C - N C - C C - C

50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61

C7E5 C7E6 C7U1 C7U3 C7U4 U3E2 U3E5 U4C1 U4C3 U4E1 U4E2 U4E6

26 29 5 20 38 26 40 55 12 57 48 48

38,8 38,7 7,8 23,8 53,5 45,6 55,6 59,8 36,4 64,0 67,6 60,8

3.2.3. Khảo nghiệm các tổ hợp bạch đàn lai tại Trường Sơn – Lương Sơn - Hòa Bình (6/2014 -9/2016)

Trong 61 tổ hợp lai thu đƣợc, tiến hành gieo ƣơm hạt để tạo cây giống

cho trồng rừng khảo nghiệm. Tuy nhiên, tham gia khảo nghiệm tại hiện

trƣờng Trƣờng Sơn – Hòa Bình chỉ có 20 tổ hợp lai và 10 cây hậu thế của bố

mẹ. Trong khuôn khổ luận văn đề tài chỉ lấy hiện trƣờng tại Trƣờng Sơn -

Hòa Bình để phân tích sinh trƣởng các cây lai trong các tổ hợp lai đã đƣợc

khảo nghiệm tại đây

Bảng 3.4. Sinh trƣởng các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình (6/2014 - 9/2016)

D1.3 (cm)

Hvn (m)

Thể tích thân cây (dm3/cây)

Độ vƣợt về đƣờng kính (%)

TT

Tổ hợp lai

Tỷ lệ sống (%)

Sinh trƣởng mẹ - bố

Xtb V% Xtb V% Xtb V%

So với mẹ

So với bố

1 U4C1 C-N

6,5

20,3

8,2

19,5 13,6

24,6

59

117

71,9

2 C7U4 N-C

5,3

20,8

7,5

26,0

8,3

31,7

141

29

62,5

3 U4E1 C-N

4,7

23,2

6,0

26,3

5,2

34,0

15

153

71,9

4

U3

N

4,7

30,6

5,2

31,2

4,5

38,3

84,4

5 C4U4 C-C

4,5

28,2

5,3

29,7

4,2

36,7

114

10

75,0

6 U3E2 N-C

4,4

37,8

5,0

27,9

3,8

43,1

-16

100

56,3

7

E6U4 C-C

4,4

37,0

4,6

28,0

3,5

42,9

100

7

84,4

8 C4U3 C-N

4,2

35,8

5,0

27,6

3,5

40,7

100

-11

71,9

9

E5U3 N-N

4,1

39,5

5,0

36,2

3,3

46,0

37

-13

28,1

49

10

U4

C

4,1

44,9

34,5

5,0

3,3

50,0

46,9

11 U4E6 C-C

4,2

34,6

32,2

4,5

3,1

42,1

2

91

53,1

12 E6U3 C-N

3,8

35,9

29,5

4,5

2,6

42,4

73

-19

46,9

13 E1C1 N-N

3,8

32,8

33,2

4,4

2,5

41,3

90

27

40,6

14 U4E2 C-C

3,8

41,3

39,7

4,2

2,4

47,2

-7

73

65,6

15 E2U4 C-C

3,4

40,0

29,1

5,0

2,3

43,9

55

-17

15,6

16 U3E5 N-N

3,5

46,3

31,1

4,2

52,1

-26

2,0

17

37,5

17 E1U4 N-C

3,5

21,1

20,1

3,3

1,6

31,6

75

-15

18,8

18

E5

N

3,0

35,8

21,2

4,0

1,4

39,0

25,0

19 C7E1 N-N

3,1

26,6

10,8

3,5

1,3

30,0

41

55

28,1

20

C1

N

3,0

31,8

23,2

3,5

1,2

36,1

31,3

21 E6C1 C-N

3,2

43,2

23,9

3,0

1,2

45,3

45

7

75,0

22 C5E5 C-N

3,0

23,1

17,7

3,0

1,1

30,4

0

18,8

23 C7E6 N-C

2,9

29,4

24,7

3,0

1,0

35,2

32

32

15,6

24

E7

C

2,3

38,1

28,1

3,0

0,6

41,4

21,9

25

E2

C

2,2

34,3

20,6

3,0

0,6

35,8

12,5

26

E6

C

2,2

35,0

15,8

3,0

0,6

39,1

28,1

27

C7

N

2,2

25,4

15,8

3,0

0,6

30,5

12,5

28

C4

C

2,1

42,4

28,7

3,0

0,5

45,3

21,9

29

E1

N

2,0

33,0

26,5

3,0

0,5

34,8

28,1

30 C7E5 N-N

1,9

25,1

23,1

2,5

0,4

37,3

-14

-37

9,4

<0,001 0,89

<0,001 0,97

<0,001 1,29

Fpr LSD

Sau 2 năm, có 10 tổ hợp lai sinh trƣởng về đƣờng kính nhanh hơn cả bố

và mẹ của chúng (bảng 3.4). Cụ thể, tổ hợp lai U4C1 vƣợt về đƣờng kính so

với mẹ và bố lần lƣợt là 59% và 117%; tƣơng tự, C7U4 vƣợt lần lƣợt là 141%

và 29%, U4E1 vƣợt 15% và 135%, C4U4 vƣợt 114% và 28%, E6U4 vƣợt

100% và 7%, U4E6 vƣợt 2% và 91%, E1C1 vƣợt 90% và 27%, C7E1 vƣợt

41% và 55%, E6C1 vƣợt 45% và 7% và C7E6 cùng vƣợt bố mẹ 32%.

Bên cạnh đó, cũng có 8 tổ hợp lai tăng trƣởng đƣờng kính nhanh hơn bố

nhƣng chậm hơn mẹ, hoặc ngƣợc lại, ví dụ tổ hợp lai U3E2 có đƣờng kính

nhỏ hơn 16% so với mẹ U3, nhƣng vƣợt hơn bố E2 tới 100%, hay C4U3 hơn

mẹ C4 100% nhƣng kém bố U3 11%.

50

Có 01 trƣờng hợp không thể hiện đƣợc ƣu thế lai với cả bố và mẹ là

C7E5 khi sinh trƣởng kém mẹ C7 14% và thua bố E5 37% về đƣờng kính.

Nhƣ vậy, lai giống có thể tạo ra đƣợc những tổ hợp lai có ƣu thế lai so

với cả bố và mẹ, nhƣng cũng có thể tạo ra những tổ hợp lai chỉ có ƣu thế lai

so với bố hoặc mẹ hoặc không có ƣu thế lai. Ƣu thế lai tạo ra nhiều hay ít

phần lớn là do cách chọn các cặp bố mẹ lai với nhau, cần nắm vững nguyên

tắc là các cây đƣợc chọn trong cùng một loài cần có khoảng cách di truyền

tƣơng đối xa nhau, vì ƣu thế lai chỉ có thể xuất hiện khi bố mẹ có sai khác

nhất định về kiểu gen, khi bố mẹ có quan hệ di truyền quá gần nhau khó tạo ra

ƣu thế lai. Còn lai khác loài ƣu thế lai xảy ra khi các loài có khoảng cách di

truyền xa nhau nhƣng chúng phải cùng dãy (seria), một nhánh (section) hay

cùng một phân chi (subgenus).

Khi lai giống ba loài bạch đàn là Bạch đàn urô (U), Bạch đàn caman (C)

và Bạch đàn liễu (E), các tổ hợp lai có sự tham gia của Bạch đàn urô (UC,

CU, UE và EU) sinh trƣởng tốt hơn các tổ hợp lai giữa Bạch đàn caman với

Bạch đàn liễu (EC và CE). Trừ trƣờng hợp E1C1 có sinh trƣởng vƣợt hơn 04

tổ hợp lai giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn liễu (U4E2, E2U4, U3E5 và

E1U4) nhƣng vẫn cùng trong một tốp sinh trƣởng, các tổ hợp EC và CE khác

đều nằm ở nửa sau bảng đánh giá sinh trƣởng và tiệm cận với hậu thế sinh

trƣởng của bố mẹ chúng.

Các tổ hợp lai UC,CU thƣờng có sinh trƣởng tốt hơn các tổ hợp lai UE

hay EU, minh chứng là trong 05 vị trí dẫn đầu, có tới 03 tổ lai giữa U và C,

chỉ có U4E1 đứng ở vị trí thứ 3, còn lại là hậu thế của Bạch đàn urô U3. Các

tổ hợp lai UC, CU cũng có khả năng thích ứng cao hơn các tổ hợp lai UE, EU,

thể hiện qua tỷ lệ sống của các tổ hợp. Các tổ hợp lai giữa U và C đạt tỷ lệ

sống từ 40,6% đến 71,9%, trung bình đạt 61,7%; còn các tổ hợp lai giữa U

với E đạt tỷ lệ sống từ 15,6% đến 71,9%, trung bình đạt 44,1%.

Có thể sắp xếp khả năng sinh trƣởng của các tổ hợp lai và hậu thế theo

hƣớng giảm dần nhƣ sau:

UC, CU UE, EU EC,CE

51

Bảng 3.5. Sinh trƣởng của các tổ hợp bạch đàn lai thuận nghịch

D1.3 (cm) Hvn (m)

Thể tích thân cây (dm3/cây)

Độ vƣợt về đƣờng kính (%)

Tổ hợp lai

Sinh trƣởng mẹ - bố

Tỷ lệ sống (%)

Xtb V% Xtb V% Xtb V%

So với mẹ

So với bố

-26 37

17 -13

4,7 30,6 5,2 31,2 3,5 46,3 4,2 31,1 4,1 39,5 5,0 36,2 3,0 35,8 4,0 21,2

4,5 2,0 3,3 1,4

38,3 52,1 46,0 39,0

84,4 37,5 28,1 25,0

U3 U3E5 E5U3 E5

N N-N N-N N

- 15 75

- 573 -15

4,1 44,9 5,0 34,5 4,7 23,2 6,0 26,3 3,5 21,1 3,3 20,1 2,0 33,0 3,0 26,5

3,3 5,2 1,6 0,5

50,0 34,0 31,6 34,8

46,9 71,9 18,8 28,1

U4 U4E1 E1U4 E1

C C-N N-C N

100 2

7 91

4,1 44,9 5,0 34,5 4,4 37,0 4,6 28,0 4,2 34,6 4,5 32,2 2,2 35,0 3,0 15,8

3,3 3,5 3,1 0,6

50,0 42,9 42,1 39,1

46,9 84,4 53,1 28,1

U4 E6U4 U4E6 E6

C C-C C-C C

-7 55

73 -17

4,1 44,9 5,0 34,5 3,8 41,3 4,2 39,7 3,4 40,0 5,0 29,1 2,2 34,3 3,0 20,6

3,3 2,4 2,3 0,6

50,0 47,2 43,9 35,8

46,9 65,6 15,6 12,5

U4 U4E2 E2U4 E2

C C-C C-C C

Trong các cặp lai thuận nghịch giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn liễu trên,

các tổ hợp lai có ƣu thế lai so với Bạch đàn liễu nhƣng chƣa hẳn đã vƣợt Bạch

đàn urô (bảng 3.5). E6U4 và U4E6 đều vƣợt U4, U4E1 vƣợt U4 nhƣng E1U4

lại thua U4, còn U4E2 và E2U4 sinh trƣởng kém hơn U4, tƣơng tự là U3E5

và E5U3 so với U3. Bảng cũng cho thấy tổ hợp lai có mẹ là Bạch đàn urô

không phải lúc nào cũng sinh trƣởng nhanh hơn tổ hợp lai mẹ là Bạch đàn

liễu, U4E1 nhanh hơn nhiều so với E1U4 nhƣng U4E6 lại sinh trƣởng kém

hơn E6U4. Nhƣ vậy tùy vào từng trƣờng hợp cụ thể mà tổ hợp lai có mẹ là

Bạch đàn liễu có ƣu thế lai với tổ hợp lai có mẹ là Bạch đàn urô.

Số liệu ở bảng 3.6 cho thấy con lai giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn

caman các đặc điểm về hình thái tốt hơn so với con lai giữa Bạch đàn urô với

Bạch đàn liễu hay Bạch đàn liễu với Bạch đàn caman. Các tổ hợp lai UC - CU

52

cũng có đƣợc ƣu thế lai về hình thái thân so với mẹ, bố của chúng, nhƣ C4U4

có độ thẳng thân là 3,7; C4 là 2 và U4 là 3.

Bảng 3.6. Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình (6/2014-9/2016)

Tổ hợp

Dtt

Hdc

Dnc

Ptn

Msl

Drt

ST T

Sinh trƣởng bố - mẹ

1

C-N

U4C1

4,3

6

4,2

4,8

4,6

4,7

2

N-C

C7U4

3,5

5

4

4,4

4

4

3

C-N

U4E1

4

4,5

4

4

3,8

3,5

4

N

U3

3,8

3,5

4

4,6

4

4,4

5

C-C

C4U4

3,7

3,4

3,9

3,9

3,5

4

6

N-N

U3E2

3,5

3

4

4

4

3,5

7

C-C

E6U4

3,8

3,3

4

4

4

3,7

8

C-N

C4U3

4

3,5

4

4,2

4

3,3

9

N-N

E5U3

2,5

3

3,3

3,5

3,5

3

10

C

U4

3

3

4,4

4

4

3,3

11

C-C

U4E6

3,3

3

3,7

3,8

4

3,5

12

C-N

E6U3

3,5

3

3,7

3,5

3,5

3

13

N-N

E1C1

3,8

3

3

3,2

3

2,5

14

C-C

U4E2

3,1

2,5

4,3

4,4

4

3,9

15

C-C

E2U4

3,3

3,5

4

3,5

3,9

3,4

16

N-N

U3E5

3,4

4

3

3,7

3,8

3

17

N-C

E1U4

2,7

2,5

3

3,3

3,5

2

18

N

E5

3

3,5

4

4

4

3,4

19

C7E1

N-N

3,3

2

3

3,2

3,5

2,5

20

N

C1

3,4

2

2,5

3

3

3

21

C-N

E6C1

3,3

2

3,8

4,1

3,8

3

22

C-N

C5E5

3

1,5

3

3

3

2

23

N-C

C7E6

3,5

2

3

3

3

2

24

C

E7

3,3

2

4

3

3,2

2,5

25

C

E2

2

2

3

2

3

2

53

2

E6

26

C

2,7

3

3,3

3,5

2,5

2

C7

27

N

3,8

2

2,5

3

2

2

C4

28

C

2

3

2

3

2

2

E1

29

N

2

3

2

3

2

2

30

2

N-N

3

2

2

2

C7E5

Chú giải: Dtt: Độ thẳng thân Hdc: Chiều cao dưới cành Dnc: Độ nhỏ cành Ptn: Phát triển ngọn Msl: Màu sắc lá Drt: Độ rậm tán lá N- nhanh; C-chậm

Bảng 3.6 cũng cho thấy khi lai giống giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn

liễu, Bạch đàn urô làm mẹ thƣờng tạo ra con lai có hình thái thân đẹp hơn khi

Bạch đàn liễu làm mẹ. Cụ thể, U4E1 hơn rõ rệt E1U4, U4E2 tuy có độ thẳng

thân thấp hơn nhƣng độ nhỏ cành, phát triển ngọn, tán lá đều hơn E2U4.

Tổ hợp có hình dáng thân đẹp nhất là U4C1 với độ thẳng thân đạt trung

bình 4,3; độ nhỏ cành đạt 4,2; phát triển ngọn rất tốt khi đạt 4,8; tán lá cân đối

đạt 4,7.

Hình 3.5. Tổ hợp bạch đàn lai C4U4 ở Hòa Bình

54

Tóm lại: Những tổ hợp lai có hình thái thân tƣơng đối đẹp là U4E1,

E6U4, C4U3, C4U4, C7U4, U3E2 và U4C1, khi kết hợp với đánh giá sinh

trƣởng, có thể chọn đƣợc 6 cây bố mẹ là C7, C1, C4, E1, E6, U4 xây dựng

đƣợc 4 cặp lai có sinh trƣởng tốt là U4C1, C7U4, U4E1 và C4U4 là các cặp

lai đều có ƣu thế lai so với cả bố và mẹ của chúng.

55

CHƢƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Đề tài xác định đƣợc khoảng cách di truyền giữa 19 cây bạch đàn bố

mẹ nằm trong [0,28; 3,882] và đƣợc chia thành nhiều nhánh có sự sai khác

lớn, các cây trong cùng một loài tạo thành nhánh riêng biệt. Quan hệ giữa cây

khác nhóm loài có ý nghĩa lớn trong chọn giống và lai giống.

- Tiến hành lai giống giữa các cây bố mẹ và thu đƣợc 61 tổ hợp lai, gồm

20 tổ hợp lai có bố mẹ cùng sinh trƣởng nhanh; 19 tổ hợp lai có mẹ sinh

trƣởng nhanh, bố sinh trƣởng chậm; 13 tổ hợp có mẹ sinh trƣởng chậm, bố

sinh trƣởng nhanh và 9 tổ hợp có bố mẹ cùng sinh trƣởng chậm. Tỉ lệ đậu quả

của các loài khác nhau là khác nhau, nhìn chung tỷ lệ đậu quả cao nhất là loài

Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu, tùy vào từng phép lai mà có tỉ lệ đậu quả cao

hay thấp.

- Tại khảo nghiệm Trƣờng Sơn – Hòa Bình, đề tài đã chọn đƣợc 4 tổ hợp

lai có sinh trƣởng triển vọng là: U4C1, C7U4, U4E1 và C4U4, các tổ hợp lai

này có ƣu thế lai so với bố mẹ của chúng và vƣợt từ 10-153%. Các tổ hợp lai

này đều là lai giữa Bạch đàn urô với Bạch đàn caman và Bạch đàn urô với

Bạch đàn liễu.

4.2. Kiến nghị

Hiện trƣờng nghiên cứu cần đƣợc tiếp tục theo dõi và bảo vệ, đây là các

vật liệu rất quý cho các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ sinh học cũng nhƣ

chọn giống truyền thống.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp

dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam,

NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Việt Cƣờng (2005), Báo cáo tổng kết đề tài “ Nghiên cứu lai

giống cho một số loài bạch đàn, keo, tràm và thông” giai đoạn 2001 -

2005, Hà Nội.

3. Nguyễn Việt Cƣờng, Phạm Đức Tuấn (2007), “Ứng dụng của chỉ thị phân

tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây

dựng vƣờn giống cây Cóc hành”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông

thôn, số 19.

4. Nguyễn Việt Cƣờng, Phạm Đức Tuấn, Nguyễn Đức Thành (2007), “Ứng

dụng chỉ thị phân tử (RADP và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di

truyền các cây trội và lựa chọn cặp bố mẹ để xây dựng vƣờn giống Keo tai

tƣợng (Acacia mangium)”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn,

số 16, trang 56-59.

5. Nguyễn Việt Cƣờng (2010), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu lai

giống cho một số loài bạch đàn, keo, tràm và thông” giai đoạn 2006-

2010, Hà Nội.

6. Lê Đình Khả và cs (1993), “Trồng bạch đàn ở nƣớc ta nhƣ thế nào cho có

hiệu quả”, Tạp chí lâm nghiệp, số 2, trang 9-10.

7. Lê Đình Khả (2001), Báo cáo tổng kết đề tài KHCN 08.04 “Chọn tạo

giống và nhân giống cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu” giai đoạn

1996-2000, Hà Nội.

8. Lê Đình Khả và cs (2003), Chọn tạo giống và nhân giống cho một số loài

cây trồng rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

57

9. Nguyễn Đức Kiên, Hà Huy Thịnh, Đỗ Hữu Sơn, Mai Trung Kiên, La Ánh

Dƣơng (2009), “Sinh trƣởng của một số tổ hợp lai giữa Bạch đàn urô và

Bạch đàn pellita trên một số lập địa ở miền Bắc và Bắc trung bộ”. Tạp chí

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 12/2009, trang 168-172.

10. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Quốc Trọng và Nguyễn Đức Thành (2005),

“Kết quả bƣớc đầu đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh

bằng chỉ thị RADP và ADN lục lạp”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn số 65, trang 80-81.

11. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu chọn

giống kháng bệnh có năng suất cao cho một số loài bạch đàn và keo’’ giai

đoạn 2001-2005, Hà Nội

12. Trần Hồ Quang (2010), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu phát triển và

ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Bạch đàn uro”, Hà Nội.

13. Nguyễn Minh Thanh (2010), Nghiên cứu cơ sở khoa học trồng thâm canh

Mây nếp (Calumus tetradactylus Hance) dưới tán rừng tại một số tỉnh

phía Bắc Việt Nam. Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Trƣờng Đại học lâm

nghiệp, Hà Nội.

14. Hà Huy Thịnh (2006), Báo cáo tổng kết đề tài “ Nghiên cứu chọn tạo

giống có năng suất và chất lượng cao cho một số loài cây trồng rừng chủ

yếu” giai đoạn 2001 -2005, Hà Nội.

15. Trần Thanh Trăng (2012), Báo cáo tổng kết đề tài “Chọn giống Bạch đàn

trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (Cryptosporiopsis

eucalypti) bằng chỉ thị phân tử”, Hà Nội.

16. Vƣơng Đình Tuấn (2009), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng

chỉ thị ADN trong chọn giống Keo lá tràm (A. auriculiformis) cho vùng

Nam bộ” giai đoạn 2005-2009, TP. HCM.

58

Tiếng Anh:

17. Agrama, H.A., George, T.L. and Salah, S.F. (2002), “Construction of

Genome Map for E. camaldulensis Dehn”, Silvae Genetica 51, pp. 5-6.

18. Assis, T.F. (2000), “Production and use of Eucalyptus hybrids for

industrial purposes”, Hybrid Breeding and Genetics of Forest Trees, page

63.

19. Bala R. Thumma & Brian S. Baltunis & John C. Bell & Livinus C.

Emebiri & Gavin F. Moran & Simon G. Southerton, 2010, “Quantitative

trait locus (QTL) analysis of growth and vegetative propagation traits in

Eucalyptus nitens full-sib families”, Tree Genetics & Genomes 6, pp.

877–889.

20. Bala Thumma, Saravanan Thavamanikumar, Jeremy Brawner and Simon

Southerton (2015), “Applying Marker-assited Selection in Eucalyptus

Scientific Cultivation and Green Development

to Enhance

the

Sustainability of Eucalyptus Plantions”. IUFRO Eucalyptus Conference

2015.

21. Bouvet, J.M., Combes, J.G. (1997), “Expression of growth traits,

morphological traits and wood property traits ortet population of E.

urophylla x E. grandis and E. urophylla x E. pellita”. IUFRO Cenference

on Silviculture and Improverment of Eucalypt, 205 pp.

22. Brawner J.T., Bush D.J., Macdonel P.F., Warburton P.M., Clegg P.A.,

(2012), “Genetic parameter of red mahagany breeding populations grown

in the tropics”, Australian Forestry 73, pp. 177-183.

23. Brondani, R..P.V., Brondani, C., Tarchini, R. and Grattapaglia. D. (1998),

“Development, characterization and mapping of microsatellite markers in

Eucalyptus grandis and E. urophylla”. Theor Appl Genet 97, pp.816-827.

59

24. Brondani, R.P.V., Brondani, C. and Grattapaglia, D. (2002), “Towards a

genus-wide reference linkage map for Eucalyptus based exclu sively on

highly informative microsatellite markers”. Genomics 267, pp.338-347.

25. Brondani, R.P.V., Williams E.R., Brondani, C. and Grattapaglia, D.

(2006), “A microsatelite-based consensus linkage map for species of

Eucalyptus and a novel set of 230 microsatelite markers for the genus”,

BMC Plant Biology, pp. 6-20.

26. Brown S. M., Kresovich S. (1996), “Molecular characterization for plant

genetic resources conservation”, Genome mapping in plants, pp. 85 - 93.

27. Bundock, P.C., Hayden, M. and Vaillancourt, R.E. (2000), “Linkage maps

of Eucalyptus globulus using RAPD and Microsatellite markers”. Silvae

Genetica 49, pp. 4-5.

28. Bundock, P.C, Brad M. Potts and René E. Vaillancourt, (2008),

“Detection and stability of quantitative trait loci (QTL) in Eucalyptus

globules”, TREE GENETICS & GENOMES Volume, Number 1, pp. 85-

95.

29. Chew, T.K. (1980), “Grown of Eucalyptus species in perninsular

Malaysia”, Malaysian Forester, 43:1, pp. 8-15.

30. Darrow, W. K. (1983), "Provenance-type of Eucalyptus grandis and

Eucalyptus saligna in South Africa: eight year results", South African

Forestry Journal, (126), pp. 30-38.

31. Dow B. D., Ashley M. V., Howe H. F. (1995), “Characterization of highly

variable (GA/CT) microsatellites in the bur oak Quercus macrocarpa”,

Theor Appl Genet 91, pp. 137 - 141.

32. Eldridge. K, Davidson. J, Harwood. C, G. van Wyk, (1993). “Eucalypt

Domestication and Breeding”. Oxford Science Publications 288, pp. 51.

33. Jacobs, M.R. (1981), “Eucalyptus for planting”, FAO Forestry Series

No.11. FAO, Rome.

60

34. Kirst, M., Cordeiro, G.D., Rezende, S.P. and Grattapaglia, D. (2005),

Power of microsatellite markers for fingerprinting and parentage analysis

in Eucalyptus grandis breeding populations.

35. Li Z. (1999), “DNA markers and QTL mapping in rice’, Genetic

improvement of rice for water - limited environments, IRRI, pp. 157 - 172.

36. Murugan, S. and Y. Ramasamy (2014), "Microsatellite resources of

Eucalyptus: current status and future perspectives", Botanical Studies, pp.

55- 73.

37. Ottewell, K.M., Donnellan, S.C., Moran, G.F. and Paton, D.C. (2005),

Multiplexed microsatellite markers for the genetic analysis of Eucalyptus

leucoxylon (Myrtaceae) and their utility for ecological and breeding

studies in other Eucalyptus species. J. Hered. 96:445-451.

38. Rao, D.V. (1984), "Provenance trials of Eucalyptus", Indian Forester,

110(1), pp. 28-34.

39. Rongwen J., Akkaya M. S., Bhagwat A. A., Lavi U., Cregan P. B. (1995),

“The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype

identification”, Theor Appl Genet 90, pp. 43-48.

40. Shen Xihuan (2000), "Hybridization of forest tree species in Chiana,

Hybird Breeding and Genetics of Forest Trees”, QFRI/CRC-SPF

Symposium Noosa, Queensland, Australia 9 - 14 April, pp. 491 - 499.

41. Steane, D.A., Vaillancourt, R.E., Russell, J., Powell, W., Marshall, D. and

Potts, B.M. (2001), “Development and characterisation of microsatellite

loci in Eucalyptus globulus (Myrtaceae)”, Silvae Genet 50, pp. 89-91.

42. Turvey, N.D, (1995). “Afforestation of Imperata grasslands in Indonesia:

Results of Industrial Tree Plantation Research Trials at Teluk Sirih on

Pulau Laut, Kalimantan Selatan”, ACIAR Technical Reports No. 35, pp.

43.

61

43. Verryn, S.D. (2000), "Eucalyptus Hybrid breeding in south Africa, Hybrid

Breeding and Genetics of Forest Trees”, QFRI/CRC-SPF Symposium

Noosa, Queensland, Australia 14 April, pp. 191 - 199.

44. Yasodha, R., Sumathi, R., Chezhian, P., Kavitha, S., Ghosh, M. (2008)

“Eucalyptus microsatellites mined in silico: survey and evaluation”,

Journal of Genetics 87, pp. 21-25.

45. https://en.wikipedia.org/wiki/Eucalyptus

46. www.git-forestry.com

62

PHỤ LỤC

63

Phụ lục 1. Danh mục 34 cặp mồi sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền các cây bố mẹ bạch đàn

Cặp mồi

Trình tự lặp lại

Trình tự mồi 5’- 3’

Kích thƣớc

Nhóm liên kết

Nhiệ độ bắt cặp

CgTgACACCAggACATTAC

EMBRA2

(AG)15

121

11

56

ACAAATgCAAATTCAAATgA

AgTgAgAgAgATATTCgCgT

EMBRA9

(AGA)3(AG)28

56

94

5

CCAATACAATCATCAATCCA

AggATTTgTggggCAAgT

EMBRA12

(AG)22

56

98

1

gTTCCCCATTTTCATgTCC

gCATTCgTACTCATTTTCAA

EMBRA39

(AG)9(CA)11

54

146

11

gCATCgAgAgTggATTAgTT

AgAACCCTCTATAAAACCCC

EMBRA47

(AG)24

56

106

8

gggCTAgACATgATggAg

gATgCATTCCTTTTTTTCC

EMBRA51

(AG)20

58

115

6

CATTCTCTTgCATCTggAC

ATTAgCTTTTCTgTAACCCg

EMBRA53

(AG)17GT(AG)5

60

130

8

gAATggACAAgCTCTgATg

TgTATgAggTACATCCgg

EMBRA54

(AG)17

50

144

5

AAAgTTATCAgCgAgAgTTC

CACCAACTggTACTATgAggAT

EMBRA58

(AG)20

56

143

9

TTggCTTAgggTAgAACACT

CTCCTACTACTggTTCTATCACT

EMBRA116

(TC)21

56

104

8

TCCTgCTCTTTCTCTCTCTA

TgTggACATgATAgATgAAgT

EMBRA124

(TC)34

58

90

10

AATTATTTCgATAgAAACggA

gTAgTCCCTgACgCAAAC

EMBRA126

(TCCTC)4TCC...(CT)18

58

99

2

AgTACgATATTTTCgCgAgT

CTgACTTggCCggTACATA

EMBRA135

(AG)15AAT...(AG)10

54

116

5

AAATCTAgTCggTCTCAAAgC

gTTATgTTTggTTgAAAggAg

EMBRA138

(TC)26CC(TC)3

60

115

10

AgACACCATgTCCCCAgg

CTCgTCTTgCACgCTCTCTT

EMBRA147

(AG)n

58

273

4

gAgAgTgTgTTCATgCggCT

TCTCCTCTggCTCTTCTA

EMBRA152

(AC)24

56

122

5

gCATgTACACTAACgACg

CACACTTCTAgTCCATCC

EMBRA153

(CT)24

56

215

10

ggAgTATAgAACgATTgTg

TggATggTCAACggCgTA

EMBRA157

(CT)19

60

247

1,6

CATgCATTggCCATTggT

ggTTgTCggTTCACTCTTgT

EMBRA165

(TC)n

60

144

10

ATAggATTgCgTCATgAAgC

64

ggAgTgAAgACggTAAAT

EMBRA168

(GA)12

55

82

5

ATCTCACTTTTCTCTCgC

ggAAggCTTTgAgATAAC

EMBRA186

(GA)27

56

186

4

ACCgAgACCAgTTgAgAg

CTCATgCATAgCTgCTACTC

EMBRA188

(GA)9CAGG(GA)20

56

193

6

gCAgCTCAgTgTACATTgg

gAgCgAgATCTAATCTTC

EMBRA191

(CT)25

56

180

5

ggATgCAgTTCTAgAgAg

CgTgCTTTTgAggCTCT

EMBRA194

(CT)17A(CA)14

56

143

3

gATTgAggATgAgTggTC

gCCTTCCACTTCTTCAggTC

EMBRA202

(CT)22

57

254

5

gTTATACTgCggTgAAggCT

CAgCAACgTCTACCTCTTCC

EMBRA206

(TC)21

57

348

8

TgATCCAgTTCCgACTAgTg

CTCgTgTggTTATgTgAACT

EMBRA208

(TC)25

56

147

9

gCTTgTCTACTATgCACATgA

AggAAggCggATTgATgAgg

EMBRA209

(GA)21

57

182

8

gAACggACggAggTgAgCTA

EMBRA214

(GA)8AA(GA)11

57

316

1

gAACAgCTACTCgTCgATTC

gTAACCAggCTTggACgAT

EMBRA225

(CT)12

58

225

2

gATATTCCTCggTCTCTCTg

TCCTCTTgTTgTCgCCTC

EMBRA229

(GA)20

56

181

5

AgAACgTTAACTCCTAAggT

CTgCAATACATATCTTCTCC

EMBRA232

(GA)30

56

173

6

gTACTTAATCTgTggCAATC

gATCCTTgCATTATCgAC

EMBRA237

(CT)21

50

222

3,7

gTCATTgTTgCgATCACTgC

ACgTgACTTggTTgATCTgC

EMBRA240

(TC)21

56

344

8

CAgCAACgTCTACCTCTTCC

CCAgTTCCgACTAgTgTTCC

65

Phụ lục 2. Kết quả chạy SSR của 34 cặp mồi sử dụng trong phân tích

đa dạng di truyền các cây bố mẹ bạch đàn

Sample File pop. EMBRA186 EMBRA194 EMBRA147 EMBRA214

C1 C1 0 0 0 0 230 230 0 0

C3 C3 180 194 140 164 190 204 0 0

C4 C4 0 0 0 0 0 0 0 0

C5 C5 140 164 0 0 190 204 0 0

C7 C7 164 164 175 185 190 190 0 0

C13 C13 164 164 0 0 0 0 0 0

E1 E1 0 0 190 190 110 110 0 0

E1BV E1BV 160 160 135 135 175 195 0 0

E2 E2 150 175 0 0 0 0 0 0

E5 E5 164 164 0 0 170 190 0 0

E6 E6 0 0 190 196 190 204 0 0

E7 E7 175 175 0 0 0 0 0 0

U1 U1 0 0 177 177 175 180 0 0

U2 U2 0 0 177 177 190 204 0 0

U3 U3 0 0 177 177 190 204 0 0

U4 U4 0 0 177 177 190 204 0 0

U5 U5 140 140 177 177 190 204 0 0

U8 U8 140 140 177 183 0 0 250 260

U29BV U29BV 85 85 160 170 0 0 0 0

Sample File pop. EMBRA51 EMBRA135 EMBRA126 EMBRA153

C1 C1 0 0 0 0 0 0 0 0

C3 C3 0 0 0 0 0 0 0 0

C4 C4 0 0 0 0 0 0 0 0

C5 C5 0 0 0 0 0 0 0 0

C7 C7 0 0 0 0 0 0 0 0

C13 C13 0 0 0 0 0 160 180 0

E1 E1 0 0 0 0 0 0 0 0

E1BV E1BV 0 0 120 130 140 140 220 220

E2 E2 0 0 0 0 0 140 140 0

E5 E5 0 0 0 0 0 0 240 260

E6 E6 0 0 0 0 0 0 180 180

E7 E7 140 140 0 0 145 145 215 250

U1 U1 130 130 0 0 140 145 220 240

U2 U2 130 140 0 0 140 145 220 240

U3 U3 130 140 0 0 140 145 220 240

U4 U4 130 140 0 0 140 145 220 240

U5 U5 130 140 0 0 140 145 220 240

U8 U8 0 0 0 0 150 150 215 250

U29BV U29BV 130 140 130 145 155 155 105 110

66

Sample File

pop. EMBRA208 EMBRA237 EMBRA2 EMBRA138

C1 C1 120 120 0 0 0 0 0 0

C3 C3 0 0 0 0 125 125 0 0

C4 C4 0 0 0 0 0 0 0 0

C5 C5 0 0 0 0 125 125 0 0

C7 C7 0 0 0 0 0 0 0 0

C13 C13 0 0 0 0 125 125 0 0

E1 E1 0 0 0 0 0 0 0 0

E1BV E1BV 112 112 175 205 0 0 190 190

E2 E2 0 0 0 0 125 125 0 0

E5 E5 0 0 0 0 125 125 175 205

E6 E6 120 120 0 0 0 0 0 0

E7 E7 120 120 0 0 130 130 0 0

U1 U1 0 0 0 0 130 120 200 200

U2 U2 100 120 0 0 130 120 0 0

U3 U3 0 0 0 0 130 120 200 205

U4 U4 115 115 0 0 130 120 200 205

U5 U5 0 0 0 0 130 120 100 205

U8 U8 120 100 0 0 125 125 175 175

U29BV U29BV 135 130 100 100 0 0 105 105

Sample File

pop. EMBRA209 EMBRA168 EMBRA225 EMBRA232

C1 C1 150 150 0 0 0 0 140 150

C3 C3 0 0 0 0 180 190 140 150

C4 C4 125 150 0 0 0 0 0 0

C5 C5 0 0 0 0 180 190 140 150

C7 C7 120 135 0 0 0 0 140 150

C13 C13 0 0 0 0 0 0 120 150

E1 E1 135 120 0 0 160 160 130 150

E1BV E1BV 130 130 125 125 0 0 140 145

E2 E2 0 0 90 90 0 0 140 140

E5 E5 130 130 0 0 160 160 0 0

E6 E6 145 130 0 0 0 0 140 140

E7 E7 155 155 90 90 0 0 0 0

U1 U1 0 0 90 105 164 170 120 140

U2 U2 150 130 90 105 164 164 0 0

U3 U3 150 130 90 105 0 0 120 140

U4 U4 150 130 0 0 0 0 120 140

U5 U5 0 0 0 0 0 0 120 140

U8 U8 0 0 90 90 170 175 0 0

U29BV U29BV 70 90 0 0 140 170 160 160

67

Sample File pop. EMBRA12 EMBRA188 EMBRA53 EMBRA58

C1 C1 0 0 240 240 150 150 160 145

C3 C3 0 0 0 0 150 150 180 175

C4 C4 0 0 0 0 150 150 180 175

C5 C5 0 0 0 0 150 150 0 0

C7 C7 0 0 0 0 0 0 175 180

C13 C13 0 0 0 0 140 160 0 0

E1 E1 0 0 0 0 150 155 190 165

E1BV E1BV 135 160 155 170 160 160 145 145

E2 E2 0 0 170 180 155 160 175 165

E5 E5 0 0 160 160 155 155 175 175

E6 E6 0 0 0 0 150 150 0 0

E7 E7 0 0 0 0 150 150 155 175

U1 U1 0 0 110 110 180 180 0 0

U2 U2 0 0 110 110 0 0 160 160

U3 U3 0 0 0 0 180 185 0 0

U4 U4 0 0 0 0 180 185 160 160

U5 U5 0 0 0 0 185 185 160 160

U8 U8 0 0 0 0 145 160 0 0

U29BV U29BV 163 170 0 0 155 160 170 190

Sample File

pop. EMBRA191 EMBRA206 EMBRA124 EMBRA116

C1 C1 0 0 100 110 0 0 150 130

C3 C3 0 0 0 0 160 130 180 180

C4 C4 0 0 90 110 0 0 0 0

C5 C5 0 0 160 130 165 165 170 180

C7 C7 0 0 0 0 150 150 165 165

C13 C13 0 0 160 150 170 170 150 170

E1 E1 0 0 0 0 150 130 170 175

E1BV E1BV 0 0 150 150 190 200 145 145

E2 E2 0 0 0 0 150 130 95 105

E5 E5 0 0 0 0 0 0 135 130

E6 E6 0 0 0 0 0 0 140 130

E7 E7 0 0 0 0 0 0 160 150

U1 U1 0 0 0 0 0 0 0 0

U2 U2 0 0 0 0 0 0 0 0

U3 U3 0 0 0 0 0 0 160 130

U4 U4 0 0 0 0 0 0 160 130

U5 U5 0 0 0 0 0 0 160 130

U8 U8 0 0 0 0 160 130 175 185

U29BV U29BV 0 0 170 150 160 160 150 150

68

Sample File pop. EMBRA157 EMBRA165 EMBRA47 EMBRA240

C1 C1 110 140 160 160 0 0 140 150

C3 C3 120 140 160 160 380 380 140 150

C4 C4 120 140 380 0 0 380 140 160

C5 C5 110 145 160 160 390 390 140 150

C7 C7 0 0 380 0 0 400 140 150

C13 C13 140 140 0 0 0 0 140 160

E1 E1 170 170 400 400 140 145 140 160

E1BV E1BV 130 160 150 150 0 0 110 110

E2 E2 140 140 0 0 0 0 140 160

E5 E5 0 0 0 0 0 0 140 160

E6 E6 140 140 0 0 0 0 0 0

E7 E7 140 160 140 145 0 0 0 0

U1 U1 400 400 120 140 0 0 0 0

U2 U2 140 160 0 0 0 0 0 0

U3 U3 120 140 0 0 0 0 0 0

U4 U4 135 135 120 145 0 0 140 160

U5 U5 0 0 0 0 0 0 140 160

U8 U8 140 140 0 0 0 0 130 150

U29BV U29BV 155 160 320 370 150 175 140 160

Sample File

pop. EMBRA39 EMBRA229 EMBRA9 EMBRA202

C1 C1 181 205 0 0 0 0 140 145

C3 C3 181 205 125 130 210 230 140 150

C4 C4 181 205 125 130 0 0 140 140

C5 C5 181 205 125 130 210 230 140 150

C7 C7 181 181 0 0 0 0 140 140

C13 C13 181 190 125 150 210 230 140 150

E1 E1 181 205 0 0 0 0 140 140

E1BV E1BV 170 185 130 145 0 0 142 142

E2 E2 181 205 140 140 210 230 140 140

E5 E5 181 205 0 0 0 0 140 150

E6 E6 181 205 0 0 0 0 140 150

E7 E7 181 205 120 150 210 230 140 150

U1 U1 181 240 125 150 210 230 140 150

U2 U2 181 190 125 150 210 230 140 150

U3 U3 181 240 125 150 210 230 140 150

U4 U4 181 190 125 150 210 230 140 150

U5 U5 181 190 0 0 210 230 140 150

U8 U8 181 240 160 160 210 230 140 150

U29BV U29BV 181 200 140 140 250 250 140 140

69

Sample File pop. EMBRA152 EMBRA54

C1 C1 0 0 0 0

C3 C3 0 0 0 0

C4 C4 150 160 0 0

C5 C5 0 0 0 0

C7 C7 160 160 0 0

C13 C13 0 0 0 0

E1 E1 0 0 0 0

E1BV E1BV 150 150 0 0

E2 E2 180 185 0 0

E5 E5 180 185 0 0

E6 E6 185 185 0 0

E7 E7 185 185 0 0

U1 U1 0 0 180 200

U2 U2 0 0 0 0

U3 U3 0 0 180 185

U4 U4 0 0 0 0

U5 U5 0 0 0 0

U8 U8 0 0 180 190

U29BV U29BV 0 0 200 205

70

Phụ lục 3. Bảng hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 19 cây bạch đàn

NGD

Sheet1 Pairwise Population Matrix of Nei Genetic Identity C13 C3 C4 C5 C7 E1 E2 E5 E6 E7 U1 U2 U3 U4 U5 U8 E1BV U29 C1 C1 1.000 0.396 1.000 C13 1.000 0.529 0.388 C3 1.000 0.313 0.756 C4 0.405 0.381 1.000 0.388 0.373 C5 0.250 0.402 0.316 1.000 0.252 0.418 C7 0.184 1.000 0.233 0.342 0.283 0.321 0.228 E1 0.268 0.034 1.000 0.066 0.104 0.073 0.021 0.064 E2 0.121 0.312 0.110 1.000 0.305 0.274 0.409 0.300 0.362 E5 0.251 0.302 0.099 0.370 1.000 0.295 0.310 0.327 0.228 0.333 E6 0.119 0.283 0.073 0.361 0.251 1.000 0.327 0.211 0.194 0.315 0.369 E7 0.316 0.231 0.089 0.393 0.205 0.408 0.267 0.172 0.272 0.309 0.281 1.000 U1 0.215 0.149 0.157 0.236 0.160 0.188 0.250 U2 0.175 0.046 0.265 0.085 0.165 1.000 0.089 0.209 0.171 0.257 0.204 0.205 0.378 U3 0.119 0.101 0.245 0.209 0.206 0.589 1.000 0.171 0.269 0.180 0.297 0.215 0.311 0.353 U4 0.125 0.142 0.328 0.220 0.297 0.711 0.626 1.000 0.180 0.283 0.183 0.289 0.218 0.277 0.314 U5 0.156 0.126 0.250 0.239 0.217 0.531 0.668 0.749 1.000 0.205 0.310 0.200 0.264 0.149 0.303 0.301 U8 0.146 0.104 0.274 0.215 0.211 0.425 0.634 0.667 0.753 1.000 0.175 0.287 0.108 0.340 0.129 0.321 0.296 0.147 0.059 0.373 0.205 0.227 0.269 0.231 0.331 0.177 0.280 1.000 E1BV 0.129 0.120 0.190 0.154 0.123 0.184 0.116 0.143 0.140 0.285 0.088 0.097 0.148 0.161 0.151 0.151 0.165 0.079 1.000 U29 0.147

71

Phụ lục 4. Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai

Tổ hợp: U4C1 Địa điểm: Trƣờng Sơn - Hòa Bình Ngày đo: 24/06/2016 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 TB

Hdc 8 6.5 7.2 4 5 5.5 7.3 5 7 8.3 6.5 4.5 5 5.5 4.2 4.8 7.5 6.8 4.5 5.2 4.8 7 8 4.5 5 6.8 6.3 5.4 7 6.5 6 7.6 6.0

Dtt 4 3 4 4 5 5 4 5 3 4 5 5 3 4 4 5 5 4 5 5 4 4 3 5 5 4 5 4 4 5 5 4 4.3

Dnc 5 4 5 4 3 5 5 4 5 5 3 4 3 5 4 3 5 3 3 4 4 4 5 4 3 5 4 5 5 5 4 4 4.2

Ptn 5 5 4 5 3 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5 5 4 5 5 5 5 4 5 5 4 5 5 4.8

Msl 5 4 3 5 3 5 5 4 5 4 5 5 5 5 5 4 5 5 4 5 5 4 5 5 5 5 3 5 5 3 5 5 4.6

Drt 5 4 4 5 4 5 5 4 5 4 5 5 5 5 5 4 5 5 4 5 5 4 5 5 5 5 3 5 5 4 5 5 4.7

72

Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai

Tổ hợp: C7U4 Địa điểm: Trƣờng Sơn - Hòa Bình Ngày đo: 24/06/2016 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 TB

Hdc 6.5 5.5 5 4 5 3.5 5.8 5 6 4.5 6.5 4.5 5 5.5 4.2 5 6.2 3.5 4.5 4.5 4.8 5.5 5 4.5 5 6.5 4.3 5.4 5 4 6 5.2 5.0

Dtt 3 3 4 2 4 2 4 5 2 4 5 4 3 2 4 5 4 4 3 4 4 3 3 4 4 4 3 4 2 5 2 4 3.5

Dnc 4 3 5 4 3 5 5 4 5 5 3 4 3 5 4 3 5 3 3 4 4 4 5 4 3 5 3 4 4 5 4 4 4.0

Ptn 4 5 4 5 3 5 5 4 5 4 5 5 5 4 5 3 5 5 4 5 5 4 5 3 5 5 4 5 3 4 5 4 4.4

Msl 3 5 3 5 2 5 4 4 3 4 5 4 5 3 5 4 5 5 3 3 4 4 5 5 4 4 3 4 5 3 3 5 4.0

Drt 3 4 3 5 4 5 4 2 5 4 3 5 4 5 3 4 5 3 4 5 5 4 2 5 5 3 3 5 5 2 3 5 4.0

73

Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai

Tổ hợp: U4E1 Địa điểm: Trƣờng Sơn - Hòa Bình Ngày đo: 24/06/2016 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 TB

Hdc 4 5.5 5 4.2 5 3.5 4 5 6 4.5 3.5 4.5 5 5 4.5 5 5 4.5 4 5 3.5 5.5 5 4.5 5 4 3.5 5 4.5 3.5 3.5 4.5 4.5

Dtt 4 3 4 3 4 2 5 5 3 4 5 5 3 4 4 5 4 4 3 4 4 3 5 5 5 4 3 4 4 5 2 5 4.0

Dnc 3 3 5 2 3 5 4 4 5 5 3 4 3 5 5 3 5 2 3 4 5 4 5 4 3 5 5 4 3 5 4 5 4.0

Ptn 3 4 2 5 2 4 3 3 4 4 5 4 4 3 4 3 4 5 4 5 5 4 5 3 5 5 4 5 3 4 5 4 4.0

Msl 4 3 3 2 2 3 4 4 3 2 5 4 5 3 5 5 4 5 5 3 2 4 4 5 4 4 3 5 4 3 4 5 3.8

Drt 3 3 2 4 3 2 3 4 5 3 3 5 4 5 3 4 4 3 4 4 5 3 2 5 2 3 3 4 3 2 3 5 3.5

74

Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai

Tổ hợp: C4U4 Địa điểm: Trƣờng Sơn - Hòa Bình Ngày đo: 24/06/2016 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 TB

Hdc 3.5 2.5 4.2 3.5 4 3.5 4 3 2 4.5 3.5 4 4 3 3.5 4 2 3 4 4 3.5 3.2 4 4.2 3 4 3.5 3 2 3.5 3 3 3.4

Dtt 2 2 5 4 4 2 3 5 3 3 4 4 3 2 5 5 5 3 2 4 4 3 5 5 5 4 3 2 4 5 2 5 3.7

Dnc 4 3 4 2 3 4 4 3 5 5 3 4 3 5 5 3 5 2 3 5 5 4 5 4 3 4 5 4 3 3 4 5 3.9

Ptn 5 3 2 3 2 4 3 3 5 4 5 4 4 3 4 3 4 5 4 5 5 4 5 3 4 5 2 5 3 4 4 5 3.9

Msl 3 3 2 2 2 3 4 3 3 2 4 4 4 3 5 5 4 5 3 3 2 4 4 3 4 4 3 5 4 3 4 4 3.5

Drt 5 3 2 4 3 3 3 5 5 3 5 5 4 5 5 4 4 5 4 4 5 3 3 5 5 3 3 4 3 5 3 5 4.0

75

Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai

Tổ hợp: C7E5 Địa điểm: Trƣờng Sơn - Hòa Bình Ngày đo: 24/06/2016 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 TB

Hdc 1.5 1.2 2.5 2 1.5 1.2 1.8 2.5 1.5 2.5 2 2.5 2 3.2 2 2.5 2 3 2.2 2.8 2 2.4 1.2 2.3 1.5 2 1.8 1.5 1 2.5 1.5 2.5 2.0

Dtt 1 2 2 3 2 3 1 2 1 3 1 1 3 2 1 3 1 2 2 3 2 2 2 3 2 3 1 2 1 2 2 2 2.0

Dnc 3 2 3 2 3 4 4 3 3 3 3 4 3 3 4 3 3 2 3 3 3 4 3 3 2 3 3 2 2 4 3 4 3.0

Ptn 1 2 2 3 2 2 3 3 1 1 2 1 2 3 3 3 1 2 1 2 3 2 1 3 1 2 2 3 3 1 2 2 2.0

Msl 2 2 2 2 3 1 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 3 2 2 1 3 1 3 3 2 1 2 2 2 2.0

Drt 3 2 2 2 2 1 2 1 3 2 2 2 2 2 2 1 2 2 1 3 2 2 1 3 1 3 3 2 1 2 2 3 2.0

76

Phụ lục 5