PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

87
lượt xem 19
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhƣng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Tp. HCM, 8/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student BUI CACH TUYEN NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 HCMC, 9/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006
iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa
iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR.
v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR.
vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii TÓM TẮT.......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP ................................................................x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu ......................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu .........................................................................................2 1.3. Giới hạn đề tài ...................................................................................................2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía............................................................................................3 2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................3 2.1.2. Phân loại ....................................................................................................3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ...............................................................................3 2.1.4. Nhân giống ................................................................................................4 2.1.5. Sản lƣợng...................................................................................................4 2.1.6. Chế biến và sử dụng ..................................................................................5 2.2. Bệnh trên cây mía .............................................................................................5 2.3. Bệnh khảm lá mía .............................................................................................7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố ...............................................................................7 2.3.2. Triệu chứng................................................................................................7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh .....................................................................................8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía.....................................................9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh .............................................................9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế .............................................................................9 2.3.7. Phòng trừ .................................................................................................10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía ........................................10
vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh ......................................................10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi ......................................10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) ..............10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ...........................12 2.4. Bệnh cằn mía gốc ............................................................................................14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................14 2.4.2. Triệu chứng..............................................................................................14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài .....................................................................14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây ...............................................................15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh ...................................................................................16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh ..........................................................16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế ...........................................................................17 2.4.6. Kiểm soát bệnh ........................................................................................17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía .................17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi .......................17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học ..........................................................17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) ...............19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ...........19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc .................19 2.5.1. Trên thế giới ............................................................................................19 2.5.2. Trong nƣớc ..............................................................................................20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................22 3.1. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................22 3.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu .......................................................................22 3.3.2. Virus gây bệnh.........................................................................................22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh ...................................................................................22 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm ................................................................................23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ...................................................................................23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu .................................................................23
viii 3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA ............................24 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm .............................24 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA ..........................26 3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng ..................27 3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM ....................................................................................27 3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx ................28 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx..............................................29 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................31 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA.........................................31 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR .........................32 4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. ............................................................................................32 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy.......................36 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx ....................................................................37 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41 5.2. Đề nghị ............................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................43 PHỤ LỤC ................................................................................................................... xii
ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. ........................ 6 Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ..................... 30 Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi ........................................................................ 34 Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. .. 35 Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. .......................................................... 36 Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ..................................... 11 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR ................................................. 13 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra .......................................................................................... 24 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA ........................................................ 25 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA .......................................................... 25
x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cây mía ..................................................................................................... 3 Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía ............................................................... 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía ................................................................ 7 Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus ............................................................................ 8 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA......................................... 12 Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. ............................................. 15 Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). ..................................................... 16 Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. ..... 32 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) ........................ 34 Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). ............................................................... 35 Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). ...... 36 Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. ........................................................ xvi Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. .................................................................. xvi Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. ................................................ xvi Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. ....................... xvi Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. ................................................................ xvi Hình PL6. Gốc mía bị cằn. ....................................................................................... xvi Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. ................................................ xvii Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. ................ xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân........................................................................ xvii
xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: enzym linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay. TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng. RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid. ctv: Cộng tác viên. NCM: Màng nitrocellulose ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate. DEPC: Diethyl pyrocarbonate. dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate. p-NPP: p - nitrophenol phosphate. PVP: Polyvinylpyrrolidone. BSA: Bovine serum albumin. PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide. RNA: Ribonucleic acid. bp: Base pair. EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid. mRNA: Messenger RNA. PCR: Polymerase chain reaction. RNase: Ribonuclease. SCMV: Sugarcane Mosaic Virus. RSD: Ratoon stunting disease. Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli. STM: Stainning transpiration. TTPT: Trung tâm phân tích. Taq: Thermus aquaticus.
1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhƣng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ƣớc, 1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hƣởng đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc. Bệnh khảm lá mía do virus Sugarcane Mosaic gây ra là bệnh rất phổ biến và có ảnh hƣởng lớn đến ngành sản xuất mía đƣờng của nhiều nƣớc trên thế giới. Thiệt hại nghiêm trọng về năng suất đã đƣợc ghi nhận tại các vùng trồng mía lớn thuộc châu Mỹ, châu Úc; mức thiệt hại có thể lên đến 50% đối với các giống mẫn cảm (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh thƣờng gây hại ở các vùng ôn đới và ít hơn tại các vùng nhiệt đới. Cụ thể theo kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987), bệnh khảm lá mía đã xuất hiện nhƣng rải rác, thiệt hại gây ra chƣa ở mức đáng quan tâm. Chính vì vậy mà hiện nay ở nƣớc ta bệnh khảm lá mía chƣa đƣợc quan tâm đúng mức trên cả phƣơng diện thống kê giống – vùng bị bệnh và các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh hiệu quả. Do vậy việc điều tra phát hiện bệnh khảm lá trên các giống mía nhập nội và sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng nhằm thống kê lại tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía trên các giống khảo sát, kiểm định giống mới nhập nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm soát bệnh. Bệnh cằn mía gốc (RSD) gây ra bởi vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) đây là một loại vi khuẩn gram dƣơng nhỏ chỉ gây bệnh trên mía. Bệnh có thể gây tổn thất lên đến 50% tổng sản lƣợng mía thu đƣợc (Davis, 1980). Việc chẩn đoán phát hiện Lxx rất khó vì nó ít gây ra các triệu chứng lâm sàng đặc trƣng có thể phát hiện đƣợc trên đồng ruộng. Nhìn chung cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng
2 độ tuổi. Do vậy ngƣời sản xuất thƣờng lầm tƣởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị thiếu chất. Các phƣơng pháp phát hiện Lxx nhƣ là nhìn dƣới kính hiển vi, phát hiện bằng phƣơng pháp miễn dịch học,.v.v. cũng đƣợc phát triển nhƣng độ chính xác và độ nhạy chƣa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ cho công tác chọn giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm soát và quản lí bệnh có hiệu quả. Trƣớc tình hình trên, đƣợc sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện trên một số giống mía nhập nội và sản xuất tại tỉnh Bình Dƣơng (Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng) và Đồng Nai (Nông trƣờng Thọ Vực)”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. - Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005. - Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM (Stainning transpiration). - Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx. - Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía bằng kỹ thuật PCR. 1.3. Giới hạn đề tài - Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy không thể tiến hành điều tra khảo sát và theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trƣởng đƣợc. - Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khó nuôi cấy trên môi trƣờng.
3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 2.1.1. Lịch sử phát hiện Cây mía (Saccharum spp.) đã đƣợc biết từ rất lâu (cách nay khoảng 2200 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn Độ vào năm 326 trƣớc Công Nguyên họ đã thấy đƣợc cây mía (Hình 2.1). Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và ngƣời Ả Rập đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Công Nguyên trong quá trình chinh phục các miền đất của họ. Cây mía cũng đƣợc mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete, và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau công Hình 2.1. Cây mía nguyên. Vào những năm 1150 ngành công nghiệp mía đƣờng ở (Nguồn: Philipe Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30000 ha mía đƣợc Rott, 2000) trồng. Vào khoảng năm 1420 ngƣời Bồ Đào Nha đã đƣa cây mía đến Madeira nơi mà chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores. Nhà máy xử lí mía hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nƣớc cộng hòa Dominica. Sản phẩm đƣờng đƣợc đƣa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15. 2.1.2. Phân loại Cây mía thuộc họ Gramineae, giống Saccharum (S) là hỗn hợp của sáu loài cỏ lƣu năm thuộc giống Saccharum L., trong đó có hai loài hoang dại (S. spontaneum L. và S. robustum Brvaes & Jeswiet ex Grassl) và 4 loài cây trồng ở vƣờn (S. officinarum L., S. barberi Jeswiet, S. sinense Roxb., và S. edule Hassk . Bốn loài cây trồng ở vƣờn có sự lai giống phức tạp và luôn có thể giao phấn chéo với nhau. Tất cả các loại giống mía thƣơng mại đƣợc trồng hiện nay đều là các giống lai giữa các loài này với nhau. 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố Cây mía đƣợc cho là có nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dƣơng.  S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đông và nam Châu Phi, từ suốt vùng trung đông đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia, và từ suốt vùng Thái Bình Dƣơng đến New Guinea.
4  Trung tâm xuất xứ của cây mía có thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện giống S. robustum có số lƣợng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sông ở New Guinea và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.  S. officinarum còn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi.  S. barberi có thể có nguồn gốc ở Ấn Độ.  S. sinense có xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung Quốc và Triều Tiên.  S. edule là loại không thể sản xuất mùa màng nhƣ S. robustum và chỉ tìm thấy đƣợc ở New Guinea và các đảo kế cận. Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất mà cây mía đƣợc trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha. 2.1.4. Nhân giống Để nhân giống mía ngƣời ta thƣờng trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chƣa trƣởng thành có thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân này đƣợc gọi là "setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces". “Sett” đƣợc cho là tốt nhất nếu đƣợc lấy từ đốt thứ ba từ dƣới lên của cây mía vì chồi ở đốt này còn non và ít bị khô. “Sett” có thể đƣợc trồng xiên theo một góc 45OC hay cũng có thể đặt nằm ngang luôn lên trên luống. Ƣớc tính cần 12.500 - 20.000 “sett” để trồng hết 1 hecta. Mía là cây trồng quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trƣớc khi đƣợc đốn bỏ và trồng lại. Vụ đầu tiên đƣợc gọi là mía tơ và thƣờng mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trƣởng thành, nó phụ thuộc vào vùng địa lý. Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trƣởng thành và thƣờng thì sau khoảng hai vụ mía gốc là ngƣời ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống. 2.1.5. Sản lƣợng Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đƣờng (sucrose) trên hecta ở Barbardos. Sản lƣợng cao nhất đạt đƣợc ở Hawaii là 22 tấn sucrose trên hecta, nhƣng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới có thể đạt đƣợc trạng thái thành thục ở khu vực này. Sản lƣợng mía đã đƣợc cải thiện và gia tăng đáng
5 kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử dụng phân bón, kiểm soát đƣợc côn trùng và các loại bệnh, cơ giới hóa đồng ruộng và nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao. 2.1.6. Chế biến và sử dụng Trƣớc khi sản phẩm đƣờng đƣợc làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm trƣớc công nguyên, nhờ vào việc đun sôi dịch chiết nƣớc mía thì cây mía ban đầu đƣợc trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thôi. Ngày nay cây mía đƣợc nhiều ngành công nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi và có giá trị của mỗi quốc gia. - Khoảng 1 tấn đƣờng thô có thể thu đƣợc khi chế biến 8 - 9 tấn mía. Loại đƣờng thô màu nâu này có thể đƣợc tinh chế thành đƣờng trắng sạch hơn. - Cây mía đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ không riêng gì việc sản xuất ra đƣờng:  Mật đƣờng là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đƣờng, nó là chất lắng xuống khi không còn khả năng kết tinh thành đƣờng. Gần 2,7% mật đƣờng hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đƣờng đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: dùng để làm phân bón cho đất trồng mía, đƣợc vô trùng và lên men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau nhƣ cồn vô trùng, rƣợu rum, hay ethyl alcohol.  Sản phẩm còn lại sau quá trình ép nƣớc mía đó là bã mía đƣợc dùng nhƣ là nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đƣờng, nó còn đƣờc dùng để làm giấy, bìa cứng, bảng và tƣờng bằng giấy ép cứng. 2.2. Bệnh trên cây mía Theo thống kê ở các nƣớc trồng mía hiện nay thì có tất cả 126 bệnh hại mía trên thế giới (Philippe Rott, 2000), trong đó có 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại đƣợc gây ra bởi 8 nhóm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1. Trong đó bệnh do virus là loại bệnh khó kiểm soát nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣ bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v. Bệnh do nấm gây ra có số lƣợng nhiều nhất cũng nhƣ là gây thiệt hại nhiều nhất nhƣ bệnh đốm vòng (Ring spot), bệnh mốc sƣơng (Downy mildew), bệnh than (Smut).
6 Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây mía (Haø Ñình Tuaán, 2004). Nhóm tác nhân gây bệnh Số lƣợng bệnh gây ra 1. Bệnh do virus 9 2. Bệnh do phytoplasma 2 3. Bệnh do vi khuẩn 9 4. Bệnh do nấm 68 5. Tuyến trùng và chƣa rõ tác nhân 24 6. Thực vật bán ký sinh 3 7. Dinh dƣỡng, môi trƣờng 9 8. Hình hƣởng của thuốc trừ cỏ 2 Tổng cộng 126 Vi khuẩn gây ra 4 loại bệnh nghiêm trọng là bệnh gôm (Gumming), bệnh cháy lá (Leaf scald), bệnh cằn mía gốc (Ratoon strunting disease) và bệnh sọc đỏ (Red stripe). Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên mía cây mía (Philippe Rott, 2000) Chú thích: A: Bệnh khảm lá mía; B: Bệnh vàng gân lá (YLSD); C: Bệnh thối đỏ; D: Bệnh than (Smut); E: Bệnh gôm (Gumming disease); F: Bệnh cằn mía gốc.