Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X, gây ra bởi đột biến gen F8, dẫn đến tình trạng thiếu hụt yếu tố đông máu (FVIII) ở nhiều mức độ. T Bài viết trình bày việc tối ưu quy trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 494 - THÁNG 9 - SỐ 1 - 2020 40% các bệnh nhân bị glôcôm đã sử dụng thuốc 2. Đinh Thu Trang (2015), Phân tích hoạt động trên 4 tuần, tỉ lệ này cao hơn gấp đôi nhóm bệnh của các nhà thuốc đạt tiêu chuẩn "thực hành tốt nhà thuốc" GPP trên địa bàn thành phố Thủ Dầu nhân không bị glôcôm (p
vietnam medical journal n01 - SEPTEMBER - 2020 Background: Hemophilia A is an X-linked, trong nhóm bệnh hemophilia A thể nặng là recessively inherited bleeding disorder, caused by tương đối cao (20-30%) [3]. mutations of the F8 gene that leads to a deficiency of coagulation factor (FVIII) in many levels. Among Để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 có those, mutation intron 22 inversion is account for nhiều phương pháp được sử dụng như: Southern approximately 40% of severe hemophilia A cases. To Blot, Inversion PCR (I-PCR) và Long - distance provide another tool for this mutation detection, our PCR (LD-PCR) [1] [4] [5] [6]. Tuy nhiên, các research group at the National Institute of Hematology phương pháp trên đều có nhược điểm là thời - Blood Transfusion developed a new RT-PCR protocol gian thực hiện kéo dài và không ổn định. Trong based on RNA samples. Aims: To optimize RT-PCR assay for detection of intron 22 inversion. Patients nghiên cứu của Debargh Dutta và cộng sự and Methods: The study was performed on 32 (2016), tác giả sử dụng kỹ thuật PCR phiên mã samples of severe hemophilia A patient and 3 samples ngược kết hợp với kỹ thuật PCR lồng (RT-NPCR) of carrier at the National Institute of Hematology - nhằm khuếch đại 2 phản ứng độc lập. Đối với Blood Transfusion. Using RT-PCR technique, adapted người mang đột biến đảo đoạn intron 22, mRNA from Debargh Dutta et al (2016), perform two amplification reactions simultaneously, including: có cấu trúc bị đứt gãy từ exon 22 và một phần reaction 1 for amplifying fragment from exon 22 to còn lại của intron 22[7]. Vì vậy, thiết kế mồi đặc exon 23; reaction 2 for amplifying fragment from exon hiệu khuếch đại từ exon 19 đến stop codon của 19 to the first in-frame stop codon within intron 22. intron 22 nhằm phát hiện được người mang đột Results: The optimal condition of RT-PCR is: 50oC/30 biến đảo đoạn intron 22. Bên cạnh đó, một phản minutes; 95oC/2 minutes, [94oC/15 seconds, 60oC/45 ứng độc lập khác được thiết kế khuếch đại từ seconds, 68oC/60 seconds] x 40 cycles, 68oC/5 minutes. The limit of detection is 10-200 ng/µl, which exon 22 đến exon 23 có vai trò là một phản ứng corresponds to 30-600 ng RNA. RT-PCR technique kiểm chứng, luôn cho sản phẩm ở người có allen detected 6 patients with intron 22 inversion, 3 bình thường. Nghiên cứu đã xây dựng được quy carriers, 26 samples without intron 22 inversion; trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng exactly coincided with the Long-distance PCR kỹ thuật RT-NPCR, với kết quả thực hiện hoàn technique. Conclusions: Optimized RT-PCR for detection of intron 22 inversion. This method can be toàn trùng khớp với kỹ thuật I-PCR. [7] Phương used as reliability and accuracy means in diagnosis of pháp này chính xác và đơn giản nhưng thời gian intron 22 inversion. thực hiện vẫn dài và dễ bị nhiễm chéo do thực hiện 2 vòng phản ứng. Để khắc phục nhược I. ĐẶT VẤN ĐỀ điểm của kỹ thuật RT-NPCR, chúng tôi tiến hành Bệnh Hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là nghiên cứu với mục tiêu: Tối ưu hóa quy trình bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X, dẫn đến giảm gây bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR. nồng độ hoạt tính yếu tố VIII trong máu. Gen tổng hợp yếu tố VIII (F8) có kích thước 186 kb, II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU bao gồm 26 exon, nằm ở vị trí locus 28 thuộc Đối tượng nghiên cứu: 32 mẫu máu ngoại cánh dài trên nhiễm sắc thể X (Xq28) [2] [3]. vi của bệnh nhân hemophilia A thể nặng Có rất nhiều đột biến gen F8 đã được xác (FVIII
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 494 - THÁNG 9 - SỐ 1 - 2020 (kích thước 225 bp trong phản ứng 1 và 378 bp mẫu người bệnh (HA) cho sản phẩm PCR có kích trong phản ứng 2) [7] thước 10 kb và 11 kb, người bình thường cho Kỹ thuật LD-PCR: Kỹ thuật LD-PCR được thực sản phẩm có kích thước 10 kb và 12 kb, người hiện dựa trên nghiên cứu của Liu Q và cộng sự lành mang gen cho sản phẩm có kích thước 10 (1998), sử dụng các mồi A, B, P, Q khuếch đại kb, 11 kb và 12 kb. các đoạn trình tự có kích thước lớn, trong đó, Bảng 1: Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 Exon22 Phản ACCAATGATTATTCACGGCATCAAGA Kích thước FWD2 ứng 1 băng: 225 bp Exon23 REV TGCAAACGGATGTATCGAGCAATAA Exon19 Phản TGCTGGGATGAGCACACTTTT Kích thước FWD2 ứng 2 băng: 378 bp INT22 REV CAATTCTTTCCATTTTCCAAGACACCGTG Các bước nghiên cứu: Tách chiết RNA: 2 Điện di gel Agarose: Điện di 15 µl sản phẩm ml máu ngoại vi thu thập được từ các mẫu PCR trên gel agarose 2% (Serva, Đức), sử dụng nghiên cứu được tách bạch cầu bằng hóa chất hệ thống điện di NanoPac-300 (Cleaver Red Blood Cell Lysis Buffer (Bio-World, Mỹ), sau Scientific, UK) và hệ thống chụp ảnh điện di đó tiến hành tách chiết RNA tổng số sử dụng Multidoc-IT (Cleaver Scientific, UK). sinh phẩm Mag-Bind® Total RNA 96 kit (Omega, So sánh kết quả: 32 mẫu nghiên cứu sau khi Mỹ). RNA được kiểm tra chất lượng và nồng độ phân tích bằng phương pháp RT-PCR được thực trên máy đo quang phổ (Nanodrop, Thermo hiện phân tích đối chiếu bằng quy trình LD-PCR Fisher, Mỹ). là quy trình chuẩn đã và đang được áp dụng tại Phản ứng RT-PCR: Phản ứng RT-PCR được Khoa Di truyền Sinh học phân tử, Viện Huyết học tiến hành sử dụng sinh phẩm SuperScriptTM III – Truyền máu TW. Kết quả mỗi mẫu từ hai One-Step RT PCR Mix (ThermoFisher, Mỹ). phương pháp được phân tích đánh giá mức độ Thành phần phản ứng khuếch đại: tổng thể tích trùng khớp. 25 µl bao gồm: 12,5 µl Reaction Mix; 1µl Exon22 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FWD2, 1µl Exon23 REV (Phản ứng 1) hoặc 1µl 3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi: Để tối ưu Exon19 FWD2, 1µl INT22 REV (Phản ứng 2); 1µl hóa nhiệt độ gắn mồi của phản ứng RT-PCR phát enzyme Taq Plantinum; 3 µl RNA; 7,5 µl H2O. hiện đột biến đảo đoạn intron 22, chúng tôi tiến Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR: 50oC/ 30 hành khảo sát 5 nhiệt độ gắn mồi bao gồm: phút; 95oC/ 2 phút, [94oC/15 giây, 56oC - 56oC, 58oC, 60oC, 62oC và 64oC. Kết quả khảo sát 64oC/45 giây, 68oC/60 giây]x 34 - 45 chu kỳ, được thể hiện trong Hình 1. 68oC/5 phút. Hình 1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi. (A), (B), (C), (D), (E) lần lượt là hình ảnh điện di sản phẩm PCR với nhiệt độ gắn mồi lần lượt là 56oC, 58oC, 60oC, 62oC và 64oC. Trong đó, các mẫu được thực hiện bao gồm: C (mẫu người mang gen), HA (bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22), NC (đối chứng âm), H2O (đối chứng nước). Nhận xét: Tại 56oC và 58oC, sản phẩm PCR D cho thấy tại nhiệt độ gắn mồi 60oC, sản phẩm tại trong phản ứng 2 chứa nhiều sản phẩm phụ; tại phản ứng 2 có tín hiệu rõ nét hơn tại 62oC. 64oC, sản phẩm PCR trong phản ứng 1 có tín hiệu 3.2 Tối ưu số chu kỳ nhiệt: Thực hiện kém hơn nhiệt độ gắn mồi 60oC và 62 oC. Hình C và phản ứng RT-PCR ở 3 mức chu kì nhiệt là 35, 40, 121
vietnam medical journal n01 - SEPTEMBER - 2020 45 chu kỳ để xác định chu kỳ nhiệt tối ưu. Kết quả được thể hiện trong Hình 2. Trong đó, các mẫu được thực hiện bao gồm: C (mẫu người lành mang gen), HA (bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22), NC (người bình thường), H2O (kiểm chứng nước). Hình 4. So sánh kết quả phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ thuật RT-PCR (mẫu RNA) và kỹ thuật LD-PCR (mẫu DNA). (A), (B) lần lượt là hình ảnh điện di sản phẩm PCR của kỹ thuật RT-PCR và kỹ thuật LD-PCR. Hình 2. Tối ưu số chu kỳ nhiệt. (A), (B), (C) Nhận xét: Kết quả thu được trùng khớp lần lượt là hình ảnh điện di sản phẩm PCR với số hoàn toàn giữa 2 kỹ thuật, trong 35 mẫu có 6 chu kỳ là 35 chu kỳ, 40 chu kỳ và 45 chu kỳ. mẫu có đảo đoạn intron 22, 3 mẫu carier, 26 Nhận xét: Trong số 3 mức chu kỳ khảo sát, mẫu không có đảo đoạn intron 22. Hình ảnh điện với 30 chu kỳ PCR, mẫu bệnh nhân (HA) và người di sản phẩm PCR so sánh giữa kỹ thuật RT-PCR lành mang gen (C) cho tín hiệu yếu và không rõ và LD-PCR của một số mẫu thể hiện ở Hình 4. nét. Với 40 chu kỳ, sản phẩm PCR cho tín hiệu rõ IV. BÀN LUẬN nét hơn 30 chu kì. Bên cạnh đó, với phản ứng Đột biến đảo đoạn intron 22 là đột biến có thực hiện 45 chu kỳ, mẫu âm tính lên băng sản tần suất xuất hiện cao, ở khoảng 40% bệnh phẩm không đặc hiệu và trùng kích thước với mẫu nhân hemophilia A thể nặng [2]. Phát hiện đột bệnh nhân (HA) và người mang gen (C). biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia A 3.3 Xác định giới hạn phát hiện: Để xác có vai trò quan trọng trong chẩn đoán, điều trị định giới hạn phát hiện của phản ứng, thực hiện và dự đoán nguy cơ sinh chất ức chế. Bên cạnh PCR trên mẫu người lành mang gen, với nồng độ đó, phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 còn có khuôn RNA là 400 ng/µl, 200 ng/µl, 100 ng/µl, ý nghĩa trong việc xác định người mang gen, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 10 ng/µl, 5 ng/µl, 1 ng/µl. chẩn đoán trước sinh để ngăn ngừa và giảm tình trạng sinh con mắc bệnh, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh cho cộng đồng. Để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22, các phòng xét nghiệm có thể sử dụng một trong số các phương pháp như Southern Blot, LD-PCR, I-PCR. Trong đó, kỹ thuật kinh điển là LD-PCR của nhóm tác giả Liu Q và cộng sự (1996) có ưu điểm là chính xác, mẫu đầu vào là DNA nên đơn giản trong quá trình chuẩn bị và thao tác. Tuy nhiên, nhược điểm là khó chuẩn hóa và thời gian thực hiện kéo dài do khuếch đại vùng trình tự Hình 3: Giới hạn phát hiện của phản ứng kích thước lớn và giàu GC [4], [8]. Đối với kỹ RT-PCR thuật I-PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt giới Nhận xét: Phản ứng RT-PCR cho sản phẩm hạn BclI để phân cắt DNA tổng số qua đêm, sau tại nồng độ RNA là 5-400 ng/µl ở phản ứng 1 và đó thực hiện phản ứng nối và phản ứng khuếch 10-200 ng/µl ở phản ứng 2. đại sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu. Hình ảnh 3.4 So sánh kết quả: Trong đó, các mẫu điện di sản phẩm I-PCR cho kết quả sắc nét, thời được thực hiện bao gồm: C (mẫu người lành gian điện di nhanh, đã khắc phục nhược điểm mang gen), HA (bệnh nhân mang đột biến đảo của kỹ thuật LD-PCR. Tuy nhiên, kỹ thuật này có đoạn intron 22), NC (người bình thường), H2O thời gian thực hiện kéo dài, gặp khó khăn trong (kiểm chứng nước). việc sử dụng enzyme giới hạn BclI phân cắt DNA tổng số và tinh sạch sản phẩm sau phản ứng cắt 122
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 494 - THÁNG 9 - SỐ 1 - 2020 [8]. Đến năm 2016, Debargh Dutta và cộng sự được điều kiện thực hiện tối ưu của phản ứng phát triển kỹ thuật RT-NPCR, đây được coi là kỹ RT-PCR là: 50oC/30 phút; 95oC/2 phút, [94oC/15 thuật chính xác, đơn giản và tiết kiệm hơn [8]. giây, 60oC/45 giây, 68oC/60 giây]x 40 chu kỳ, Dựa trên nghiên cứu của Debargh Dutta và 68oC/5 phút. So với nghiên cứu của Debargh cộng sự (2016), chúng tôi thực hiện tối ưu quy Dutta và cộng sự (2016), phản ứng RT-PCR có trình phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 gây một số sự thay đổi. Sự thay đổi này do thực hiện bệnh hemophilia A thể nặng bằng kỹ thuật RT- trên hóa chất PCR, nồng độ mồi cũng như điều PCR. Trong nghiên cứu của Debargh Dutta và kiện thiết bị khác nhau. Bên cạnh đó, sử dụng cộng sự (2016), tác giả xây dựng quy trình kỹ dải nồng độ mẫu đầu vào, chúng tôi xác định thuật PCR phiên mã ngược kết hợp với kỹ thuật được khoảng nồng độ cho phản ứng PCR từ 10- PCR lồng (RT-NPCR). Kỹ thuật này có ưu điểm là 200ng/µl, tương ứng 30-600 ng RNA. Đây là độ nhạy cao do sản phẩm PCR được khuếch đại khoảng nồng độ tương đối rộng, phù hợp với qua hai vòng phản ứng. Tuy nhiên, đột biến đảo điều kiện triển khai thực tế, kể cả trường hợp đoạn intron 22 là đột biến di truyền nguyên lượng mẫu đầu vào ít, ví dụ như đối tượng cần phát, có thể phát hiện được bằng phản ứng PCR xét nghiệm là trẻ nhỏ hoặc mẫu dịch ối. Thực đơn. Chính vì vậy, để tiết kiệm thời gian thực hiện phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 bằng hiện và tránh nhiễm chéo do thực hiện 2 vòng kỹ thuật RT-PCR đối với 35 mẫu máu ngoại vi. của phản ứng Nested PCR, trong nghiên cứu Độ chính xác của kỹ thuật được xác định bằng này, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR để cách đối chiếu kết quả với kỹ thuật LD-PCR, kết phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22. quả thu được trùng khớp hoàn toàn với kỹ thuật Để xây dựng quy trình phát hiện đột biến đơn LD-PCR. giản, tiết kiệm thời gian nhưng vẫn chính xác và Qua quá trình tối ưu hóa, chúng tôi nhận thấy có độ nhạy cao, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa kỹ thuật RT-PCR có ưu điểm là tiết kiệm thời gian, các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR, bao bao gồm tách chiết RNA (1 tiếng), RT-PCR (2 gồm: nhiệt độ gắn mồi, số chu kỳ nhiệt. tiếng), điện di (1,5 tiếng); đơn giản do kết quả Với mục đích tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi của thu được ngay sau khi thực hiện phản ứng PCR phản ứng RT-PCR phát hiện đột biến đảo đoạn đơn. Hơn nữa, đối chiếu kết quả với kỹ thuật LD- intron 22, chúng tôi tiến hành khảo sát 5 nhiệt PCR, cho thấy kỹ thuật có độ chính xác và độ tin độ gắn mồi bao gồm: 56oC, 58oC, 60oC, 62oC và cậy cao. Nhưng nhược điểm của kỹ thuật là không 64oC. Kết quả khảo sát được thể hiện trong Hình có khả năng phân biệt đột biến đảo đoạn intron 1. Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR có 22 type 1 và type 2. Tuy nhiên, theo các y văn kích thước tương tự theo nghiên cứu của trên thế giới, đột biến đảo đoạn intron 22 type 1 Debargh Dutta và cộng sự (2016). Tại 60 oC, hình và type 2 không có sự khác biệt về điều trị bệnh ảnh điện di cho kết quả rõ ràng nhất, vì vậy và giá trị tiên lượng bệnh[2]. Chính vì vậy, kỹ nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 60oC. Thực hiện phản thuật RT-PCR có thể triển khai và ứng dụng để ứng RT-PCR ở 3 mức chu kỳ nhiệt là 35, 40, 45 chẩn đoán phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 chu kỳ để xác định chu kỳ nhiệt tối ưu. Kết quả gây bệnh hemophilia A thể nặng. trong Hình 2 thể hiện số chu kỳ nhiệt tối ưu là 40 chu kỳ. Nhằm xác định giới hạn phát hiện của V. KẾT LUẬN phản ứng, thực hiện PCR trên mẫu người lành Từ các kết quả nghiên cứu nói trên, chúng tôi mang gen, với nồng độ khuôn RNA là 400ng/µl, đã tối ưu thành công quy trình phát hiện đột 200ng/µl, 100ng/µl, 50ng/µl, 25 ng/µl, 10ng/µl, biến đảo đoạn intron 22 trên gen F8 gây bệnh 5ng/µl, 1ng/µl. Kết quả trên Hình 3 cho thấy, hemophilia A bằng kỹ thuật RT-PCR. Quy trình nếu thực hiện phản ứng RT-PCR với nồng độ xét nghiệm này đạt độ chính xác và tin cậy cao, RNA là 5ng/µl và 400ng/µl, phản ứng 2 không có có khả năng ứng dụng trong chẩn đoán tại các sản phẩm đặc hiệu. Như vậy, để ứng dụng trong cơ sở khám chữa bệnh Hemophilia. chẩn đoán, chúng tôi đưa ra giới hạn phát hiện TÀI LIỆU THAM KHẢO của kỹ thuật là 10-200ng/µl, tức 30-600ng RNA. 1. Vũ Thị Bích Hường, Nguyễn Minh Phương, Lê Thực hiện phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 Xuân Hải. (2012). Ứng dụng kỹ thuật Long- bằng kỹ thuật RT-PCR trên 35 mẫu máu ngoại vi range PCR phát hiện đảo đoạn intron 22 trong của 32 bệnh nhân thể nặng và 3 người lành bệnh hemophilia A thể nặng tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương. Tạp chí Y học Việt Nam. mang gen, là mẹ bệnh nhân và đối chiếu với kỹ Tập 396. tr126-130 thuật LD-PCR. Kết quả thu được hoàn toàn trùng 2. Pruthi R. K. (2005). Hemophilia: a practical khớp giữa hai kỹ thuật. approach to genetic testing. Mayo Clinic Sau khi tối ưu các yếu tố trên, chúng tôi thu proceedings, 80(11), 1485–1499. 123