Phát hiện đột biến gen cKIT trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy có chuyển vị t(8;21)(q22;q22)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN cKIT TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP  <br /> DÒNG TỦY CÓ CHUYỂN VỊ t(8;21)(q22;q22) <br /> Phan Thị Xinh*,**, Hoàng Anh Vũ* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA khảo sát đột biến gen cKIT trên bệnh nhân (BN) bạch <br /> cầu cấp dòng tủy (BCCDT) có chuyển vị t(8;21)(q22;q22). <br /> Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 15 BN BCCDT có t(8;21) và/hoặc có biểu hiện AML1‐<br /> ETO được khảo sát đột biến gen cKIT từ exon 8 đến exon 17 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ 05/2012 <br /> đến 05/2013. <br /> Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi khuếch đại được sản phẩm PCR dài 1751 bp từ exon 7 đến exon <br /> 21 cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến trong vùng từ exon 8 đến exon 17 của cKIT. Phân tích kết quả <br /> của 15 BN phát hiện 5 BN (33,3%) có đột biến, trong đó BN6 mang cùng lúc 2 kiểu đột biến cho thấy có tiên <br /> lượng xấu do không đáp ứng với điều trị hóa trị liệu và dị ghép tủy. Các kiểu đột biến trong nghiên cứu gồm <br /> D816V, D816Y, N822K và N822Y, là các đột biến thường gặp đã được báo cáo. <br /> Kết luận: Xây dựng thành công quy trình khảo sát đột biến gen cKIT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học, <br /> giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn trên nhóm BN BCCDT có t(8;21). <br /> Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy, t(8;21)(q22;q22), đột biến cKIT. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF cKIT MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENT  <br /> WITH t(8;21)(q22;q22) TRANSLOCATION <br /> Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu  <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 277 ‐ 231 <br /> Background: Detection of cKIT mutations in acute myeloid leukemia (AML) patient with t(8;21)(q22;q22) <br /> translocation using direct DNA sequencing technique. <br /> Methods: Bone marrow samples of 15 AML patients with t(8;21) and/or AML1‐ETO expression were used <br /> for detection of cKIT mutations from exons 8 to exon 17 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from <br /> May 2012 to May 2013. <br /> Result: In this study, we were able to amplify PCR product of 1751 bp, expanding from exon 7 to exon 21 of <br /> cKIT,  which  harbored  almost  all  mutations  within  exon  8  to  exon  17.  Analyzing  the  DNA  sequences  of  15 <br /> patients, we detected 5 patients (33.3%) carrying cKIT mutations. Among 5 patients positive for cKIT mutation, <br /> Patient  6  had  2  kinds  of  mutation  and  poor  prognosis  without  response  to  chemotherapy  and  allogeneic  bone <br /> marrow transplantation. Mutations  in  this  study  are  previously  reported,  including  D816V,  D816Y,  N822K, <br /> and N822Y. <br /> Conclusion: We successfully developed a procedure for detecting cKIT mutation at Blood Transfusion and <br /> Hematology Hospital, which may help to divide AML patients with t(8;21) to different prognostic groups. <br /> Key words: acute myeloid leukemia, t(8;21), cKIT mutation. <br /> <br /> * Đại  học Y Dược TP.HCM <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh  <br /> <br /> Huyết Học<br /> <br /> ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. <br /> ĐT: 0932728115  <br /> Email:<br /> <br /> 227<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> <br /> Bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT)  là  bệnh  lý <br /> ác  tính  về  máu  đặc  trưng  bởi  sự  tăng  sinh  quá <br /> mức tế bào non trong tủy xương và trong  máu <br /> gây giảm 3 dòng tế bào máu bình thường. Dựa <br /> vào  bất  thường  nhiễm  sắc  thể  (NST)  và  gen, <br /> BCCDT được chia thành 3 nhóm tiên lượng tốt, <br /> trung  bình  và  xấu.  Nhóm  tiên  lượng  tốt  gồm <br /> những bệnh nhân (BN) có mang chuyển vị NST <br /> t(8;21)(q22;q22), <br /> t(15;17)(q22;q12‐21) <br /> và <br /> inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22),  trong  đó <br /> nhóm t(15;17) có bệnh cảnh lâm sàng đặc biệt là <br /> BCCDT thể M3 có tiên lượng rất tốt với điều trị <br /> phối hợp hóa trị liệu chuẩn và ATRA, còn nhóm <br /> t(8;21)  và  inv(16)/t(16;16)  thì  đáp  ứng  với  phác <br /> đồ điều trị hóa trị liệu cytarabine ‐ anthracycline <br /> không đồng nhất(5,10). Một số nghiên cứu trên thế <br /> giới  cho  thấy  khoảng  46%  BN  với  t(8;21)  và <br /> inv(16)/t(16;16)  có  thêm  đột  biến  ở  exon  8  và <br /> exon  17  của  gen  cKIT  sẽ  tái  phát  sớm  sau  lui <br /> bệnh hoàn toàn(1,6,7). Vì thế, hướng dẫn của Mạng <br /> Lưới  Ung  Thư  Quốc  Gia  của  Hoa  Kỳ  đề  nghị <br /> khảo sát đột biến cKIT thường quy trong nhóm <br /> BN  có  chuyển  vị  NST  t(8;21)  và  inv(16)/t(16;16) <br /> và những BN này nếu có kèm đột biến cKIT thì <br /> được xếp vào nhóm tiên lượng trung bình. <br /> <br /> Đối tượng <br /> <br /> Có  nhiều  kiểu  đột  biến  cKIT  được  tìm  thấy <br /> trong BCCDT với t(8;21) như đột biến thêm hoặc <br /> mất  đoạn  tại  exon  8  dẫn  tới  mất  amino  acid <br /> aspartic  tại  codon  419,  đột  biến  cKIT‐ITD  tại <br /> exon 11, 12 hoặc đột biến điểm làm thay đổi cấu <br /> trúc  trong  vùng  tyrosine  kinase  (exon  17).  Đột <br /> biến  trên  exon  17  phổ  biến  nhất  là  D816V  và  ít <br /> phổ biến hơn là D816Y, D816H, D816F và D816I <br /> hoặc  đột  biến  điểm  tại  một  số  codon  khác  như <br /> 821, 822 và 823(8). <br /> Tại  Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  học <br /> (BVTMHH)  mỗi  năm  có  khoảng  30  BN  mới <br /> được  chẩn  đoán  BCCDT  có  t(8;21).  Việc  chẩn <br /> đoán đột biến gen cKIT một nhu cầu rất cần thiết <br /> giúp bác sĩ lâm sàng phân nhóm nguy cơ và lựa <br /> chọn hướng điều trị phù hợp cho bệnh nhân. <br /> <br /> 228<br /> <br /> 15  mẫu  tủy  xương  của  BN  bạch  cầu  cấp <br /> dòng  tủy  (BCCDT)  lúc  chẩn  đoán  có  biểu  hiện <br /> chuyển  vị  t(8;21)(q22;q22)  bằng  kỹ  thuật  lai  tại <br /> chỗ  phát  huỳnh  quang  (FISH)  hoặc  biểu  hiện <br /> AML1‐ETO  bằng  kỹ  thuật  khuếch  đại  gen  sao <br /> chép  ngược  (RT‐PCR)  tại  BVTMHH  từ  tháng <br /> 5/2012 đến tháng 5/2013. <br /> <br /> Phương pháp <br /> RT–PCR <br /> Mẫu  tủy  trong  chống  đông  EDTA  được  xử <br /> lý loại hồng cầu  và  ly  trích  RNA  từ  máu  ngoại <br /> biên  bằng  RNeasy  Mini  Kit  (Qiagen,  Hoa  Kỳ). <br /> cDNA  được  tổng  hợp  từ  1  μg  RNA  với <br /> Superscript  II  reverse  transcriptase  (Invitrogen, <br /> Hoa  Kỳ)  theo  hướng  dẫn  của  nhà  sản  xuất.  Để <br /> khuếch  đại  đoạn  gen  cKIT  từ  exon  8  đến  exon <br /> 17,  chúng  tôi  thiết  kế  mồi  xuôi  F1  (5’‐<br /> TGTCCAATTCTGACGTCAAT‐3’)  nằm  trên <br /> exon  7  và  mồi  ngược  R1  (5’‐<br /> TCAGACATCGTCGTGCACAAGC‐3’) <br /> nằm <br /> trên  exon  21  bằng  phần  mềm  Oligo  4.1. <br /> Polymerase  dùng  cho  PCR  là  Takara  Taq  HS <br /> (Takara,  Nhật  Bản).  Chương  trình  luân  nhiệt <br /> trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied <br /> Biosystems,  Hoa  Kỳ)  trong  45  chu  kỳ  với  nhiệt <br /> độ  bắt  cặp  là  60oC.  Sản  phẩm  PCR  được  kiểm <br /> chứng  bằng  điện  di  trên  thạch  1,2%  (Hình  1), <br /> tinh  sạch  bằng  QIAquick  Gel  extraction  kit <br /> (Qiagen, Hoa Kỳ). <br /> Giải trình tự chuỗi DNA <br /> Thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với <br /> BigDye Terminator v3.1 sử dụng sản phẩm PCR <br /> đã được tinh sạch theo hai chiều xuôi và ngược. <br /> Các mồi dùng cho cycle sequencing gồm có F1, <br /> F2, F3, F4 và R1 (Hình 1). Sau khi kết tủa bằng <br /> ethanol, biến tính trong Hi‐Di formamide ở 960C <br /> trong 2 phút, sản phẩm được đọc trình tự bằng <br /> máy  ABI  3130  Genetic  Analyzer  và  dữ  liệu  thô <br /> được phân tích bằng phần mềm SeqScape. <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> cKIT<br /> F1<br /> 1<br /> <br /> F2<br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 1500 bp<br /> <br /> F3<br /> <br /> F4<br /> <br /> R<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1751 bp<br /> <br /> 750 bp<br /> <br /> 1. Thang chuẩn 1 kb<br /> 2. Nước<br /> 3. Mẫu bệnh nhân 1<br /> 4. Mẫu bệnh nhân 2<br /> <br />  <br /> Hình 1: Vị trí mồi và sản phẩm PCR <br /> mặt  tế  bào  và  đã  được  xác  định  có  chuyển  vị <br /> <br /> KẾT QUẢ  <br /> Trong BCCDT, vùng gen cKIT thường xảy ra <br /> đột biến là từ exon 8 đến exon 17. Sử dụng cặp <br /> mồi F1 và R1, chúng tôi đã khuếch đại được sản <br /> phẩm PCR dài 1751 bp phủ từ exon 7 đến exon <br /> 21 (Hình 1) cho phép nhận diện hầu hết các kiểu <br /> đột  biến  điểm,  mất  đoạn  hay  chèn  đoạn  có  thể <br /> xảy ra trên cKIT. <br /> Các bệnh nhân trong nghiên cứu được chẩn <br /> <br /> t(8;21) và/hoặc biểu hiện tổ hợp gen AML1‐ETO, <br /> là bất thường NST và gen đặc hiệu của BCCDT. <br /> Phân  tích  trình  tự  cKIT  của  15  BN  gồm  8  BN <br /> nam  và  7  BN  nữ,  chúng  tôi  phát  hiện  5  BN  có <br /> đột biến cKIT, chiếm 33,3%. Đột biến trong 5 BN <br /> là các đột biến điểm, trong đó BN6 có 2 kiểu đột <br /> biến  và  2  thay  đổi  acid  amin  M541L,  L862L  có <br /> tính đa hình (Bảng 1). <br /> <br /> đoán BCCDT dựa vào lâm sàng, tủy đồ, dấu bề <br /> Bảng 1: Kết quả FISH, RT‐PCR và đột biến cKIT  <br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> <br /> Tuổi<br /> 56<br /> 49<br /> 10<br /> 26<br /> 37<br /> 37<br /> 45<br /> 19<br /> 47<br /> 52<br /> 24<br /> 25<br /> 16<br /> 48<br /> 26<br /> <br /> Giới<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nữ<br /> <br /> FISH (% tế bào dương tính)<br /> t(8;21) (13,5%)<br /> t(8;21) (94,5%)<br /> t(8;21) (96%)<br /> <br /> t(8;21) (92%)<br /> t(8;21) (85,5%)<br /> t(8;21) (97,5%)<br /> t(8;21) (96%)<br /> t(8;21) (95,5%)<br /> t(8;21) (98%)<br /> t(8;21) (95,5%)<br /> <br /> RT-PCR<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> AML1/ETO<br /> <br /> c-KIT<br /> WT<br /> D816V<br /> WT<br /> WT<br /> WT<br /> M541L, D816Y, N822K, L862L<br /> WT<br /> WT<br /> WT<br /> WT<br /> D816V<br /> WT<br /> WT<br /> N822Y<br /> D816Y<br /> <br /> Đột  biến  thường  gặp  nhất  là  vị  trí  D816  và <br /> <br /> (Hình 2A) gặp trong BN6 và BN15 và D816V là <br /> <br /> N822  trên  exon  17.  D816  có  nhiều  biến  thể, <br /> <br /> thay  đổi  aspartic  acid  thành  valine  (Hình  2B) <br /> <br /> D816Y  là  thay  đổi  aspartic  acid  thành  tyrosine <br /> <br /> gặp trong BN2 và BN11. <br /> <br /> Huyết Học<br /> <br /> 229<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br />  <br /> Hình 2: Các kiểu đột biến cKIT phát hiên trên bệnh nhân. <br /> 2 kiểu đột biến và 2 biến thể (đa hình) phát hiện trên BN6 (A), và hình ảnh đột biến D816V (B) <br /> <br /> BÀN LUẬN <br /> <br /> số nghiên cứu khác đã khảo sát ảnh hưởng của <br /> <br /> Bằng việc thay đổi điều kiện nhiệt độ bắt cặp <br /> mồi  từ  58oC  đến  64oC  và  sử  dụng  Takara  Taq <br /> HS,  chúng  tôi  đã  khuếch  đại  thành  công  sản <br /> phẩm PCR  đặc  hiệu  dài  1751  bp  từ  exon  7  đến <br /> exon 21 ở nhiệt bắt cặp 60oC. Giải trình tự DNA <br /> sản  phẩm  PCR  trên  đã  giúp  phát  hiện  các  kiểu <br /> đột biến thường gặp trên BN BCCDT. <br /> <br /> các kiểu đột biến cKIT trên nhóm BN có t(8;21) <br /> <br /> Kết quả khảo sát đột biến cKIT trên 15 BN <br /> BCCDT <br /> <br /> có <br /> <br /> t(8;21) <br /> <br /> và/hoặc <br /> <br /> biểu <br /> <br /> hiện <br /> <br /> AML1/ETO cho thấy 33,3% BN có đột biến. Các <br /> đột  biến  được  phát  hiện  gồm  D816V,  D816Y, <br /> N822K,  N822Y  (Bảng  1)  là  các  đột  biến  đã <br /> được báo cáo nằm trên exon 17 có ảnh hưởng <br /> đến  tiên  lượng  bệnh(4,9).  Cairoli  và  cộng  sự <br /> nghiên cứu trên 49 BN có t(8;21) cho thấy 22% <br /> BN biểu hiện đột biến cKIT, và theo dõi 5 năm <br /> sau  khi  điều  trị  bằng  phác  đồ  hóa  trị  liệu <br /> chuẩn  cho  thấy  tỉ  lệ  tái  phát  cao  ở  nhóm  BN <br /> mang đột biến cKIT exon 17 (70%) so với nhóm <br /> không  mang  đột  biến  (36%)(1,7).  Ngoài  ra,  một <br /> <br /> 230<br /> <br /> và kết quả cho thấy đột biến cKIT exon 17 ảnh <br /> hưởng  đến  tiên  lượng  bệnh,  làm  tăng  tỉ  lệ  tái <br /> phát  so  với  đột  biến  cKIT  ở  các  vị  trí  khác(1,9). <br /> Trong nghiên cứu này, mặc dù chúng tôi chưa <br /> theo dõi điều trị vì số lượng BN ít và thời gian <br /> điều trị ngắn dưới 24 tháng, nhưng BN6 mang <br /> cùng  lúc  2  kiểu  đột  biến  D816Y  và  N822K  đã <br /> tái  phát  sớm  ngay  sau  khi  ngưng  hóa  trị  liệu <br /> giai đoạn củng cố 2 và cũng tái phát vào ngày <br /> thứ  35  sau  khi  được  dị  ghép  tế  bào  gốc  tạo <br /> máu, cho thấy BN có tiên lượng rất xấu kháng <br /> với các phương pháp điều trị hiện tại.  <br /> Đột biến cKIT trong BCCDT là đột biến tăng <br /> chức  năng  và  bị  ức  chế  bởi  các  thuốc  ức  chế <br /> tyrosine  kinase,  vì  vậy  các  nghiên  cứu  gần  đây <br /> đề  nghị  phối  hợp  hóa  trị  liệu  với  các  thuốc  ức <br /> chế  tyrosine  kinase  trong  điều  trị  nhóm  BN <br /> mang t(8;21) có đột biến cKIT nhằm cải thiện tiên <br /> lượng và kéo dài thời gian sống cho BN(2,3). <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> KẾT LUẬN <br /> Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình <br /> khảo  sát  đột  biến  gen  cKIT  trong  BCCDT.  Kết <br /> quả  của  nghiên  cứu  giúp  các  bác  sĩ  lâm  sàng <br /> phân nhóm tiên lượng chính xác hơn trên nhóm <br /> BN  có  t(8;21)  nhằm  lựa  chọn  phác  đồ  điều  trị <br /> phù hợp cho BN, để có hiệu quả điều trị cao hơn <br /> đặc biệt trên nhóm BN có đột biến cKIT. <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO <br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Cairoli  R,  Beghini  A,  Grillo  G,  et al.  Prognostic  impact  of  cKIT <br /> mutations  in  core  binding  factor  leukemias:  an  Italian <br /> retrospective study. Blood 2006;107(9):3463‐3468. <br /> Jae  HP, Cyrus  VH, Martin  ST.  Blood consult:  acute  myeloid <br /> leukemia and the t(8;21)(q22;22). Blood 2011;117(10):2775‐2777. <br /> Jitakshi De, Reza Z, Michele H, et al. Immunophenotypic Profile <br /> Predictive  of  cKIT  Activating  Mutations  in  AML1‐ETO <br /> Leukemia. Am J Clin Pathol 2007;128:550‐557. <br /> Kim HJ, Ahn HK, Jung CW, et al. KIT D816 mutation associates <br /> with  adverse  outcomes  in  core  binding  factor  acute  myeloid <br /> leukemia,  especially  in  the  subgroup  with  RUNX1/RUNX1T1 <br /> rearrangement. Ann Hematol. 2013;92(2):163‐71. <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Longley  BJ,  Reguera  MJ,  Ma  Y.  Classes  of  c‐KIT  activating <br /> mutations: proposed mechanisms of action and implications for <br /> disease classification and therapy. Leuk Res 2001;25(7):571‐6. <br /> 6. Park  SH,  Chi  HS,  Min  SK,  et  al.  Prognostic  impact  of  c‐KIT <br /> mutations in core binding factor acute myeloid leukemia. Leuk <br /> Res 2011;35(10):1376‐83. <br /> 7. Pollard  JA,  Alonzo  TA,  Gerbing  RB,  et  al.  Prevalence  and <br /> prognostic  significance  of  KIT  mutations  in  pediatric  patients <br /> with  core  binding  factor  AML  enrolled  on  serial  pediatric <br /> cooperative trials for de novo AML. Blood 2010;115(12):2372‐9. <br /> 8. Renneville  A,  Roumier  C,  Biggio  V,  et  al.  Cooperating  gene <br /> mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. <br /> Leukemia 2008, 22: 915–931. <br /> 9. Schnittger S, Kohl TM, Haferlach T, et al. cKIT‐D816 mutations <br /> in  AML1‐ETO‐positive  AML  are  associated  with  impaired <br /> event‐free and overall survival. Blood 2006;107(5):1791‐1799. <br /> 10. Shimada  A,  Taki  T,  Tabuchi  K,  et  al.  KIT  mutations,  and  not <br /> FLT3 internal tandem duplication, are strongly associated with <br /> a  poor  prognosis  in  pediatric  acute  myeloid  leukemia  with <br /> t(8;21):  a  study  of  the  Japanese  Childhood  AML  Cooperative <br /> Study Group. Blood 2006;107(5):1806‐9. <br /> <br />  <br /> Ngày nhận bài báo:  <br /> <br />  <br /> <br />  <br /> <br /> 24/10/2013 <br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo:  <br /> <br /> 20/11/2013 <br /> <br /> Ngày bài báo được đăng:  <br /> <br /> 05/01/2014 <br /> <br />  <br /> <br />  <br /> <br /> Huyết Học<br /> <br /> 231<br /> <br />