Phát hiện đột biến p.R132H của gen IDH1 trong u thần kinh đệm bằng kỹ thuật ASO-PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN p.R132H CỦA GEN IDH1<br /> TRONG U THẦN KINH ĐỆM BẰNG KỸ THUẬT ASO-PCR<br /> Hoàng Anh Vũ*, Đỗ Phú Quang**, Trần Minh Thông***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Đột biến các gen IDH là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng trong u thần kinh đệm<br /> (UTKĐ). Đột biến p.R132H của gen IDH1 do thay đổi từ guanine thành adenine tại nucleotide 395 là thường<br /> gặp nhất trong những đột biến này. Chúng tôi xây dựng quy trình kỹ thuật ASO-PCR để xác định được đột biến<br /> này trên bệnh phẩm mô vùi nến của UTKĐ.<br /> Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện trên 33 mẫu UTKĐ từ Bệnh Viện Chợ Rẫy. Mẫu<br /> được tách chiết DNA bằng bộ kít ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ). Kỹ thuật giải trình<br /> tự DNA được thực hiện trên một số mẫu đầu tiên để chọn chứng dương có mang đột biến p.R132H. Mồi đặc<br /> hiệu cho alen mang đột biến được thiết kế và tối ưu hóa điều kiện ASO-PCR trên chứng dương và ứng dụng vào<br /> xác định đột biến cho những mẫu còn lại trong nghiên cứu.<br /> Kết quả: ASO-PCR sử dụng 3 mồi trong cùng một phản ứng cho phép khuếch đại đặc hiệu những mẫu có<br /> mang đột biến p.R132H, được kiểm chứng bằng giải trình tự DNA. Chúng tôi phát hiện 11 trường hợp đột biến<br /> trong 28 mẫu UTKĐ độ II và III (39,3%), nhưng không có đột biến nào trong 5 trường hợp UTKĐ độ I hoặc IV.<br /> Kết luận: ASO-PCR có thể được sử dụng trong bước sàng lọc đột biến p.R132H của gen IDH1 trong<br /> UTKĐ.<br /> Từ khóa: U thần kinh đệm, gen IDH1, đột biến, ASO-PCR.<br /> ABSTRACT<br /> DETECTION OF IDH1 GENE MUTATION (p.R132H) IN GLIOMAS BY ASO-PCR<br /> Hoang Anh Vu, Do Phu Quang, Tran Minh Thong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - No 5 - 2015: 281 - 285<br /> <br /> Objectives: IDH gene mutational status is one of the important prognostic factors in gliomas. The p.R132H<br /> mutation in IDH1 gene due to a substitution from guanine to adenine at nucleotide 395 is the most common of<br /> these mutations. We establish an ASO-PCR procedure to identify this mutation from paraffin blocks of gliomas.<br /> Materials and Methods: The study was performed with 33 glioma samples collected from Cho Ray<br /> Hospital. Samples were DNA extracted using FFPE gDNA ReliaprepTM Miniprep System kit from Promega,<br /> USA. Some first samples were investigated by DNA sequencing technique to select positive control carrying<br /> p.R132H mutation. Specific primer for mutant allele was designed and ASO-PCR conditions with positive<br /> control were optimized and applied to verify the mutation in the remaining samples.<br /> Results: ASO-PCR using 3 primers in one reaction allows amplifying specifically p.R132H mutant<br /> samples, confirmed by DNA sequencing. We detected 11 mutations in 28 cases of WHO grade II and III gliomas<br /> (39.3%), but not any mutation in 5 cases of WHO grade I and IV gliomas (glioblastoma).<br /> Conclusion: ASO-PCR can be used in the screening step of IDH1 gene mutations (p.R132H) in gliomas.<br /> Key words: Gliomas, IDH1 gene, mutations, ASO-PCR.<br /> <br /> *<br /> Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> ** ***<br /> Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Pháp Việt. Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy.<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ ĐT: 0122-2993537, Email: hoangvuxinh@yahoo.com<br /> 281<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ (2,1%), p.R132S (1,6%) và p.R132L (A), làm cơ sở cho việc triển khai nghiên<br /> chẩn đoán và tiên lượng đều phụ thuộc vào cứu sâu rộng hơn các dấu ấn sinh học có giá trị<br /> quyết định chủ quan của các nhà giải phẫu bệnh, trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh này trên<br /> nên vẫn còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế. Vì bệnh nhân Việt Nam.<br /> thế, việc nghiên cứu tìm ra các dấu ấn sinh học<br /> khách quan hơn, giúp tiên lượng bệnh là rất ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> quan trọng. Gần đây, người ta có thể chia UTKĐ Đối tượng<br /> thành 5 nhóm chính(4) dựa trên 3 dấu ấn của khối Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến gen<br /> u là đột biến vùng khởi động gen TERT, đột biến IDH1 cho những bệnh phẩm được chẩn đoán là<br /> các gen IDH và mất đoạn đồng thời của nhiễm u sao bào (một loại u điển hình trong UTKĐ) với<br /> sắc thể 1p và 19q. Sự phân chia này có ý nghĩa về cấp độ từ I đến IV được lưu trữ tại Khoa Giải<br /> mặt tiên lượng bệnh và hứa hẹn sẽ sớm được Phẫu Bệnh - Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ<br /> đưa vào ứng dụng trong lâm sàng. Chí Minh, trong giai đoạn từ tháng 12/2013 đến<br /> Trong UTKĐ, các đột biến gen IDH được xác tháng 06/2015. Nghiên cứu đột biến gen được<br /> định xảy ra ở gen IDH1 hoặc IDH2. Hơn 90% các thực hiện tại Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử -<br /> đột biến được ghi nhận trên gen IDH1, tập trung Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> tại codon R132 của exon 4, với các loại khác nhau<br /> Phương pháp<br /> được mô tả như sau: đột biến thay thế p.R132H<br /> (c.395G>A) thường gặp nhất, chiếm khoảng Tách chiết genomic DNA<br /> 92,4%, theo sau là p.R132C (3,2%), p.R132G Bệnh phẩm là mô vùi nến đã sử dụng để<br /> <br /> <br /> <br /> 282<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> chẩn đoán giải phẫu bệnh. Các mẫu được chọn tính 2 phút ở 960C và làm lạnh đột ngột trong đá<br /> khi tiêu bản nhuộm HE có ít nhất 50% số tế bào bào. Trình tự DNA được xác định bằng máy giải<br /> u. Genomic DNA được tách chiết bằng bộ kít trình tự ABI 3130 Genetic Analyzer với POP-7<br /> ReliaprepTM FFPE gDNA Miniprep System polymer và capillary 50 cm. Kết quả được phân<br /> (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà tích bằng phần mềm CLC Main Workbench.<br /> sản xuất. Thiết kế mồi cho ASO-PCR<br /> Khuếch đại exon 4 của gen IDH1 bằng kỹ thuật Mồi xuôi IDH1-MUF (5’-<br /> PCR AAACCTATCATCATAGGCCA-3’), bổ sung<br /> Một cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm đặc hiệu với alen mang đột biến c.395G>A, được<br /> CLC Main Workbench dựa trên trình tự chuẩn chúng tôi thiết kế và tổng hợp bởi Integrated<br /> của gen IDH1 mang accession number DNA Technologies (Mỹ). Trong mồi IDH1-MUF,<br /> NG_023319 trong GenBank để khuếch đại exon 4 vị trí nucleotide đầu tiên của đầu tận 3’ đã được<br /> có mang codon R132. Trình tự mồi xuôi IDH1-F: thay thế từ G sang A. Đồng thời, để tăng tính đặc<br /> 5’-GTGGAAATCACCAAATGGCA-3’; mồi hiệu của mồi, vị trí nucleotide thứ 3 của đầu tận<br /> ngược: IDH1-R: 5’- 3’ cũng đã được thay thế từ T sang C(5).<br /> AGATACCAAAAGATAAGAAT-3’). Mồi được KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> đặt tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies<br /> (Mỹ). Kỹ thuật PCR được thực hiện với cặp mồi Đặc điểm mẫu nghiên cứu<br /> đặc hiệu đã được thiết kế và bộ kit TaKaRa Có tất cả 33 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân<br /> TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản). được chọn vào nghiên cứu, gồm 16 nam và 17<br /> Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện nữ. Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 6 tuổi, lớn nhất là<br /> trên máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức), 55 tuổi, với số trung vị là 30,5 tuổi. Vì mục tiêu<br /> bao gồm giai đoạn biến tính DNA ban đầu ở chính của nghiên cứu là thiết lập kỹ thuật phát<br /> 980C trong 3 phút. Tiếp theo, phản ứng tổng hợp hiện đột biến bằng ASO-PCR nên chúng tôi tập<br /> chuỗi DNA được thực hiện với 50 chu kỳ gồm 3 trung chọn những mẫu bệnh phẩm được xếp<br /> bước: biến tính ở 980C trong 10 giây, thực hiện loại độ mô học có tần suất đột biến cao nhất: 3<br /> phản ứng lai ở 540C trong 20 giây, sau đó là tổng mẫu độ I, 15 mẫu độ II, 13 mẫu độ III và 2 mẫu<br /> hợp mạch mới ở 720C trong 30 giây. Phản ứng độ IV.<br /> được kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở Phát hiện đột biến IDH1 bằng kỹ thuật giải<br /> 720C trong 2 phút. Sản phẩm PCR được phát trình tự DNA<br /> hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có<br /> Trong giai đoạn đầu của nghiên cứu này,<br /> nhuộm ethidium bromide và quan sát với hệ<br /> chúng tôi cần phát hiện được mẫu chứng dương<br /> thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ).<br /> có mang đột biến c.395G>A (p.R132H) để tiến<br /> Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng<br /> hành chuẩn hóa điều kiện ASO-PCR. Exon 4 của<br /> QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) theo<br /> gen IDH1 có mang codon R132 được khuếch đại<br /> hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và được<br /> từ DNA của 12 mẫu bệnh phẩm, sau đó được<br /> kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,5%.<br /> giải trình tự theo hai chiều. Chúng tôi phát hiện<br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA 3 mẫu có mang đột biến gen IDH1 tại codon<br /> Sản phẩm PCR đã được tinh sạch được chạy R132 (Hình 1), trong đó 1 trường hợp đột biến<br /> phản ứng cycle sequencing với BigDye c.394C>G (p.R132G) và 2 trường hợp đột biến<br /> terminator v3.1 (Applied Biosystem, Mỹ) theo cả c.395G>A (p.R132H). Một trong hai mẫu có đột<br /> 2 chiều xuôi và ngược, sau đó được kết tủa bằng biến c.395G>A được sử dụng cho nghiên cứu<br /> ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến tiếp theo.<br /> <br /> <br /> <br /> 283<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> Sử dụng quy trình ASO-PCR đã được tối ưu<br /> hóa, chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến<br /> c.395G>A cho 21 mẫu UTKĐ còn lại. Hình 2B<br /> minh họa hình ảnh điện di một số sản phẩm<br /> ASO-PCR, trong đó mẫu không có đột biến chỉ<br /> biểu hiện 1 sản phẩm 240 bp, trong khi mẫu<br /> mang đột biến có cả 2 sản phẩm 240 bp và 137<br /> bp. Trong số 21 mẫu được khảo sát bằng ASO-<br /> PCR, chúng tôi phát hiện thêm 9 trường hợp có<br /> mang đột biến c.395G>A. Các kết quả này hoàn<br /> toàn phù hợp sau khi được kiểm chứng lại bằng<br /> giải trình tự DNA các sản phẩm 240 bp đã được<br /> tách ra từ băng điện di.<br /> Như vậy, chúng tôi đã phát hiện 12 trường<br /> hợp có mang đột biến ở codon R132 của gen<br /> IDH1 trong tổng số 33 mẫu UTKĐ, chiếm tỷ lệ<br /> chung là 36,4% (1 trường hợp p.R132G và 11<br /> Hình 1: Hai kiểu đột biến gen IDH1 được phát hiện<br /> trường hợp p.R132H). Đột biến p.R132H chỉ<br /> bằng giải trình tự DNA<br /> được phát hiện trên các mẫu UTKĐ độ II (6/15<br /> Phát hiện đột biến IDH1 bằng kỹ thuật hay 40%) và độ III (5/13 hay 38,5%); 5 mẫu độ I<br /> ASO-PCR và IV không phát hiện có đột biến. Mặc dù<br /> Kỹ thuật ASO-PCR lần đầu tiên được mô nghiên cứu này có số mẫu nhỏ, nhưng bước<br /> tả trong nghiên cứu các tế bào ác tính ở bệnh đầu cho thấy đột biến gen IDH1 chủ yếu gặp ở<br /> nhân đa u tủy(2). Đây là kỹ thuật rất nhạy, cho UTKĐ độ II và III (11/28 hay 39,3%), phù hợp<br /> phép phát hiện bất thường về gen của 1 tế bào với kết quả của nhiều nghiên cứu khác trên<br /> ác tính trong quần thể 104-105 tế bào bình thế giới(4,9,12).<br /> thường(2,7). Để thực hiện ASO-PCR phát hiện Ngoài đột biến p.R132H của gen IDH1, giải<br /> đột biến p.132RH của gen IDH1 trong UTKĐ, trình tự DNA sẽ cho phép xác định được những<br /> chúng tôi dùng 3 mồi trong cùng 1 phản ứng đột biến khác của gen IDH1 và IDH2(8,11). Tuy<br /> khuếch đại gen (Hình 2A). Mồi IDH1-F và nhiên, kỹ thuật ASO-PCR của chúng tôi có thể<br /> IDH1-R đóng vai trò của chứng nội tại, tạo sản được lựa chọn như phương pháp sàng lọc ban<br /> phẩm có kích thước 240 bp. Chỉ có những mẫu đầu giúp phát hiện khoảng 40% các trường hợp<br /> khuếch đại được đoạn gen này mới được đánh có mang đột biến. Kỹ thuật này có những lợi<br /> giá tiếp theo xem có hay không có mang đột điểm chính là chính xác, nhanh chóng và dễ thực<br /> biến c.395G>A. Vì mồi IDH1-MUF được thiết hiện(1). Với hệ thống khuếch đại gen thường quy<br /> kế bổ sung đặc hiệu với alen đột biến nên cặp sẵn có trong nhiều cơ sở giải phẫu bệnh có kèm<br /> mồi IDH1-MUF và IDH1-R chỉ hoạt động để chẩn đoán phân tử, toàn bộ quy trình kỹ thuật<br /> tạo sản phẩm 137 bp trên những mẫu có mang chẩn đoán đột biến bằng ASO-PCR có thể thực<br /> đột biến c.395G>A. Chúng tôi đã thay đổi các hiện trong vòng 1 ngày làm việc. Trong thời gian<br /> tỷ lệ khác nhau của 3 mồi trong mỗi phản ứng tới, ASO-PCR kết hợp với giải trình tự DNA sẽ<br /> và nhận thấy tỷ lệ hoạt động tốt nhất là IDH1- được chúng tôi tiến hành trên nghiên cứu với số<br /> F/IDH1-MUF/IDH1-R = 1/2/2, với nhiệt độ bắt mẫu lớn hơn để đánh giá chính xác giá trị tiên<br /> cặp tối ưu được xác định ở 540C. lượng của đột biến các gen IDH trong UTKĐ.<br /> <br /> <br /> <br /> 284<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: (A) ASO-PCR được thực hiện bằng 3 mồi, trong đó mồi IDH1-MUF chỉ khuếch đại alen đột biến. (B)<br /> Hình điện di sản phẩm ASO-PCR (giếng 2-15) với băng 240 bp là chứng nội và băng 137 bp là sản phẩm tương<br /> ứng với những mẫu có đột biến p.R132H. Giếng 1: thang chuẩn DNA; giếng 16: nước.<br /> 6. Porter KR, McCarthy BJ, Freels S, et al (2010). Prevalence<br /> KẾT LUẬN estimates for primary brain tumors in the United States by<br /> age, gender, behavior, and histology. Neuro Oncol;12(6):520-7.<br /> Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình 7. Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Grardel-Duflos N, et al<br /> ASO-PCR giúp xác định được đột biến p.R132H (2002). Several types of mutations of the ABL gene can be<br /> của gen IDH1 thường gặp nhất trong UTKĐ. Kết found in chronic myeloid leukemia patients resistant to<br /> STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment.<br /> quả bước đầu phát hiện 39,3% mẫu UTKĐ độ II Blood;100(3):1014-8.<br /> và III có mang đột biến, làm cơ sở cho những 8. Sanson M, Marie Y, Paris S, et al (2009). Isocitrate<br /> dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important<br /> nghiên cứu sâu hơn, quy mô lớn hơn về đột biến<br /> prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol;27(25):4150-4.<br /> các gen IDH trong UTKĐ. 9. Sonoda Y, Kumabe T, Nakamura T, et al (2009). Analysis of<br /> IDH1 and IDH2 mutations in Japanese glioma patients.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Cancer Sci;100(10):1996-8.<br /> 1. Ashraf S, Noguera NI, Di Giandomenico J, et al (2013). Rapid 10. Trần Minh Thông (2007). Đặc điểm giải phẫu bệnh của 1187<br /> detection of IDH2 (R140Q and R172K) mutations in acute ca u sao bào. Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh;11(3):41-46.<br /> myeloid leukemia. Ann Hematol;92(10):1319-23. 11. Van Den Bent Mj, Dubbink HJ, Marie Y, et al (2010). IDH1 and<br /> 2. Billadeau D, Quam L, Thomas W, et al (1992). Detection and IDH2 mutations are prognostic but not predictive for outcome<br /> quantitation of malignant cells in the peripheral blood of in anaplastic oligodendroglial tumors: a report of the<br /> multiple myeloma patients. Blood;80(7):1818-24. European Organization for Research and Treatment of Cancer<br /> 3. Dahse R, Berndt A, Dahse AK, et al (2008). Two allele-specific Brain Tumor Group. Clin Cancer Res;16(5):1597-604.<br /> PCR assays for screening epidermal growth factor receptor 12. Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E, et al (2010). Integrated<br /> gene hotspot mutations in lung adenocarcinoma. Mol Med genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of<br /> Report;1(1):45-50. glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA,<br /> 4. Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015). IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell;17(1):98–110.<br /> Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter<br /> Mutations in Tumors. N Engl J Med;372(26):2499-508.<br /> 5. Liu J, Huang S, Sun M, et al (2012). An improved allele- Ngày nhận bài báo: 20/08/15<br /> specific PCR primer design method for SNP marker analysis<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/06/2015<br /> and its application. Plant Methods;8(1):34.<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/09/2015<br /> <br /> <br /> <br /> 285<br />