Phát hiện và định lượng hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNA<br /> BẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTION<br /> VỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNG<br /> Nguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Người nhiễm virus viêm<br /> gan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ đó gây ra cái chết của khoảng 500,000 –<br /> 700,000 người mỗi năm. Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR ra đời để định lượng HBV-DNA chính xác hơn, nhanh<br /> hơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi trong cả nước.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định<br /> lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả được tiến hành trên 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan<br /> B. Tất cả bệnh nhân được định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng của bộ<br /> môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT. Kết quả được so sánh với kết quả real-time PCR sử<br /> dụng đường chuẩn thương mại. Sự tương đồng giữa hai kỹ thuật được chứng minh qua test Wilcoxon, test<br /> Spearman và biểu đồ Bland và Altman.<br /> Kết quả nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR với<br /> nhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM và độ nhạy của phản ứng là<br /> 100 copies/ml. Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt<br /> chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. Từ đó, chúng tôi đã phát hiện và định lượng<br /> được HBV-DNA ở 34 trong 46 trường hợp. So sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương<br /> mại, kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có sự tương đồng.<br /> Kết luận: Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng<br /> HBV- DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT.<br /> Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain Reaction<br /> WITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDS<br /> Nguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 182 - 189<br /> Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis. People infected with chronic<br /> hepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death of<br /> about 500.000 to 700.000 patients every year. Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNA<br /> more accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country.<br /> Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve to<br /> quantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patient's blood sample tested for hepatitis B.<br /> *<br /> <br /> Bộ môn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch<br /> <br /> Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Trần Minh Thắng<br /> <br /> 182<br /> <br /> ĐT 0934.014.937<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Research Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B. All<br /> patients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve of<br /> Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Results were<br /> compared with real-time PCR results using standard curve commercial. The similarities between the two<br /> techniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph.<br /> Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique with<br /> primer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probe<br /> and the sensitivity of reaction was 100 copies / ml. Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is<br /> 100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B. Since<br /> then, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases. Compared with real-time PCR results<br /> using standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows the<br /> similarities.<br /> Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA with<br /> self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of<br /> Medicine.<br /> Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề đang<br /> rất được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới<br /> hiện nay. Nhiễm virus viêm gan B là một trong<br /> những nguyên nhân làm tăng tỉ lệ mắc bệnh và<br /> tăng tỉ lệ tử vong toàn cầu(1,15).<br /> HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh<br /> viêm gan cấp hoặc mãn. Mặc dù việc sử dụng<br /> vắc xin đã hiện hữu trong hai thập kỷ qua nhưng<br /> vẫn có khoảng 360 triệu người trên thế giới bị<br /> nhiễm virus viêm gan B mãn tính(15). Người<br /> nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với<br /> những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ người<br /> lành mang mầm bệnh không triệu chứng đến xơ<br /> gan và ung thư tế bào gan. Trong đó, xơ gan và<br /> ung thư tế bào gan là các nguyên nhân chính<br /> gây ra cái chết của 500,000 – 700,000 người mỗi<br /> năm(15).<br /> Việc chẩn đoán và theo dõi lâm sàng của<br /> nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên sự<br /> phát hiện kháng nguyên (HBsAg, HBeAg),<br /> kháng thể (anti HBs, anti HBc và anti HBe)<br /> bằng kỹ thuật ELISA và chất liệu di truyền của<br /> virus (HBV – DNA) dựa trên kỹ thuật sinh học<br /> phân tử. Trong đó, xét nghiệm ELISA vẫn là<br /> một trong các phương pháp chính để phát hiện<br /> người nhiễm virus viêm gan B. Tuy nhiên, kết<br /> <br /> quả của ELISA không phản ánh được chính<br /> xác lượng virus trong huyết thanh hay hoạt<br /> động của virus viêm gan B cũng như hiệu quả<br /> của điều trị thuốc kháng virus(16). Bên cạnh đó,<br /> khoảng mười năm gần đây, xét nghiệm PCR(14),<br /> các phương pháp lai bắt RNA:DNA(11), phương<br /> pháp khuếch đại tín hiệu bởi bDNA(7,11) ... là<br /> các xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao<br /> trong việc phát hiện HBV – DNA cũng được sử<br /> dụng rộng rãi. Mặc dù vậy trên thực tế, các<br /> phương pháp này bị giới hạn vì khả năng dễ<br /> lây nhiễm chéo của mẫu thử trong quá trình<br /> thao tác kỹ thuật và tốn nhiều thời gian trong<br /> giai đoạn điện di sau thí nghiệm nên không<br /> thích hợp để thực hiện thường qui trong thực<br /> chẩn đoán cận lâm sàng(8,13,14). Một phương<br /> pháp chính xác hơn, nhanh hơn và cho hiệu<br /> suất cao hơn để định lượng HBV – DNA và<br /> định genotype của virus viêm gan B, đó là<br /> Real-time PCR(12). Hiện nay, đây là phương<br /> pháp hữu dụng trong việc theo dõi hiệu quả<br /> của điều trị, phát hiện các đột biến đề kháng<br /> thuốc và tái phát sau khi ngưng điều trị.<br /> Mục đích của nghiên cứu này là bước đầu<br /> thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA<br /> trên nền tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR<br /> phát hiện vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 183<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> dựng và sử dụng các đoạn dò huỳnh quang<br /> Taqman.<br /> <br /> môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường<br /> ĐHYKPNT xây dựng.<br /> <br /> Chúng tôi hi vọng từ nghiên cứu này có<br /> thể đưa ra thêm một phương pháp xét nghiệm<br /> HBV-DNA đáp ứng về chất lượng và giá<br /> thành hợp lý, giúp phát hiện và theo dõi kết<br /> quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan<br /> B. Bên cạnh đó, còn có thể sử dụng hóa chất<br /> của các hãng khác nhau.<br /> <br /> Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng Real-time<br /> PCR<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> –<br /> <br /> PHƯƠNG<br /> <br /> PHÁP<br /> <br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Mô tả các trường hợp bệnh.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Tất cả các bệnh nhân đến xét nghiệm viêm<br /> gan B tại BVĐHYD cơ sở 2 có HBsAg dương<br /> tính và HBeAg dương tính trong khoảng thời<br /> gian từ 30/08/2009 đến 30/12/2009.<br /> Loại trừ những bệnh nhân bị viêm gan B mà<br /> HBsAg âm tính hay HBeAg âm tính hay cả hai<br /> đều âm tính và những bệnh nhân không đồng ý<br /> tham gia nghiên cứu.<br /> <br /> Các bước tiến hành<br /> Lấy máu<br /> Lấy 4 ml máu và cho vào 2 tube chống<br /> đông bằng EDTA, mỗi tube 2 ml máu. 1 tube<br /> lưu giữ tại BVĐHYD cơ sở 2 để làm xét<br /> nghiệm, 1 tube gửi về bộ môn Hóa Sinh – Sinh<br /> học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Tại phòng<br /> thí nghiệm ở bộ môn, các mẫu máu sẽ được ly<br /> tâm tách huyết thanh lưu trữ -20oC.<br /> Ly trích DNA<br /> Được thực hiện theo quy trình của bộ High<br /> Pure PCR Template Preparation Kit (Roche).<br /> Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR<br /> Trình tự của cặp mồi<br /> Mồi HBV dùng để khuếch đại đoạn pre-S<br /> của virus viêm gan B. Sản phẩm khuếch đại có<br /> kích thước 89bp, từ vị trí nucleotide 730 – 819.<br /> Đoạn mồi được cung cấp bởi nhà sản xuất IDT<br /> (Intergrated DNA Technologies, USA) do bộ<br /> <br /> 184<br /> <br /> Phản ứng Real-time PCR là một phản ứng<br /> nhạy và cho kết quả định lượng rất chính xác.<br /> Tuy nhiên, cũng như phản ứng PCR thông<br /> thường, Real-time PCR có thể bị ức chế bởi một<br /> số thành phần tồn tại ngay trong chính phản<br /> ứng như hàm lượng bản mẫu, nhiệt độ bắt cặp<br /> của mồi, nồng độ của mẫu dò… Chính vì vậy,<br /> chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện<br /> cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo<br /> ra phản ứng Real-time PCR với hiệu quả tối ưu<br /> nhất, bao gồm: Nhiệt độ bắt cặp của mồi, Khảo<br /> sát nồng độ mồi, Khảo sát nồng độ mẫu dò<br /> Taqman.<br /> Độ lập lại của phản ứng Real-time PCR<br /> Đây cũng là một yếu tố quan trọng. Trên<br /> cùng một mẫu, kết quả thu nhận có thể khác<br /> nhau giữa các lần thí nghiệm cũng như giữa các<br /> phòng thí nghiệm. Khả năng gây ra sự khác biệt<br /> này có thể là do thao tác của người thực hiện, sự<br /> biến động của các thành phần hóa chất trong<br /> phản ứng Real-time PCR(4),… Để đánh giá độ<br /> lập lại của phản ứng Real-time PCR, chúng tôi<br /> tiến hành khảo sát độ lập lại của phản ứng trong<br /> cùng một lần thí nghiệm và giữa các lần thí<br /> nghiệm(10).<br /> Đường chuẩn<br /> Đường chuẩn là một khái niệm rất quan<br /> trọng và chuyên biệt cho phản ứng Real-time<br /> PCR. Thông qua đường chuẩn giúp chúng ta có<br /> thể xác định một cách chính xác hàm lượng acid<br /> nucleic trong mẫu ta cần quan tâm. Ngoài ra,<br /> đường chuẩn cũng giúp chúng ta đánh giá liệu<br /> các điều kiện của phản ứng Real-time PCR mà<br /> chúng ta chọn là tối ưu hóa hay chưa. Một phản<br /> ứng Real-time PCR tối ưu phải là phản ứng cho<br /> E% từ 90-105% và R2 phải đạt ≥ 0,99. Ngoài ra<br /> tiêu chuẩn tiên quyết một đường chuẩn đạt yêu<br /> cầu, hệ số góc của đường chuẩn phải đạt từ -3,32<br /> đến -3,8(5). Trong quá trình làm nghiên cứu này,<br /> chúng tôi đã tiến hành kiểm tra so sánh với<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> đường chuẩn của công ty Khoa Thương – Việt<br /> Nam. Chúng tôi dùng một nồng độ là 3 x 102<br /> trong bộ chuẩn thương mại của công ty Khoa<br /> Thương Việt Nam để kiểm tra chất lượng đường<br /> chuẩn. Tiến hành định lượng cùng đường<br /> chuẩn, phản ứng được lập lại 3 lần.<br /> Độ nhạy của phản ứng<br /> Độ nhạy được xác định trên mẫu huyết<br /> thanh ở người nhiễm virus viêm gan B với nồng<br /> độ là 4,5 × 107 copies/ml.<br /> <br /> Tiến hành quy trình Real-time PCR<br /> Phản ứng Real-time PCR của các mẫu bệnh<br /> phẩm luôn chạy tiến hành cùng một lúc với<br /> đường chuẩn (mẫu chứng dương) và một mẫu<br /> nước (mẫu chứng âm).<br /> <br /> Phân tích số liệu<br /> <br /> Hình 1: Nhiệt độ bắt cặp của mồi<br /> <br /> Khảo sát nồng độ mồi<br /> Tại nồng độ mồi là 400 nM thì E% là 100,0%<br /> và R2 ≥ 0,99. Vậy 400 nM là nồng độ mồi tối ưu<br /> cho phản ứng của chúng tôi.<br /> <br /> Số liệu đem đi phân tích với các test chỉ lấy<br /> từ 33 mẫu phát hiện và định lượng được với cả<br /> hai kỹ thuật của bộ môn và bệnh viện. Dữ liệu<br /> được phân tích và mô tả bằng test Wilcoxon(9),<br /> test phi tham số Spearman(9) và biểu đồ Bland và<br /> Altman(2,3). Tất cả dữ liệu thống kê sẽ được thực<br /> hiện bởi phần mềm SPSS 17,0 và Medcalc<br /> 11,3,0,0.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Từ 30/08/2009 đến 30/12/2009, có 46 bệnh<br /> nhân đến xét nghiệm viêm gan B thỏa tiêu<br /> chuẩn chọn mẫu được đưa vào nghiên cứu.<br /> Chúng tôi đã phát hiện và định lượng được 34<br /> trường hợp có mang virus viêm gan B trong cơ<br /> thể, 12 trường hợp còn lại có kết quả âm tính.<br /> <br /> Nhiệt độ bắt cặp của mồi<br /> Sau khi khảo sát các phổ nhiệt độ từ 59 –<br /> o<br /> 61 C, chúng tôi nhận thấy 60oC là nhiệt độ bắt<br /> cặp thích hợp nhất.<br /> <br /> Hình 2: Khảo sát nồng độ mồi<br /> <br /> Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman<br /> 200 nM là nồng độ mẫu dò tối ưu với E% là<br /> 100,0% và R2 ≥ 0,99.<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 185<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Hình 5: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại<br /> giữa các lần thí nghiệm<br /> <br /> Đường chuẩn<br /> Hình 3: Khảo sát nồng độ mẫu dò<br /> Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR:<br /> <br /> Độ lập lại trong một phản ứng (intraassay)<br /> Trị số trung bình của hai nồng độ pha loãng<br /> 10 và 10-3 lần lượt là 18,14 và 27,08.<br /> -1<br /> <br /> Kết quả giá trị virus trung bình sau 3 lần thử<br /> nghiệm là 2,73 × 102 copies/ml, khác biệt không<br /> đáng kể so với giá trị lý thuyết là 0,27 × 102<br /> copies/ml. đường chuẩn mà chúng tôi xây dựng<br /> được có R2 là 0,999 và E% là 100% và hệ số góc là<br /> -3,58.<br /> <br /> Hình 6: Đường chuẩn<br /> <br /> Độ nhạy của phản ứng<br /> Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 100<br /> copies/ml.<br /> <br /> Hình 4: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại<br /> trong một phản ứng<br /> <br /> Độ lập lại giữa các lần thí nghiệm<br /> (interassay)<br /> Kết quả trị số trung bình của hai nồng độ<br /> pha loãng 10-1 và 10-3 lần lượt 18,38 và 26,61.<br /> Hình 7: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng<br /> <br /> 186<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br />