Phát hiện và xác định Cactus virus X (CVX) nhiễm trên cây thanh long ở Việt Nam

Chia sẻ: Quenchua5 Quenchua5 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết đánh giá mức độ phổ biến của bệnh vi rút trên thanh long ở một số vùng trồng thanh long và xác định vi rút gây bệnh thanh long dựa trên cây chỉ thị, kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gene.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện và xác định Cactus virus X (CVX) nhiễm trên cây thanh long ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Magoč, Tanja, and Steven L. Salzberg, 2011. FLASH: fast length adjustment of short reads to 1. Ngô Vĩnh Viễn, 2007. Báo cáo dịch hại trên hồ improve genome assemblies. Bioinformatics 27.21: tiêu và biện pháp phòng trừ. Hội thảo sâu bệnh hại 2957-2963. tiêu và biện pháp phòng trừ. Đắc Nông, tháng 7 8. Zhuofei Xu, Martin Asser Hansen, Lars H. năm 2007: 1-8. Hansen, Samuel Jacquiod, Søren J. Sørensen, 2014. 2. Hoàng Quốc Khánh, Nguyễn Bích Ngọc, 2013. Bioinformatic Approaches Reveal Metagenomic Ứng dụng kỹ thuật metagenomics để nhận diện gene Characterization of Soil Microbial Community. PLoS mã hóa laccase của nấm Basidiomycetes trong mẫu ONE 9(4): e93445. đất rừng Nam Cát Tiên. Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 16, Số T3: 60-74. 9. Edgar, Robert C, 2013. UPARSE: highly 3. G. I. Robertson, 1980. The genus Pythium in accurate OTU sequences from microbial amplicon New Zealand. New Zealand Journal of Botany. 18:1, reads. Nature methods 10.10: 996-998. 73-102, ISSN: 0028-825X. 10. Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken 4. Randy C. Ploetz, 2004. Influence of temperature J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Glöckner FO, 2013. on Pythium splendens – induced root disease on The SILVA ribosomal RNA gene database project: carambola, Averrhoa carambola. Mycopathologia 157: improved data processing and web-based tools. Nucl. 225–231. Acids Res.: D590- 5. Gallegly, M. E. and Hong, C. 2008. Phytophthora 11. D596.Luis E. Castañeda and Olga Barbosa, – identifying species by morphology and DNA 2017. Metagenomic analysis exploring taxonomic and fingerprints. St. Paul, MN, USA: APS Press. 158 p. functional diversity of soil 2 microbial communities in 6. Caporaso JG, et al, 2010. QIIME allows analysis Chilean vineyards and surrounding native forests. of high-throughput community sequencing data. Nat PeerJ 5:e3098 Methods, 10.1038/nmeth.f.303. Phản biện: TS. Đặng Vũ Thị Thanh PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH Cactus virus X (CVX) NHIỄM TRÊN CÂY THANH LONG Ở VIỆT NAM Detection and Identification of Cactus virus X (CVX) Infecting Hylocereus undulatus in Viet Nam 1 2 3 4 Nguyễn Đức Huy *, Nguyễn Hồng Sơn , Nguyễn Thị Bích Ngọc và Nguyễn Thành Hiếu Ngày nhận bài: 13.6.2018 Ngày chấp nhận: 02.3.2019 Abstract Hylocereus undulatus, commonly known as pitaya, is widely grown in Viet Nam but most in Binh Thuan province. At present, there is no report of virus infecting H. undulatus in Viet Nam. During field surveys of 2016-2018, five stem samples of H. undulatus showing systemic mild and severe mottling symptom were collected from Binh Thuan, Quang Ninh, Bac Giang and Ha Noi. The infected samples were then mechanically inoculated by sap extraction onto leaves of indicator plants and caused necrotic local lesions on both Gomphrena globose and Chenopodium quinoa. Furthermore, total RNAs was extracted from infected stem of H. undulatus and amplified by RT-PCR using universal primers for detecting potexviruses. Sequencing of RT-PCR 1.Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông products revealed that the virus was Cactus virus X nghiệp Việt Nam (CVX). To our knowledge, this is first report of CVX in 2. Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Viet Nam. 3. Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Keywords: Hylocereus undulatus, mild and severe Việt Nam 4. Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam mottling, RT-PCR, Cactus virus X, Viet Nam 37
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 1. ĐẶT VẤN ĐỀ trên cây chỉ thị cho thấy CVX gây ra các vết chết hoại cục bộ hoặc những vết đốm vàng trên cây Cây thanh long (Hylocereus undulatus) thuộc rau muối (Chenopodium amaranticolor và C. họ xương rồng (Cactaceae) có nguồn gốc ở các quinoa) và cây cúc bách nhật (Gomphrena vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Thanh globose) (Liou et al., 2001; Kim et al., 2016). long được trồng phổ biến ở các nước Đông Hiện nay, đã có 2 chuỗi gene đầy đủ (6.614 bp) Nam Á như Thái Lan, Philippines, Indonesia, của CVX được công bố trên ngân hàng gene Đài Loan, miền Nam của Trung Quốc (Quảng (Liou et al., 2004). CVX c ng đã được nghiên Tây). Ở Việt Nam, thanh long được trồng nhiều cứu trên cây thanh long ở Brazil vào năm 2008 nhất ở Bình Thuận và một số tỉnh như Tiền (Duarte et al., 2008). Tính đến thời điểm hiện Giang, Long An, Kiên Giang. Hiện nay, thanh nay, chưa có công bố trên các tạp chí chuyên long c ng được trồng ở nhiều tỉnh của miền Bắc ngành trong nước c ng như quốc tế về xác định như Ba Vì (Hà Nội), Quảng Ninh, Hòa Bình, c ng như nghiên cứu mức độ phổ biến và gây Cao Bằng, v.v. Cây thanh long thích hợp trồng hại của CVX ở Việt Nam. Nghiên cứu này nhằm trên nhiều loại đất, quả thanh long có nhiều chất i) đánh giá mức độ phổ biến của bệnh vi rút trên dinh dưỡng và có giá trị xuất khẩu cao nên thanh long ở một số vùng trồng thanh long và ii) thanh long thanh long đã và đang là cây ăn quả xác định vi rút gây bệnh thanh long dựa trên cây quan trọng đem lại hiệu quả kinh tế cho nhiều chỉ thị, kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gene. nước trên thế giới như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc và Việt Nam. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tuy nhiên, năng suất thanh long không ổn 2.1 Mẫu bệnh định do một số bệnh mới xuất hiện và gây hại nặng như bệnh đốm nâu (Neoscytalidium Mẫu cành thanh long có triệu chứng điển dimidiatum), bệnh đốm nâu gây hại nghiêm hình như đốm vàng hoặc khảm ở mức độ nhẹ trọng và có xu hướng ngày càng lan rộng trong hoặc nặng được thu thập và duy trì bằng cách những năm gần đây (2013-2018). Theo ghi nhận trồng lại trong chậu và giữ trong nhà lưới để của Viện nghiên cứu cây ăn quả miền Nam, bệnh theo d i tiếp sự phát triển của bệnh. Trong đốm nâu đã xuất hiện vào đầu năm 2008 tại Bình nghiên cứu này, 05 mẫu cành thanh long có Thuận và Tiền Giang. Từ năm 2011 trở lại đây, triệu chứng giống vi rút (đốm vàng, khảm) bệnh gây hại nặng và lây lan trên diện rộng. Có được thu thập tại Bình Thuận (Hàm Thuận những vườn thanh long bị mất trắng, không thể Nam, Hàm Thuận Bắc), Quảng Ninh, Bắc thu hoạch được do quả bị nhiễm bệnh, gây ra Giang và Hà Nội (bảng 1). thiệt hại rất lớn cho người trồng thanh long. Bên 2.2 Xác định sự có mặt của vi rút bằng cây cạnh đó, bệnh thối nh n cành, quả do vi khuẩn chỉ thị c ng như bệnh vi rút gây hại trên thanh long ở Việt Nam chưa được xác định tác nhân gây bệnh Sự có mặt của vi rút trong mẫu bệnh đã thu c ng như phòng trừ bệnh hiệu quả. Xác định thập được xác định bằng phương pháp cây chỉ được tác nhân gây bệnh thối cành do vi khuẩn thị. Theo đó, dịch chiết từ các cành thanh long bị hoặc đốm cành do vi rút s góp phần quan trọng nhiễm bệnh bằng dung dịch đệm photphatase pH vào việc phòng trừ bệnh hại và công tác kiểm 7.0 được lây nhiễm tiếp xúc cơ học lên lá của dịch thực vật bệnh hại trên thanh long. các cây chỉ thị Chenopodium quinoa và Bệnh vi rút gây hại trên thanh long cho tới nay Gomphrena globose. Bột Carborundum (600 được xác định do Cactus virus X (CVX). CVX đã mesh) được sử dụng để tạo vết thương cơ học được phát hiện và nghiên cứu lần đầu tiên tại Đài trên lá cây chỉ thị trước khi lây. Các cây chỉ thị Loan (Liou et al., 2001). CVX thuộc chi sau lây nhiễm được đặt trong nhà lưới ở nhiệt độ o Potexvirus, họ Alphaflexiviridae. CVX truyền qua khoảng 25-27 C. Triệu chứng trên lá được theo tiếp xúc cơ học. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo d i sau 10, 20 và 30 ngày. 38
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 2.3 Xác định vi rút bằng RT-PCR và giải 2.4 Đánh giá sự truyền bệnh qua nhân trình tự giống vô tính RNA tổng số của vi rút được chiết từ mẫu Trong nghiên cứu này, 30 mẫu cành thanh nhiễm bệnh bằng CTAB theo phương pháp của long bị nhiễm vi rút thu thập tại Ba Vì - Hà Nội, Doyle và Doyle (1990). Phản ứng RT-PCR được Bắc Giang và Quảng Ninh được trồng và duy trì thực hiện với M-MLV và và DreamTaq sử dụng trong chậu, 1 cành/chậu và chăm sóc ở nhà o cặp mồi chung để phát hiện potexvirus gồm lưới với nhiệt độ 25-28 C trong thời gian 3 potex 1 (CAY CAR CAR GCX AAR GAY SA) và tháng để theo d i sự nhiễm bệnh của các potex 2 (TCD GTR TTD GCR TCR AAD GT) mầm/cành mới mọc. (Duarte et al., 2008). 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Sản phẩm PCR được tinh chiết từ 0,7% agarose gel dùng kít tinh chiết thương mại theo 3.1 Mức độ và thu thập mẫu bệnh virus hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA gây hại cây thanh long được ước lượng nồng độ bằng điện di Trong các lần điều tra đồng ruộng về mức độ agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự và thu mẫu bệnh vi rút trên cây thanh long ruột trực tiếp 1 chiều dùng mồi potex 1 (CAY CAR đỏ và ruột trắng tại Bình Thuận, thanh long ruột CAR GCX AAR GAY SA) tại hãng Macrogen đỏ tại Ba Vì – Hà Nội, Bắc Giang và Quảng Ninh của Hàn Quốc. Trình tự nucleotide được so đều có triệu chứng nhiễm vi rút. Triệu chứng điển sánh với cơ sở dữ liệu trên Genbank bằng hình là các đốm vàng (hình 1b), đôi khi dạng phần mềm tuyến BLAST tại NCBI (the National vòng (hình 1a) hoặc khảm (hình 1c), toàn cây bị Center for Biotechnology Information) nhiễm với triệu chứng từ nhẹ (systemic mild (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Tiếp mottling) đến nặng (systemic severe mottling) với theo, cây phả hệ về mối quan hệ giữa các tỷ lệ bệnh 8-10% tại Bình Thuận, 15-20% tại chuỗi nucleotide được xây dựng bằng phương Quảng Ninh và Bắc Giang, 51-55% tại Ba Vì – pháp Neighbor-Joining (Saitou và Nei, 1987) Hà Nội (bảng 1, hình 1). Trên thế giới, hiện tại sẵn có trong phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et mới chỉ ghi nhận duy nhất Cactus virus X (CVX) al., 2016). gây hại trên thanh long. Bảng 1. Mức độ và triệu chứng bệnh vi rút trên cây thanh long Thời Bộ phận bị Mức độ Địa điểm thu thập Giống gian thu Triệu chứng bệnh phổ biến thập Hàm Thuận Nam- đốm biến ruột đỏ, trắng 2016 cành + Bình Thuận vàng nhẹ Hàm Thuận Bắc – đốm biến ruột đỏ, trắng 2016 cành + Bình Thuận vàng r Quảng Yên- đốm biến ruột đỏ 2017 cành ++ Quảng Ninh vàng r đốm vàng, Bắc Giang ruột đỏ 2017 cành ++ khảm nhẹ đốm biến Ba Vì – Hà Nội ruột đỏ 2018 cành +++ vàng nhẹ Ghi chú: +: Tỷ lệ bệnh ≤10%; ++: Tỷ lệ bệnh 11 - ≤25%; +++: Tỷ lệ bệnh 25 - < 50% 39
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 a) b) c) Hình 1. Triệu chứng bệnh vi rút trên thanh long ruột đỏ. a-b) Triệu chứng đốm vàng điển hình (systemic severe mottling) tại Bình Thuận và Quảng Ninh. c) Triệu chứng đốm vàng/ hảm nhẹ (systemic mild mottling) tại Ba Vì – Hà Nội. Tuy nhiên, đến nay chưa có đánh giá về ảnh trùng gây hại. Tuy nhiên, khi lây nhiễm mẫu lá hưởng của bệnh vi rút tới năng suất trồng thanh bệnh lên các cây chỉ thị như cây rau muối long. Quan sát triệu chứng trên đồng ruộng đã (Chenopodium quinoa, C. amaranticolor), cúc ghi nhận đa số ở các cây có triệu chứng bị nhiễm bách nhật (Gomphrena globose) và thuốc lá cảnh vi rút thì quả thanh long c ng bình thường giống (Nicotiana benthamiana) thì chỉ mẫu nhiễm vi rút như cây không có triệu chứng. Tuy nhiên, ở mới có biểu hiện triệu chứng như vết đốm chết những cây có triệu chứng nặng thì cho quả nhỏ hoại, đốm màu vàng trên cây rau muối hoặc triệu hơn. Đặc biệt, ở những cây thanh long nhiễm chứng khảm trên cây thuốc lá cảnh. Ngược lại, bệnh vi rút, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm nâu nếu triệu chứng do sinh lý của cây hoặc côn (Neoscytalidium dimidiatum) giảm r rệt so với trùng gây hại giống với vi rút thì s không có triệu các cây không có triệu chứng vi rút. chứng khi lây trên các cây chỉ thị. Vì vậy, các mẫu thanh long có triệu chứng giống vi rút đã thu 3.2 Kiểm tra sự xuất hiện của vi rút trong thập được trong nghiên cứu này bước đầu được mẫu bệnh bằng cây chỉ thị kiểm tra sự xuất hiện của vi rút bằng lây nhiễm Triệu chứng do vi rút gây ra có thể nhầm lẫn lên các cây chỉ thị rau muối (C. quinoa) và cúc với các triệu chứng sinh lý của cây hoặc côn bách nhật (G. globose) (bảng 2). Bảng 2. Kết quả iểm tra mẫu thanh long nhiễm vi rút bằng cây chỉ thị Ngày sau Triệu chứng trên cây chỉ thị lây Cây rau muối (Chenopodium quinoa) Cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) 5 - - 10 Các vết đốm vàng mờ - 15 Các vết đốm vàng mờ Đốm chết hoại có viền đỏ, r 20 Các vết đốm vàng r Đốm chết hoại có viền đỏ, r Ghi chú: - (chưa xuất hiện triệu chứng 40
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 a) b) Hình 2. Lây bệnh nhân tạo mẫu thanh long nhiễm bệnh vi rút thu thập ở Bình Thuận lên cây rau muối với biểu hiện triệu chứng đốm vàng trên lá (a) và đốm chết hoại có quầng màu đỏ trên cây cúc bách nhật (b). Lây nhiễm nhân tạo mẫu thanh long nhiễm vi nghiên cứu trước (Liou, 2001; 2004; Kim et al, rút lên cây rau muối và cúc bách nhật cho triệu 2016) c ng như sự giống nhau về triệu chứng chứng đốm vàng và đốm chết hoại giống như từ các mẫu thanh long đã thu thập. Trong các nghiên cứu đã công bố do vi rút gây ra (Liou, phạm vi nghiên cứu này, đã tập trung xác định 2001; 2004; Kim et al, 2016). Kết quả này đã potexvirus bằng kỹ thuật RT-PCR và giải trình minh chứng được các mẫu cành thanh long đã tự gene bằng cặp mồi chung potex1 và potex2. thu thập là do vi rút. Sản phẩm RT-PCR thu được có kích thước khoảng 700 bp. Trình tự nucleotide thu được 3.4 Phát hiện và xác định vi rút bằng RT- khoảng 650 bp đọc r nét, chất lượng tốt, PCR và giải trình tự gene không nhiễu. Kết quả tìm kiếm chuỗi gần trên Với kết quả thí nghiệm đã khẳng định sự có Genebank được xác định là Cactus virus X mặt của vi rút trong mẫu thanh long, dựa trên (CVX) với % đoạn so sánh là 100% và mức các kết quả công bố về triệu chứng c ng như đồng nhất trình tự là 96-97% (bảng 3). sự xác định vi rút gây bệnh thanh long của các Bảng 3. Kết quả tìm iếm chuỗi gẫn gũi trên ngân hàng gene (GeneBan ) đối với mẫu vi rút thanh long ở Việt Nam % đoạn so Mẫu đồng nhất Mã trình tự Loài xác định Quốc gia sánh trình tự (%) KX883791 Cactus virus X Trung Quốc 100 97,0 JF937699 Cactus virus X Đài Loan 100 96,0 AJ270895 Cactus virus X Hà Lan 77,0 95,0 AY727533 Caladium virus X Braxin 7,0 90,0 Dựa vào kết quả tìm kiếm chuỗi trên ngân hàng dụng là Caladium virus X (hình 3). Căn cứ vào các gene, từ đó đã xây dựng cây phả hệ với mẫu CVX kết quả nghiên cứu công bố trên các tạp chí trong (Trung Quốc, Hà Lan và Đài Loan) sẵn có trên nước và quốc tế, CVX là vi rút được xác nhận lần Genebank, mẫu đối chứng (outgroup) được sử đầu tiên nhiễm trên thanh long ở Việt Nam. 41
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 KX883791-Cactus virus X -China 54 Cactus virus X-Viet Nam (Bình Thuận) AJ270985-Cactus virus X-Nertherlands JF937699-Cactus virus X-Taiwan Outgroup (AY727533-Caladium virus X) 0.1 Hình 3. Cây phả hệ đƣ c xây dựng bằng phƣơng pháp Neighbor-Joining trong MEGA 7.0. Giá trị ở các nốt của cây phả hệ là giá trị thống ê bootstrap dƣới dạng % (1000 lần lặp). Thanh bar (0.1) thể hiện hoảng cách di truyền. 3.3 Đánh giá sự lan truyền bệnh qua nhân giống không kiểm soát được cây mẹ nhiễm giống vô tính của Cactus virus X bệnh thì s làm gia tăng bệnh trong sản xuất. Theo trang Plant Virus Online (http:// Vi rút thực vật nói chung lan truyền qua con sdb.im.ac.cn/vide/descr132.htm), CVX truyền đường tiếp xúc cơ học, nhưng hiếm gặp ở qua tiếp xúc cơ học, ghép và tiếp xúc giữa các ngoài tự nhiên, chủ yếu lan truyền qua côn cây trồng. Trong nghiên cứu này, 30 mẫu bị trùng môi giới như rầy, rệp... và qua nhân nhiễm CVX được trồng trong chậu và theo d i giống vô tính. Thanh long được trồng bằng trong thời gian 3 tháng (bảng 4). nhân giống vô tính là chủ yếu, nên khi nhân Bảng 4. Đánh giá sự truyền Cactus virus X qua nhân giống vô tính Thời gian Số cành nhiễm bệnh Số chồi mọc mới Triệu chứng sau trồng được trồng nhiễm vi rút 15 30 n 30 30 - 45 30 25 đốm vàng mờ 60 30 27 đốm vàng r 75 30 27 đốm vàng r 90 30 27 đốm vàng r Ghi chú: n (chưa mọc cành mới , - cành mới nhú 5cm và chưa quan sát thấy triệu chứng vi rút. 42
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 a) b) Hình 4. Duy trì các cành thanh long nhiễm Cactus virus X trong chậu để theo dõi sự truyền bệnh virus (a) và triệu chứng đốm biến vàng ban đầu trên các cành thanh long mới (b) Kết quả theo d i cho thấy, khi mới hình “Nghiên cứu phòng chống bệnh đốm nâu và một thành chồi non từ đoạn thân làm giống, các chồi số bệnh hại chính khác trên cây thanh long non này chưa biểu hiện triệu chứng sau 30 thuộc đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ giai ngày trồng. Triệu chứng bắt đầu xuất hiện trên đoạn 2015-2017. các chồi mới sau 45 ngày và r nhất sau 60 ngày trồng, triệu chứng điển hình trong thí TÀI LIỆU THAM KHẢO nghiệm giống với triệu chứng ngoài đồng ruộng. Tỷ lệ các chồi mới nhiễm bệnh rất cao (27/30 1. Doyle J.J. and Doyle J.L, 1990. A rapid DNA cành bị nhiễm bệnh). Như vậy, trong sản xuất isolation procedure for small quantities of fresh leaf khi nhân giống vô tính thanh long bằng giâm tissue. Phytochem Bull., 19: pp. 11–15. cành cần quản lý cây mẹ nghiêm ngặt, phải 2. Duarte L.M.L., Alexandre M.A.V., Rivas E.B., sạch bệnh và phải được kiểm tra trước khi dùng Harakava R., Galleti S.R. and Barradas M.M, 2008. để nhân giống. Potexvirus diversity in Cactaceae from Sao Paulo State in Brazil. Journal of Plant Pathology 90: pp. 4. KẾT LUẬN 545-551. Triệu chứng khảm cành thanh long được xác 3. Kim J.S., Park. C.Y., Nam M., Kim H.G. and định là Cactus virus X (CVX) thuộc chi Lee S.H, 2016. First Report of Cactus virus X Potexvirus. Lần đầu tiên phát hiện, xác định và Infecting Hylocereus undatus in Korea. Plant Disease, ghi nhận vi rút này ở Việt Nam. CVX nhiễm trên 100 (12): p. 2544. cây chỉ thị như rau muối (Chenopodium quinoa) 4. Kumar S., Stecher G., and Tamura K, 2016. và cúc bách nhật (Gomphrena globosa). Phát MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis hiện này góp phần vào kiểm soát bệnh vi rút hại version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and thanh long qua con đường nhân giống vô tính. Evolution 33: pp.1870-1874. Lời cảm ơn 5. Lin W., Liao F., Chen X, 2015. Isolation and Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi đề tài identification of the pathogen causing soft rot 43