Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam bằng kỹ thuật PCR

Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(1): 61-65, 2011<br /> <br /> PHÁT HIỆN VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA VIỆT<br /> NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR<br /> Trần Thị Thanh Huyền1, Nguyễn Thị Trung2, Trương Nam Hải2<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Trường ðại học Khoa học tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> TÓM TẮT<br /> Hiện nay, cá Tra và cá Basa bị nhiễm bệnh ñốm trắng nội tạng ñang trở nên phổ biến ở Việt nam. Vi khuẩn<br /> Edwardsiella ictaluri là một trong các tác nhân gây ra bệnh gan thận mủ ở cá Tra. Tác nhân này ñe dọa nghiêm<br /> trọng ñến sự phát triển bền vững và giá trị kinh tế của ngành Thủy sản. Việc phát hiện ra vi khuẩn này sớm rất có<br /> ý nghĩa quan trọng trong việc quản lý bệnh cá Tra không chỉ ở Việt Nam mà cả ở các nước trên thế giới. Bài báo<br /> này ñề cập ñến phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch ñại DNA với ñộ ñặc hiệu và ñộ nhạy cao<br /> ñược ứng dụng ñể phát hiện nhanh vi khuẩn E. ictaluri. Các mồi ñược thiết kế ñể khuếch ñại ñoạn gen eip18 có<br /> kích thước khoảng 480 bp trong DNA genome của E. ictaluri. Các kết quả nhận ñược chỉ ra rằng kĩ thuật PCR sử<br /> dụng cặp mồi thiết kế ñã khuếch ñại ñoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp từ DNA genome vi khuẩn E.<br /> ictaluri, nhưng không khuếch ñại ñối với DNA genome của vi khuẩn E. tadar và một số tác nhân gây bệnh khác<br /> như: E. coli, Proteus, Salmonella. Kỹ thuật này có khả năng khuếch ñại ñoạn DNA khi mật ñộ E. ictaluri khoảng<br /> 3 cfu/ml. Như vậy, có thể sử dụng kĩ thuật PCR khuếch ñại gen eip18 ñể phát hiện nhanh E. ictaluri.<br /> Từ khóa: cá Tra, Edwardsiella ictaluri, eip18, PCR<br /> <br /> MỞ ðẦU<br /> Cho ñến nay, một số tác giả công bố các kết quả<br /> nghiên cứu về bệnh gan thận mủ trên cá Tra và cá<br /> Basa ñã kết luận rằng vi khuẩn E. ictaluri là một<br /> trong những tác nhân gây ra bệnh mủ gen ở cá Tra<br /> và cá Basa Việt Nam. Vi khuẩn E. ictaluri (thuộc họ<br /> Enterbacteriaceae) là vi khuẩn gram âm, hình que,<br /> không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứng<br /> catalase dương tính, oxidase âm tính. Hiện nay, bệnh<br /> do vi khuẩn Edwardsiella ñã và ñang gây thiệt hại<br /> lớn cho người nuôi cá thâm canh ở các tỉnh ñồng<br /> bằng sông Cửu Long. Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm<br /> bệnh gan thận mủ có thể lên ñến 90%. Việc tăng<br /> diện tích, mức ñộ thâm canh cao, không có biện pháp<br /> xử lý nguồn nước ao nuôi trước khi thải ra môi<br /> trường làm lây lan nhanh mầm bệnh. Việc phát hiện<br /> sớm cá, môi trường nước bị nhiễm vi khuẩn E.<br /> ictaluri là vô cùng cần thiết ñể từ ñó có hướng xử lý<br /> kịp thời, tránh gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho<br /> người nuôi trồng thủy sản.<br /> Thông thường, vi khuẩn có thể ñược phát hiện<br /> bằng phương pháp nuôi cấy và xác ñịnh các ñặc tính<br /> sinh hóa trong phòng thí nghiệm nhưng phải mất ít<br /> nhất 3 tuần ñể kết luận tác nhân gây bệnh (Panangala<br /> et al., 2005). ðặng Thị Hoàng Oanh và ðặng Thụy<br /> Mai Thy (2009) công bố một quy trình PCR khuếch<br /> ñại một ñoạn DNA 407 bp nằm trong vùng 16S<br /> <br /> rRNA ñể phát hiện vi khuẩn E. ictaluri. Do ñó, việc<br /> phát hiện vi khuẩn này bằng kĩ thuật PCR ñược mô<br /> tả sau ñây sẽ rất nhanh chóng và ñặc hiệu, cho phép<br /> người nuôi cá có thể có hướng xử lý kịp thời khi<br /> phát hiện cá bị nhiễm khuẩn. Phản ứng khuếch ñại<br /> gene (PCR) là một phương pháp cơ bản, nhanh và<br /> nhạy ñể phát hiện ra vi sinh vật trong mẫu bệnh<br /> phẩm cá và mẫu nước môi trường bị nhiễm mầm<br /> bệnh dựa trên việc khuếch ñại gen eip18 ñặc trưng<br /> của vi khuẩn E. ictaluri bằng cặp mồi ñặc hiệu.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Vật liệu<br /> Vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202, E. tarda<br /> ATCC 15469 mua từ Bảo tàng giống chuẩn của<br /> ðức. Vi khuẩn E. ictaluri phân lập dựa vào phương<br /> pháp nuôi cấy truyền thống và các ñặc ñiểm sinh<br /> hóa kí hiệu là E5, E7, E40 ñược sử dụng ñể làm ñối<br /> chứng vi sinh E. ictaluri chủng Việt Nam. Vi khuẩn<br /> Escherichia<br /> coli,<br /> Staphylococcus<br /> aureus,<br /> Salmonella Typhimurium, S. Enteritidis, Proteus<br /> mirabilis là chủng chủng thí nghiệm ñang ñược sử<br /> dụng tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ<br /> sinh học và một chủng E10 (ñược cho là<br /> Aeromonas hydrophila) ñược sử dụng ñể làm ñối<br /> chứng âm trong thí nghiệm xác ñịnh ñộ ñặc hiệu<br /> của kĩ thuật.<br /> 61<br /> <br /> Trần Thị Thanh Huyền et al.<br /> Phương pháp<br /> Tách chiết DNA genome của vi khuẩn<br /> Vi khuẩn sau khi ñược nuôi trong môi trường<br /> BHIB ở 28oC trong 18 h, thu sinh khối. Chuyển 1,5<br /> ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf và ly tâm 5000<br /> vòng/phút trong 7 phút thu tế bào. Tế bào ñược hòa<br /> tan trong 0,5 ml ñệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM<br /> EDTA, pH 8), ly tâm thu tế bào (Krystal et al.,<br /> 2003). Bổ sung 0,5 ml TE, 3 µl RNAse, 2 µl<br /> lysozyme, trộn ñều và ñể nhiệt ñộ phòng trong 30<br /> phút. Thêm 30 µl SDS 10%, 3 µl proteinase K trộn<br /> ñều ủ 37oC trong 60 phút. Bổ sung 180 µl 5 M NaCl,<br /> ủ 65oC trong 10 phút, ly tâm thu dịch nổi ở trên.<br /> Chiết DNA hai lần bằng hỗn hợp Phenol:<br /> Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1), ly tâm thu<br /> pha trên. DNA genome ñược tủa trong 70% cồn ở –<br /> 20oC trong 30 phút. Ly tâm thu tủa và làm khô, sau<br /> ñó bổ sung 40 µl TE ñể hòa tan DNA genome. ðiện<br /> di kiểm Tra sản phẩm DNA genome sau tách chiết<br /> trên gel 0,8% agarose.<br /> Thu mẫu bệnh phẩm<br /> 20 mẫu cá Tra có biểu hiện bệnh gan thận mủ,<br /> 20 mẫu cá bệnh trắng gan trắng mang và 10 mẫu cá<br /> khỏe mạnh thu trực tiếp từ các ao nuôi thuộc tỉnh<br /> Vĩnh Long, Cần Thơ, ðồng Tháp, An Giang ñược<br /> mổ trực tiếp trong ñiều kiện vô trùng. Các mẫu gan,<br /> thận, tỳ tạng có xuất hiện ñốm trắng ñược bảo quản<br /> trong ethanol 100%.<br /> 25 mg mẫu mô nội tạng cá ñược bổ sung vào<br /> 200 µl dung dịch Chelex 5%, ủ ở 95oC trong 5 phút.<br /> 1 µl dịch sau ly tâm 8000 vòng/phút ñược sử dụng<br /> làm khuôn cho phản ứng PCR.<br /> Phân lập vi khuẩn trên môi trường ñặc hiệu<br /> Môi trường EIM (Bacto - tripton: 10 g; Cao<br /> men: 10 g; Phenylalanin: 1,25 g; Feryamonium<br /> ciTrat: 1,2 g; NaCl: 5 g; Brome thymol Blue: 0.03g;<br /> Thạch: 17 g; H2O: 990 ml; pH : 7) ñặc hiệu cho vi<br /> khuẩn E. ictaluri ñược bổ sung tím kết tinh,<br /> baciTracin... ñể hạn chế sự sinh trưởng của các vi<br /> sinh vật không mong muốn. Sau 48 h ủ ở 30oC<br /> khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri sẽ có màu xanh, tròn<br /> ñều, ñường kính 0,2 - 0,5 mm.<br /> Kỹ thuật PCR<br /> ðể có thể khuếch ñại ñoạn gen eip 18 bằng kỹ<br /> thuật PCR, chúng tôi ñã thiết kế cặp mồi dựa trên<br /> trình tự ñoạn gen eip18 trên genome của vi khuẩn E.<br /> ictaluri. Cặp mồi ñược thiết kế có trình tự như sau:<br /> 62<br /> <br /> Mồi xuôi: 5’ gat ggg gaa tct act gat gc 3’; Mồi<br /> ngược: 5’ taa gac tcc agc cct cgg 3’.<br /> Thành phần phản ứng PCR (25 µl): 10x Taq<br /> polymerase buffer (Fermentas), 1,5 mM MgCl2, 2,5<br /> mM dNTP, 100 µM mồi xuôi, 100 µM mồi ngược,<br /> 0,5 IU Taq polymerase, DNA, dH2O cho ñến 25 µl.<br /> Chu trình nhiệt: (1) Biến tính DNA ở nhiệt ñộ<br /> 940C trong 4 phút. (2) Khuếch ñại gen eip18 trong<br /> 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước. Bước 1: Biến<br /> tính sợi khuôn DNA ở 940C trong 30 giây. Bước 2:<br /> Mồi bắt cặp bổ sung với ñoạn gen tương ñồng trên<br /> sợi khuôn ở 450C trong 40 giây. Bước 3: Tổng hợp<br /> kéo dài chuỗi ở 720C trong 1 phút 50 giây.(3) Phản<br /> ứng kết thúc ở 720C trong 5 phút 30 giây ñể tạo sợi<br /> DNA hoàn chỉnh và ủ mẫu ở 220C.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Tách DNA genome của vi khuẩn E. ictaluri<br /> Từ 1,5 ml dung dịch nuôi cấy ñã tách ñược 40<br /> µ l dung dịch DNA genome với nồng ñộ 94 ng/ml,<br /> tỉ lệ giá trị OD260/OD280 là 2,1. Sau khi xác ñịnh<br /> ñược nồng ñộ bằng phương pháp nano-drop, DNA<br /> ñược kiểm Tra bằng ñiện di trên gel agarose 0,8%.<br /> Kết hợp kết quả trên ñiện di ñồ với kết quả xác<br /> ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch của DNA thông qua phép<br /> ño ñộ hấp thụ quang cho thấy rằng DNA genome<br /> của chúng tôi tách chiết ñược là rất sạch, nồng ñộ<br /> cao, cần phải ñược pha loãng ra nhiều lần ñể tiến<br /> hành các thí nghiệm tiếp theo. Thông thường tỉ số<br /> giá trị OD260/OD280 lớn hơn giá trị 1,8 thì sản<br /> phẩm DNA ñược cho là sạch, không bị lẫn protein<br /> và các tạp chất khác. Sản phẩm DNA genome này<br /> ñược sử dụng ñể tiến hành các thí nghiệm nhằm<br /> khuếch ñại gen eip18 ñặc trưng của vi khuẩn E.<br /> ictaluri.<br /> Phân lập gen eip18 của vi khuẩn E .ictaluri bằng<br /> kĩ thuật PCR<br /> Kĩ thuật PCR sử dụng cặp mồi ñược thiết kế ñặc<br /> hiệu ñể khuếch ñại gen eip18 trên khuôn là DNA<br /> genome của vi khuẩn E. ictaluri tạo thành sản phẩm<br /> PCR là băng DNA có kích thước là 480 bp. Kích<br /> thước này tương ứng với kích thước băng DNA là<br /> sản phẩm PCR bằng cặp mồi ñặc hiệu khuếch ñại<br /> gen eip18 từ DNA genome của vi khuẩn E. ictaluri.<br /> Do vậy có thể khẳng ñịnh ñược rằng chúng tôi ñã<br /> khuếch ñại thành công ñoạn gen eip18 bằng cặp mồi<br /> mà chúng tôi ñã thiết kế (không dẫn hình).<br /> <br /> Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(1): 61-65, 2011<br /> Trong thí nghiệm này chúng tôi ñã sử dụng<br /> DNA genome tách chiết từ chủng E. tarda ATCC<br /> 15469 ñể làm ñối chứng âm. Bởi vì, E. tarda và E.<br /> ictaluri ñã ñược báo cáo là hai tác nhân gây bệnh<br /> trên cá da trơn gây thiệt hại lớn trong ngành nuôi<br /> trồng thủy sản ở nhiều nước trên thế giới (Panangala<br /> et al., 2005; Nagla et al., 2005). Giới hạn vật chủ của<br /> E. ictaluri hẹp hơn E. tarda. Trong phòng thí nghiệm<br /> hoàn toàn có thể phân biệt hai loại vi khuẩn này dựa<br /> vào các ñặc tính sinh hóa song phải cần ít nhất 21<br /> ngày mới cho kết quả. Sử dụng phương pháp PCR<br /> như mô tả ở ñây kết hợp với cặp mồi ñặc hiệu có thể<br /> xác ñịnh nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh là vi<br /> khuẩn E. ictaluri. Kết quả cho thấy, chúng tôi ñã<br /> thiết kế ñược ñoạn mồi ñặc hiệu khuếch ñại gen<br /> eip18 ñặc trưng của chủng vi khuẩn E. ictaluri.<br /> <br /> khuôn từ các vi khuẩn khác như E. tarda, E. coli<br /> ATCC<br /> 11105,<br /> Staphylococcus,<br /> Salmonella<br /> Typhimurium, S. Enteritidis ATCC 13076, Proteus.<br /> Sản phẩm phản ứng ñược phân tích bằng ñiện di trên<br /> gel agarose 1,2% (Hình 1).<br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy, ở các ñường chạy số<br /> 5 ñến số 12 tương ứng với DNA khuôn từ các chủng<br /> vi khuẩn E. tarda, E. coli ATCC 11105,<br /> Staphylococcus, Salmonella typhimurium, S.<br /> enteritidis ATCC 13076, Proteus ñều không xuất<br /> hiện bất kỳ băng DNA nào trên các ñường chạy<br /> tương ứng. Trong khi ñó, sản phẩm PCR trên DNA<br /> khuôn từ các chủng vi khuẩn E. ictaluri (E5, E7,<br /> E40) ñã xuất hiện một băng DNA có kích thước<br /> khoảng 480 bp, tương ứng kích thước băng DNA ở<br /> DNA khuôn từ vi khuẩn E. ictaluri ATCC 33202.<br /> ðiều ñó chứng tỏ cặp mồi mà chúng tôi ñã thiết kế<br /> khuếch ñại ñặc hiệu ñoạn DNA kích thước 480 bp<br /> trên gen eip18 từ DNA genome của vi khuẩn E.<br /> ictaluri. Các kết quả thu ñược giúp chúng tôi khẳng<br /> ñịnh rằng cặp mồi ñược thiết kế trong kĩ thuật PCR<br /> phát hiện E. ictaluri là ñặc hiệu ñối với ñoạn gen<br /> eip18 của chủng E. ictaluri.<br /> <br /> ðộ ñặc hiệu của kĩ thuật PCR<br /> ðể xác ñịnh ñộ ñặc hiệu của kĩ thuật PCR sử<br /> dụng ñể phát hiện vi khuẩn E. ictaluri, chúng tôi ñã<br /> tiến hành phản ứng PCR khuếch ñại gen eip18 dùng<br /> cặp mồi như ñã thiết kế ñối với DNA khuôn từ 03<br /> chủng E. ictaluri phân lập ở Việt Nam, các DNA<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> M<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9 10<br /> <br /> 11 12<br /> <br /> 500bp<br /> 480 bp<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu gen eip18 của chủng E. ictaluri. 1: DNA khuôn từ chủng E5; 2: E7; 3:<br /> E40; 4: E. ictaluri ATCC 33202; 5: E10; 6: E. tarda ATCC 15469; 7: E. coli ATCC 11105; 8: ðối chứng âm không bổ sung<br /> DNA; 9: S. Typhimurium; 10: S. Enteritidis ATCC 13076; 11: Staphylococcus aureus; 12: P. mirabilis. M: DNA marker 1 kb<br /> (Fermentas).<br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 500 bp<br /> 250 bp<br /> <br /> Hình 2. Sản phẩm PCR khuếch ñại gen eip18 của E. ictaluri ñối với nồng ñộ DNA khuôn giảm dần. 1: nồng ñộ DNA khuôn<br /> là 9,4x106 fg/ml; 2: 9,4x105 fg/ml; 3: 9,4x104 fg/ml; 4: 9,4x 103 fg/ml; 5: 9,4x102 fg/ml; 6: 9,4x10 fg/ml; 7: 9,4 fg/ml; 8: 9,4x10-1;<br /> 9: ðối chứng âm không bổ sung DNA khuôn; M: DNA Marker 1 kb (Fermentas).<br /> <br /> 63<br /> <br /> Trần Thị Thanh Huyền et al.<br /> ðộ nhạy của phản ứng PCR nhân gen eip18<br /> ðể xác ñịnh giới hạn phát hiện của kĩ thuật PCR<br /> khuếch ñại gen eip18, chúng tôi tiến hành phản ứng<br /> PCR với nồng ñộ DNA khuôn giảm ñi 10 lần cho<br /> mỗi thí nghiệm. Nồng ñộ DNA genome ban ñầu<br /> ñược xác ñịnh thông qua ño ñộ hấp thu quang học ở<br /> bước sóng 260 nm là 94 ng/µl. Các thí nghiệm ñược<br /> tiến hành với DNA khuôn giảm dần nồng ñộ theo<br /> cấp số 10, từ 10-1 ñến 10-9. Kết quả thí nghiệm ñược<br /> trình bày ở hình 2 cho thấy, ở các ñường chạy tương<br /> ứng với nồng ñộ DNA khuôn là 9,4x107, 9,4x105,<br /> 9,4x103, 9,4x102. ðường chạy tương ứng với DNA<br /> khuôn là 9,4x10 fg/ml vẫn thấy xuất hiện một băng.<br /> Với các giá trị nồng ñộ thấp hơn từ 9,4 fg/ml thì<br /> không phát hiện thấy băng DNA ñược khuếch ñại.<br /> Như vậy, phương pháp PCR khuếch ñại ñược gen<br /> eip18 từ DNA genome của E. ictaluri với nồng ñộ 94<br /> fg/ml. Số liệu này có thể quy ñổi tương ứng với 25<br /> cfu/ml theo cách tính của Yeh và ñồng tác giả (2005)<br /> là 76 fg DNA genome của vi khuẩn E. ictaluri tương<br /> ñương với 20 cfu) (Yeh et al., 2005).<br /> Thử nghiệm<br /> <br /> E. ictaluri. Do ñó, hầu hết các trường hợp mẫu mô<br /> không quan sát thấy ñốm trắng hoặc số lượng ñốm<br /> trắng nhỏ, ít thì việc phân lập vi khuẩn trên môi<br /> trường ñặc hiệu thực sự không cho kết quả mong<br /> muốn.<br /> Phát hiện 1 trong số 20 mẫu cá bệnh trắng gan<br /> trắng mang dương tính với vi khuẩn E. ictaluri, ñiều<br /> này ñược xác nhận lại vì trong số những mẫu cá này<br /> có 1 mẫu cá trắng gan trắng mang thu ñược tại phòng<br /> thí nghiệm khoa Bệnh học Thủy sản, trường ðại học<br /> Cần thơ theo quan sát ban ñầu bị nghi ngờ nhiễm<br /> khuẩn E. ictaluri với các biểu hiện xuất huyết và<br /> hoại thử thận. Hoàn toàn không có phản ứng dương<br /> tính nào với các mẫu cá khỏe mạnh.<br /> Bảng 1. Kết quả xác ñịnh vi khuẩn E. ictaluri bằng phương<br /> pháp PCR và phương pháp nuôi cấy.<br /> Mẫu<br /> <br /> Số mẫu<br /> <br /> Số lượng mẫu dương tính<br /> PCR<br /> <br /> Nuôi cấy<br /> <br /> Bệnh gan mủ<br /> <br /> 20<br /> <br /> 19<br /> <br /> 12<br /> <br /> Trắng gan<br /> trắng mang<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0<br /> <br /> Cá khỏe<br /> <br /> 10<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> Như vậy, phương pháp PCR cho kết quả chính<br /> xác hơn, nhanh hơn chỉ trong khoảng 3 h ngay cả khi<br /> trong mẫu có lẫn vi khuẩn khác hoặc mô tế bào chủ.<br /> ðộ nhạy của phản ứng PCR cao hơn nhiều lần so với<br /> các phương pháp vi sinh truyền thống.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 3. Giải phẫu thu mẫu mô cá Tra khỏe mạnh (A) và cá<br /> Tra bị bệnh gan thận mủ (B).<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Tổng số 50 mẫu mô cá ñược dùng ñể tách DNA<br /> cho phản ứng PCR ñồng thời vi khuẩn trong mẫu<br /> bệnh phẩm cũng ñược phân lập trên môi trường ñặc<br /> hiệu EIM ñể so sánh.<br /> <br /> Bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi ñược thiết<br /> kế trên ñoạn gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri có<br /> thể phát hiện ñược vi khuẩn E. ictaluri.<br /> <br /> Kết quả cho thấy, với các con cá có biểu hiện<br /> bệnh gan mủ rõ ràng, mổ nội tạng xuất hiện các ñốm<br /> trắng trên cả 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng thì khi kết<br /> quả phân lập trên môi trường ñặc trưng EIM chỉ ñạt<br /> 60% trong khi ñó nếu sử dụng mẫu mô bệnh ñó ñể<br /> tiến hành PCR bằng cặp mồi ñặc trưng có thể phát<br /> hiện ñến 95% dương tính với E. ictaluri. Nguyên<br /> nhân là do vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh sinh trưởng<br /> rất yếu và ñòi hỏi môi trường có hàm lượng dinh<br /> dưỡng khá cao. Còn trong môi trường ñặc hiệu cho<br /> vi khuẩn này thì ngoài các thành phần hữu cơ còn có<br /> các chất ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Gram<br /> dương và nấm nên cũng hạn chế sự sinh trưởng của<br /> 64<br /> <br /> Cặp mồi ñược thiết kế có ñộ ñặc hiệu cao, giới<br /> hạn phát hiện bằng phương pháp PCR với cặp mồi<br /> này ở nồng ñộ DNA khuôn là 94 fg/ml cho thấy có<br /> thể ứng dụng phương pháp này ñể xác ñịnh tác nhân<br /> gây bệnh là vi khuẩn E. ictaluri một cách nhanh<br /> chóng và hiệu quả. Phương pháp PCR phát hiện vi<br /> khuẩn nhanh vi khuẩn E. ictaluri có thể ñược áp<br /> dụng trên các mẫu mô cá bệnh với mức ñộ chính xác<br /> lên tới 95% so với phương pháp nuôi cấy thông<br /> thường (60%).<br /> Lời cảm ơn: Công trình ñược thực hiện bằng kinh phí<br /> của ñề tài Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật LAMP ñể<br /> phát hiện bệnh gan thận mủ trên cá Tra. Công trình<br /> <br /> Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(1): 61-65, 2011<br /> có sử dụng Trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng<br /> ñiểm Công nghệ gen (thuộc Viện Công nghệ sinh học,<br /> Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).<br /> <br /> Polymerase Chain Reaction. Biol Bull 205: 235-236.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> Panangala VS, Vansanten VL, Shoemaker CA, Mcnulty<br /> ST, Arias CR., Klesius PH (2005), InTra- and interspecific<br /> phenotypic characteristics of fish-pathogenic Edwardsiella<br /> ictaluri and E. tarda, Aquacult Res 37: 49-60.<br /> <br /> ðặng Thị Hoàng Oanh, ðặng Thụy Mai Thy (2009),<br /> Nghiên cứu quy trình CPR chẩn ñoán vi khuẩn<br /> Edwarsiella ictaluri trên thận cá Tra (Pangasianodon<br /> hypopthalmus) Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc<br /> năm 2009: 289-292.<br /> Krystal DB, Hemant MC, Roxanna S, Kevin RU (2003),<br /> Detection of Edwardsiella infections in Opsanus tau by<br /> <br /> Nagla FGA, Safinaz GM, Khalil RH, Soliman MK (2005),<br /> Study on Edwardsiella infection in Oreochromis niloticus,<br /> Egypt J Aquatic Res 31: 462-471.<br /> <br /> Yeh H-Y, Shoemarker CA, Klesius PH (2005) Evaluation<br /> of a loop-mediated isothermal amplification method for<br /> rapid detection of channel catfish Ictalurus punstatus<br /> important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. J<br /> Microbiol Method 63: 36-44.<br /> <br /> DETECTION OF EDWARDSIELLA ICTALURI INFECTION IN TRA CATFISH IN<br /> VIETNAM BY POLYMERASE CHAIN REACTION<br /> Tran Thi Thanh Huyen1, Nguyen Thi Trung2, Truong Nam Hai2, *<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Hanoi University of Science, Hanoi National University<br /> Institute of Biotechnology, VAST<br /> SUMMARY<br /> Nowadays, Tra and Basa catfish infected with lesion white diseases internal organs are widespread in Viet<br /> Nam, one of prevalent pathogenic agents is Edwardsiella ictaluri. It is a constant threat to the sustainability<br /> and economic viability of aquaculture. Early diagnosis plays a vital role in management of Tra catfish disease<br /> not only in Vietnam but also in all over the world. In this report, the polymerase chain reaction that amplifies<br /> DNA with high specificity and rapidity was evaluated for rapid detection of E. ictaluri. The primers were<br /> designed specifically to recognize the eip18 gene of this pathogen, which band size is 480 bp. The results<br /> showed that DNA of E. ictaluri could be amplified distinctly by using these primers. These primers amplified<br /> eip18 gene of E. ictaluri, yeilding a product of 480 bp, and did not amplify E. tadar and other pathogenic<br /> agents such as E. coli, Proteus, Salmonella. In addition, this technique could amplify this gene with high<br /> specificity and sensitivity (3 cfu/ml). Thus, we concluded that the PCR could potentially be used for rapid<br /> diagnosis E. ictaluri.<br /> Keywords: Edwardsiella ictaluri, eip18 gene, PCR, Tra catfish<br /> <br /> *<br /> <br /> Author for correspondence: Tel: 84-4-37562790; Fax: 84-4-37562790; E-mail: tnhai@vnn.vn<br /> 65<br /> <br />