Phương pháp định lượng vi khuẩn

Chia sẻ: Phùng Văn Hoàn | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

153
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phương pháp định lượng vi khuẩn

3.1: Cơ sở lý luận của phương pháp cố định tiêu bản và nhuộm tế bào: Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.
Thành tế bào (Cell wall) Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi.
Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ. Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau:
Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của Th thành tế bào vi khuẩn G+ G Peptidoglycan 3095 520 Acidteicoic Có 0 Lipid Hầu như không 20 Protein O hoặc ít Cao
Vách vi khuẩn Gram dương có thành phần cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi là glucopeptit, murein,...chiếm 95 % trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N- acetylglucozamin, N-acetylmuramic và galactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượng khô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào.
Vách vi khuẩn Gram âm có thành tế bào với cấu trúc phức tạp, ngoài cùng là 2 lớp lipopolysaccharit có đan xen với các phân tử protein. Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, chất kháng sinh, muối kim loại nặng, một số enzym phân giải…)
Tính chất nhuộm màu của vsv là khả năng của chúng có thể giữ lại các chất có màu (thuốc nhuộm). Tính chất đó có mối liên hệ chặt chẽ với thành phần hoá học và các tính chất hoá-lý. Màu và khả năng của các chất nhuộm (chromogene) được xác định bởi các nhóm hữu cơ trong phân tử của nó. Các nhóm này tham gia vào các mối liên kết hoá học với các gốc khác nhau trong thành phần hoá học của vsv và được giữ lại, biến đổi màu của vsv. Các chromogene khi phân cực và tạo thành các cation hay anion có màu. Trong thực tế vsv học người ta sử dụng fucsin, Crystal violet, Xanh metylen… tham gia nhuộm màu là các nhóm amin. Trong các thuốc nhuộm khác, tính chất này được thực hiện bởi các nhóm OH-
Khi vsv có chứa các phức chất của protein, nucleoproteid có tính acid, vsv bắt màu mạnh với thuốc nhuộm có tính kiềm. Chính vì vậy, vsv trong giai đoạn phát triển, với hàm lượng nucleoproteid cao rất dễ bắt màu. Các tế bào sống bắt màu yếu, vì các dung dịch có màu khó đi qua thành tế bào. Đó là lý do t ại sao người ta thường tiêu diệt vsv và cố định tiêu bản bằng nhiệt hoặc hoá chất. Các bào tử của vsv, đặc biệt là của một số vi khuẩn rất khó nhuộm màu. Người ta phải nung nóng tiêu bản và sử dụng thuốc nhuộm ở nồng độ cao (đậm đặc hơn).
Nguyên tắc nhuộm Gram : - Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.
3.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vsv có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản. Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có
ion mang màu là các cation (mang điện tích dương). Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm. Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue, crystal violet, fuchsin...
+Phương pháp nhuộm Gram Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước: -Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. -Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%) trong 1phút, rửa lại bằng nước. -Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton 1:1) hoặc cồn 96 0 trong khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng nước, -Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía) hay safranin (đỏ vàng) để 1 phút, rửa nước, để khô tự nhiên sau đó soi dưới kính hiển vi. Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod. Kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.
1. Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)  Vật liệu, hoá chất:  · Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):  2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%  0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất  Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.  · Dung dịch Iod:  Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.  · Dung dịch tẩy màu:  Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.  · Dung dịch nhuộm bổ sung:  Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
 Các bước tiến hành: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch · (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. · Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. · Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. · Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất · màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa n ước, đ ể · khô trong không khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100´. ·  Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.
Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.
2. Nhuộm tiên mao  Vật liệu, hoá chất: Dung dịch A: ·  Acid tannic 5g  FeCl3 1,5 g  Formalin 2 ml  NaOH 1% 1 ml  Nước cất 100 ml · Dung dịch B: 2 g AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ dung dịch NH4OH đậm đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO3 đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết váng thì thôi. Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn · rồi mới sử dụng.
 Các bước tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) · hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. · Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất. · Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong · 30-60 giây. Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất. Soi kính: dùng vật kính dầu 100´. ·  Kết quả: Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm, tiên mao bắt màu nâu.
3. Phương pháp nhuộm âm bản  Vật liệu, hoá chất: Mực tàu · · Metanol Dung dịch safranin 0,5% ·  Các bước tiến hành: Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính. · Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn m ỏng vết · bôi, làm khô trong không khí. Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút. · Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau · đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khô. Soi kính: dùng vật kính dầu 100´. ·  Kết quả: Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.
4. Phương pháp Đỏ Congo  Vật liệu, hoá chất: Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước · Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước · Dung dịch HCl 1% · Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) tr ộn v ới 100 · ml dung dịch KOH 0,01%.  Các bước tiến hành: Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phi ến kính · sạch. Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, đ ể khô trong · không khí Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh. · Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl. · Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa n ước, hong khô. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´. ·  Kết quả: Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu