Quy trình duplex-PCR xác định nhiễm trùng Mycoplasma hyopneumoniae - Mycoplasma hyorhinis trên mẫu phổi, dịch khớp và dịch xoang miệng trên heo

Chia sẻ: ViIno2711 ViIno2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình duplex PCR phát hiện đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyorhinis (Mhr) trên heo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Quy trình duplex-PCR xác định nhiễm trùng Mycoplasma hyopneumoniae - Mycoplasma hyorhinis trên mẫu phổi, dịch khớp và dịch xoang miệng trên heo

AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 QUY TRÌNH DUPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHIỄM TRÙNG MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE - MYCOPLASMA HYORHINIS TRÊN MẪU PHỔI, DỊCH KHỚP VÀ DỊCH XOANG MIỆNG TRÊN HEO Đỗ Tiến Duy1, Nguyễn Tất Toàn1 1 Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thông tin chung: ABSTRACT Ngày nhận bài: 11/10/2018 Ngày nhận kết quả bình duyệt: The study aims at building and optimizing a duplex PCR protocol for 29/03/2019 simultaneously detection of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma Ngày chấp nhận đăng: hyorhinis in pigs. Duplex PCR was built completely including an optimized 02/2020 parameters: primer concentrations of Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, and Title: Mhr37p-R were 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM; and 0.5 µM, respectively. d-PCR Duplex pcr protocol for thermal reaction was in total 35 cycles of initial denaturation at 94 oC for 3 detection of mycoplasma minutes, second denaturation at 94 oC for 1 min., annealing at 45 oC for 1 hyopneumoniae - mycoplasma min., extension at 72 oC for 1 min. and the final extension at 72 oC for 5 min. hyorhinis on lung, joint The d-PCR had a high specificity and sensitivity to be able to detect exudates and oral fluid specimens from pigs minimum 20.9 copies/ng (Mhp) and 15.0 copies/ng (Mhr). The d-PCR is highly applicable since 11/11 field samples were matched with s-PCR in Keywords: result. duplex-PCR, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, pigs TÓM TẮT Từ khóa: Nghiên cứu thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình duplex PCR Duplex-PCR, Mycoplasma phát hiện đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis (Mhr) trên heo. Duplex PCR được xây dựng thành công với các hyorhinis, heo thông số tối ưu như sau: Nồng độ mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, và Mhr37p-R lần lượt là 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; và 0,5 µM. Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng d-PCR bao gồm giai đoạn tiền biến tính ở 94 oC trong 3phút, biến tính ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút, kéo dài ở 72 oC trong 1 phút và giai đoạn hậu kéo dài ở 72 oC trong 5 phút, lặp lại trong 35 chu kỳ. Quy trình d-PCR có đặc hiệu và độ nhạy cao với khả năng phát hiện tối thiểu 20,9 copies/ng (Mhp) và 15,0 copies/ng (Mhr). Quy trình d-PCR có tính ứng dụng cao khi 11/11 mẫu thực địa cho kết quả đồng nhất với quy trình s-PCR. 1. GIỚI THIỆU heo. Mhr là vi khuẩn gây viêm khớp, viêm màng Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và thanh dịch và sự tham gia của mầm bệnh này Mycoplasma hyorhinis (Mhr) thuộc nhóm vi trong các ca bệnh hô hấp cũng được ghi nhận khuẩn nhỏ nhất, không có thành tế bào, thuộc (Kobayashi và cs., 1996; Lobo và cs., 2011). giống Mycoplasma và có khả năng gây bệnh trên 59
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 Mhp và Mhr cùng với nhiều mầm bệnh khác cộng xác định Mhp và Mhr trên mẫu bệnh phẩm phổi hợp gây suy hô hấp nghiêm trọng trên heo, hội và dịch khớp. chứng hô hấp phức hợp (Brockmeier và cs., 2002; 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu Thacker và Thanawongnuwech, 2004). Viêm phổi 2.2.1 Đối chứng và mẫu bệnh phẩm do Mhp rất phổ biến trên heo ở nhiều nước trên thế giới (Brockmeier và cs., 2002) và nước ta DNA kháng nguyên đối chứng (Mhp, 619 ng/µL; (Nguyễn Thị Phước Ninh và cs., 2006), tuy nhiên Mhr, 476 ng/µL) ly trích từ bệnh phẩm dương tính Mhr chưa được nhiều nhà khoa học đánh giá khả và xác định nồng độ ước lượng qua mật độ quang năng sinh bệnh và yếu tố độc lực. Ở một số khảo học (máy đo OD Thermo Scientific, Mỹ). DNA sát mới, viêm phổi do Mhr khó phân biệt với Mhp E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., hay sự nhiễm đồng thời Mhp và Mhr trong ca Staphylococcus aureus (Bệnh viện thú y, Trường viêm phổi mãn tính làm tăng cao tổn thương, hư ĐHNL Tp.HCM) làm đối chứng phản ứng chéo hại phế quản, màng phổi (Lin và cs., 2006; Lobo cho quy trình d-PCR. 11 mẫu bệnh phẩm (2 mẫu và cs., 2011). 10% Mhr được phân lập từ dịch mũi dịch hầu họng, 3 mẫu dịch khớp và 6 mẫu mô của heo nái, 20% trên mô phổi heo con kiểm soát phổi) được thu thập ở các ca bệnh trên heo. sạch bệnh (SPF), 66% ở heo con thương phẩm 2.2.2 Các cặp mồi/primers cho phản ứng PCR (Kobish & Friis, 1996) và 30 - 40% trên dịch mũi Mồi đặc hiệu khuyếch đại sản phẩm s-PCR và d- của heo sau cai sữa, cho thấy khả năng khu trú PCR cho Mhp [Mhp16s-F: 5’- của vi khuẩn trên đường hô hấp của heo mọi lứa ACTAGATAGGAAATGCTCTAG-3’ và tuổi. Mhp16s-R: 5’- Sự chẩn đoán đồng thời Mhp và Mhr trên ca bệnh ATACTACTCAGGCGGATCATTTAAC-3’], có rối loạn hô hấp, viêm đa màng thanh dịch và viêm sản phẩm 430bp (Barate và cs., 2012); và khuyếch khớp có tính thực tiễn cao, bởi do bệnh trên heo đại sản phẩm cho Mhr [Mhr37p-F: 5’- có khuynh hướng diễn ra ở dạng hội chứng, kết GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-’3 và Mhr37p- hợp nhiều dấu hiệu lâm sàng phức tạp như hô hấp, R: 5’-GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’], có tiêu chảy và viêm khớp (Thacker & sản phẩm 346bp (Caron và cs., 2000). Thanawongnuwech, 2004; Đỗ Tiến Duy & 2.2.3 Dụng cụ và hóa chất Nguyễn Tất Toàn, 2013). Đánh giá sự nhiễm ghép Mhp và Mhr trong các ca bệnh trên heo sẽ giúp Kit IVApDNA Extraction kit (Công Ty Việt Á, người làm công tác thú y trong việc phòng trị Tp.HCM) sử dụng chiết tách DNA từ mẫu bệnh bệnh tốt hơn. Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích phẩm. Go taq® green master mix và Go taq® G2 đánh giá, tối ưu hóa và áp dụng quy trình duplex Hot Start green master mix (Promega, Mỹ), nước PCR chẩn đoán Mhp và Mhr trên heo ở điều kiện không nuclease (Promega, Mỹ) sử dụng trong thực tiễn trong nước từ kết quả nghiên cứu của phản ứng s-PCR và d-PCR bởi máy khuyếch đại nước ngoài. PCR (Techne, Anh). 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 2.3 Phương pháp tiến hành CỨU 2.3.1 Kiểm tra đặc tính chung của các mồi 2.1 Nội dung và nguyên liệu nghiên cứu Tính chất chung và sự đặc hiệu mồi được kiểm tra Nghiên cứu gồm ba bước cơ bản như sau: [1] Thử gồm: Chiều dài cơ sở phù hợp khoảng 18 - 24 nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn (s-PCR) phát nucleotides, GC chiếm 35 - 60%, khả năng hình hiện riêng lẽ Mhp và Mhr; [2] Xây dựng, tối ưu thành cấu trúc thứ cấp rất thấp (kết quả không hóa quy trình PCR đôi (d-PCR) phát hiện đồng trình bày; công cụ PrimerSelect, Lasergene). Hai thời Mhp và Mhr; [3] Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu để khuyếch đại 60
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 đoạn gen mã hóa 16s rRNA (Barate và cs., 2012) phản ứng với thành phần sử dụng Go taq® và 37p (Caron và cs., 2000) đặc hiệu cho các green master mix, 2X (Bảng 2) và chu trình chủng Mhp và Mhr, tương ứng (NCBI, luân nhiệt gồm ba giai đoạn: Giai đoạn 1 (1 GeneBank). chu kỳ), tiền biến tính ở 94 oC trong 3 phút; 2.3.2 Thử nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn giai đoạn 2 (35 chu kỳ), biến tính ở 94 oC (s-PCR) trong 1 phút, bắt cặp ở 45 oC trong 1 phút và kéo dài sản phẩm ở 72 oC trong 1 phút; giai Quy trình s-PCR phát hiện Mhp và Mhr được đoạn 3 (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm cuối cùng thực hiện với primer tương ứng, 25 µL tổng ở 72 oC trong 5 phút. Bảng 1. Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện Mhp và Mhr Mhp Mhr Thành phần µL Nồng độ cuối µL Nồng độ cuối Go taq® green master mix, 2X 12 12 Mhp16s-F 25 µM 0,5 0,5 µM Mhr37p-F 25 µM 0,5 0,5 µM Mhp16s-R 25 µM 0,5 0,5 µM Mhr37p-R 25 µM 0,5 0,5 µM DNA Mhp đối chứng 3 206 ng/µL 619 ng/µL DNA Mhr đối chứng 3 158 ng/µL 476 ng/µL Nước DEPC không nuclease vừa đủ 25 µL Sản phẩm khuyếch đại s-PCR có băng tương ứng NCBI) bởi phần mềm BioEdit và BLAST (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) với đối chứng dương (NCBI). và thang chuẩn (ladder 100bp; Promega, Mỹ) Các bước chuẩn hóa s-PCR được tham khảo (Đỗ được giải trình (Công ty Nam Khoa, Tp.HCM). Tiến Duy và cs., 2014) gồm xác định nhiệt độ bắt Trình tự giải mã được sánh cặp tương đồng với cặp tối ưu (ToC), nồng độ mồi tối ưu và lượng 100 trình tự gen 16s rRNA (Mhp) và 37p (Mhr) Master Mix (Go taq® green, Promega, Mỹ) cho tham chiếu từ ngân hàng dữ liệu gen (GenBank, phản ứng khuyếch đại (Bảng 2) và chu trình luân nhiệt ba bước được giữ nguyên. Bảng 2. Các nghiệm thức (NT) chuẩn hóa s-PCR cho Mhp/Mhr Nồng Nhiệt độ bắt cặp (ToC)/ Master mix (µL) độ 43 oC 45 oC 47 oC 49 oC mồi* (µL) 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 0,25 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 0,5 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 0,75 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 *, mồi tương ứng cho Mhp hay Mhr 61
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 2.3.3 Xây dựng, tối ưu hóa quy trình d-PCR Nồng độ các cặp mồi tối ưu từ thí nghiệm trước Hai cặp mồi với đặc tính (Bảng 1), nồng độ và được áp dụng để đánh giá các thang nhiệt độ bắt nhiệt độ bắt cặp tối ưu ở s-PCR, dùng cho thiết kế cặp giữa mồi và khuôn ở 43 oC, 45 oC, 47 oC, 49 một phản ứng chung d-PCR, với kích thước sản o C và thành phần phản ứng khác được giữ nguyên phẩm khác nhau (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) đủ để như hai thí nghiệm trên. nhận diện rõ ràng trên gel điện di. Tối ưu hóa d- Xác định lượng Master mix tối ưu trong d- PCR gồm: [1] Xác định khả năng hoạt động của PCR mồi trong d-PCR; [2] Xác định nồng độ mồi trong Nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp tối ưu từ các thí phản ứng d-PCR; [3] Xác định nhiệt độ bắt cặp tối nghiệm trước đó được dùng trong phản ứng d- ưu của mồi trong phản ứng d-PCR; [4] Xác định PCR nhằm xác định lượng Master mix vừa đủ. lượng Master mix tối ưu trong d-PCR; và [5] Xác Lượng Master mix khảo sát ở 10 µL, 12 µL và 14 định nồng độ DNA khuôn tối thiểu được phát hiện µL. Thành phần phản ứng khác được giữ nguyên bởi d-PCR. Mỗi phản ứng tương ứng của các thí như các thí nghiệm trên. nghiệm lặp lại 3 lần và kèm theo đối chứng âm và Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu phát hiện bởi thử nghiệm phản ứng chéo với DNA của một số d-PCR vi khuẩn phổ biến (E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., Staphylococcus aureus) để xác định tính Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu được phát hiện chính xác của thí nghiệm. bởi d-PCR dựa theo chỉ số LOD (Limit of Detection). LOD được xác định khi ở một nồng Đánh giá khả năng hoạt động của mồi trong d- độ nhất định, phương pháp xét nghiệm phát hiện PCR sự hiện diện của gen đích 95%, tỷ lệ âm tính giả ≤ Cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R và cặp mồi 5% (ISO 24276, 2006). DNA đối chứng dương Mhr37p-F, Mhr37p-R được thử nghiệm trên cùng (Mhp và Mhr) được tinh sạch bằng môi trường và điều kiện phản ứng ở d-PCR, mô tả chloroform/isopropanol, và sau đó được đo mật ở Bảng 2. Quy trình d-PCR thực hiện cùng điều độ quang học (OD; máy đo OD Thermo kiện ba giai đoạn: Giai đoạn 1 (1 chu kỳ), tiền Scientific, Mỹ). Số copies/ng ước lượng được tính biến tính ở 94 oC trong 1 phút; giai đoạn 2 (35 chu toán theo công thức từ phần mềm trực tuyến kỳ), biến tính ở 94 oC trong 1 phút, bắt cặp ở 45 (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Pha loãng oC trong 1 phút và kéo dài sản phẩm ở 72 oC trong DNA đối chứng tinh sạch theo cấp số 100, 10-1, 1 phút; giai đoạn 3 (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm 10-2, 10-3,.., 10-11 để tiến hành chạy d-PCR tìm cuối cùng ở 72 oC trong 5 phút. Thành phần phản lượng tối thiểu phát hiện. ứng trong tổng thể tích (25 µL) như sau: 12 µL 2.3.4 Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa xác định Mhp Go taq® G2 Hot Start green master mix, 2X; 0,5 và Mhr trên mẫu bệnh phẩm µL cho mỗi đoạn mồi (Mhp16s-F 25 µM, Mh16s- R 25 µM, Mhr37p-F 25 µM, Mhr37p-R 25 µM), 3 Tổng cộng 11 mẫu gồm có 2 mẫu dịch hầu họng µL DNA đối chứng dương với tỷ lệ 1:1 (thu thập bằng phương pháp dây từng cotton, (Mhp/Mhr), và nước DEPC thêm vào cho đủ tổng Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy, 2013), 3 mẫu thể tích. dịch khớp và 6 mẫu mô phổi được thu thập ngẫu nhiên trong các ca bệnh trên heo (Bệnh viện thú y, Xác định nồng độ mồi tối ưu trong d-PCR Trường ĐHNL Tp.HCM). s-PCR và d-PCR tối ưu Nồng độ của mỗi mồi khác nhau (0,25 µM, 0,5 được ứng dụng để xác định Mhp và Mhr trên 3 µM, 0,75 µM và 1,0 µM) được khảo sát với điều loại bệnh phẩm trên. Sự tương đồng giữa s-PCR kiện phản ứng luân nhiệt giống như thí nghiệm và d-PCR được tính toán với trị số Kappa đánh giá khả năng hoạt động của mồi ở trên. (Blackman & Koval, 2000). Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu trong d-PCR 62
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 Sản phẩm s-PCR và d-PCR ở tất cả thí nghiệm Ở s-PCR Mhp, nhiệt độ bắt cặp 45 oC, 47 oC và được điện di trên gel agarose (1,5%, TBE 0,5x, 49 oC có sản phẩm khuyếch đại tốt tương tự nhau 100V; máy VWRC®), hòa tan 3 µL/25mL (băng sáng rõ và không có vạch phụ) trên gel điện Ethidium bromide (Invitrogen brand, Mỹ), và kết di. Hoạt động của cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R quả điện di được đọc trên máy chiếu tia UV trực tốt ở khoảng dao động nhiệt độ rộng giúp cho việc tiếp (máy Vilber Lourmat, Pháp). xét nghiệm hiệu quả ở các điều kiện nhiệt hay 3. KẾT QUẢ máy luôn nhiệt khác nhau. Qua thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi, 0,5 µM là nồng độ tốt nhất cho vạch 3.1 Quy trình s-PCR xác định Mhp và Mhr sản phẩm sáng rõ ở các thang nhiệt độ khác nhau; Hai cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R và Mhr37p-F, trong khi sản phẩm khuyếch đại mờ trên gel điện Mhr37p-R khuyếch đại sản phẩm (Hình 1A, B) di ở nồng độ 0,25 µM và xuất hiện sản phẩm phụ hoàn toàn đặc hiệu (gen 16s, Mhp; gien 37p, Mhr) ở 0,75 µM. Lượng master mix tối ưu cho sản so với các chủng tham chiếu trên ngân hàng dữ phẩm s-PCR tốt qua khảo sát ở 10 µL, sản phẩm liệu gen. yếu ở 8 µL, trong khi sẽ dư thừa ở 12 µL mặc dù sản phẩm s-PCR tốt như ở 10 µL. Hình 1. Sản phẩm khuyếch đại s-PCR [A]: Băng sản phẩm 430bp của Mhp ở giếng 3, 4; [B]: Băng sản phẩm 346bp của Mhr ở giếng 3, 4; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhr từ s-PCR chuẩn hóa ở 45oC từ NT1-NT9 (giếng 1 - 9), đối chứng âm (giếng 10) và thang chuẩn (L). 63
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 3.3 Quy trình d-PCR tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp khác (giếng số 8 đến 11; hình Hình 2A trình diễn kết quả đánh giá hoạt động 2C). Ở 45 oC là nhiệt độ bắt cặp lựa chọn cho thí của 2 cặp primer (Mhp16s-F, Mhp16s-R và nghiệm tiếp theo. Mhr37p-F, Mhr37p-R) trong phản ứng d-PCR. Thể tích Master mix 12 µL cho sản phẩm khuyếch Chất lượng sản phẩm khuyếch đại 430bp của Mhp đại rõ và sáng nhất. Quy trình d-PCR yêu cầu và 346bp của Mhr rất tương đồng nhau. Độ dày lượng thành phần phản ứng (Master mix) cao hơn băng sản phẩm yếu hơn s-PCR trong cùng điều so với s-PCR. Sự cạnh tranh nguyên liệu phản kiện, nguyên liệu phản ứng nên hiệu chỉnh d-PCR ứng (Polymerase, dNTP và MgCl2) có thể xảy ra để tìm thông số tối ưu là công đoạn quan trọng. giữa các cặp mồi khuyếch đại sản phẩm đặc trưng Nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1 µM mồi đều cho sản khác nhau. phẩm khuyếch đại tốt, băng sản phẩm rõ và sáng. Nồng độ DNA tinh sạch của Mhp (9,7 ng/µL, Ở nồng độ mồi 0,25 µM kết quả khuyếch đại kém tương đương 2,09.1010) và của Mhr (5,6 ng/µL, hơn các nồng độ còn lại; trong khi 0,5 µM là nồng tương đương 1,5.1010) được xem như nồng độ độ hữu hiệu với kết quả tốt và hạn chế dư thừa mẫu gốc để tiến hành xác định tính nhạy cảm của trong phản ứng. d-PCR. Ở độ pha loãng 10-9, không còn sản phẩm Ở kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp, các mức nhiệt d-PCR xuất hiện, được xem là giới hạn thấp nhất độ 45 oC, 47 oC và 49 oC mồi hoạt động tốt cho (Mhp: 20,9 copies/ng; Mhr: 15,0 copies/ng) mà băng sản phẩm sáng, rõ và không có sản phẩm phản ứng có thể xét nghiệm. Sự chính xác của kết phụ (Hình 2C). Ở cả 3 nhiệt độ bắt cặp này kết quả được lặp lại 10 với mẫu ở nồng độ pha loãng quả khuyếch đại tương đương nhau mặc dù sản 10-9 cho kết quả hoàn toàn giống nhau. phẩm d-PCR của Mhp kém hơn so với các thang Hình 2. Sản phẩm khuyếch đại d-PCR. 64
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 [A]: Băng sản phẩm 430bp của Mhp s-PCR (giếng 2), băng sản phẩm 346bp của Mhr s-PCR (giếng 3), và băng sản phẩm của Mhp và Mhr trong d-PCR (giếng 4, 5); [B]: Kết quả xác định sự đặc hiệu của d-PCR, chỉ có băng sản phẩm Mhp và Mhr xuất hiện (giếng 2), các giếng còn lại âm tính với các vi khuẩn kiểm tra; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhp/Mhr qua các nhiệt độ bắt cặp khác nhau (45 oC, giếng 3 - 5; 47 oC, giếng 6 - 8; 49 oC, giếng 9 - 11); thang chuẩn (L) và đối chứng âm (giếng 2). 3.4 Kết quả ứng dụng d-PCR tối ưu hóa Đỗ Tiến Duy, 2013), tuy nhiên Mhp có khả năng Kết quả d-PCR hoàn toàn trùng khớp với kết quả s- phát hiện thấp hơn so với mô phổi (kết quả chưa PCR khi xét nghiệm Mhp/Mhr trên 11 mẫu thực địa công bố), có thể do lượng mầm bệnh hiện diện trong (Bảng 3). Chỉ số Kappa đạt tối đa (1.0). Quy trình dịch miệng thấp. Ngược lại, Mycoplasma (Mhp, d-PCR khuyếch đại sản phẩm Mhp yếu hơn s-PCR Mhr) hiện diện cao ở dịch tiết mũi heo (Kobish & ở 2 mẫu dịch hầu họng. Mẫu dịch hầu họng thu thập Friis, 1996), do đó cần có thử nghiệm sâu hơn xác bằng dây thừng cotton là phương pháp mới để chẩn định khả năng phát hiện Mhp và Mhr qua mẫu đoán các mầm bệnh vi-rút trên heo (Prickett và cs., dịch ngoáy mũi bằng kỹ thuật d-PCR tối ưu của 2008, Prickett và cs., 2010; Nguyễn Tất Toàn & nghiên cứu này. Bảng 3. Tương đồng kết quả d-PCR và s-PCR Mẫu xét nghiệm s-PCR d-PCR T Kí hiệu Mhp Mhr Mhp Mhr 1 M-1 - + - + 2 M-4 - - - - 3 M-6 - + - + 4 M-7 + + + + 5 M-9 + + + + 6 M-20 + + + + 7 H-2 + - + - 8 H-3 + - + - 9 D-1 + + + + 10 D-2 + - + - 11 D-6 + + + + M: Mẫu mô; D: Dịch khớp; và H: Dịch hầu họng 4. THẢO LUẬN Ở s-PCR Mhr, nhiệt độ bắt cặp tối ưu ở 47 oC và 49 oC cho phản ứng khuyếch đại ở các điều kiện nồng độ mồi và Master mix thay đổi. Ở 45 oC, sản phẩm khuyếch đại sáng rõ qua gel điện di ở nồng độ mồi 0,5 µM và 0,75 µM (Hình 1C). Ở 43 oC, sản phẩm s-PCR chỉ tốt ở lượng Master mix lớn (10 µL và 12 µL). Như vậy, s-PCR Mhr hoạt động tốt ở nhiệt độ bắt cặp 45 oC đến 49 oC với nồng độ mồi là 0,5 µM và 0,75 µM và lượng Master mix 10 và 12 µL. Thông số tối ưu từ s-PCR Mhp và s-PCR Mhr cho phép thiết kế, chuẩn hóa quy trình d-PCR được chính xác, nhanh chóng hơn. Quy trình d-PCR yêu cầu hai mồi phải có nhiệt độ bắt cặp gần giống nhau, nồng độ mồi tương thích và hạn chế sự cạnh tranh nguyên liệu phản ứng khuyếch đại (Octavian, 1997; 65
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 Henegarui và cs., 1997). Nhiệt độ bắt cặp tối ưu Blackman, N.J., & Koval, J.J. (2000). Interval 45 oC đến 49 oC, nồng độ mồi từ 0,5 µM đến 0,75 estimation for Cohen's kappa as a measure of µ và lượng Master mix từ 10 µL đến 12 µL được agreement. Statistics in Medicine, 19, 723– chọn làm cơ sở phát triển d-PCR. 741. Hình 2B chứng minh tính đặc hiệu của d-PCR, Brockmeier, S., Halbur, & Thacker, E. (2002). khi không có bất kỳ phản ứng chéo nào với DNA Porcine respiratory disease complex. In đối chứng từ các mầm bệnh khác. Xác định khả Textbook of Polymicrobial Disease (Brogden, năng phản ứng chéo với loài Mycoplasma KA., Guthmiller, JM., eds). Washington, DC: hyosynoviae và Mycoplasma flocculate kí sinh ASM Press, 231-258. trên khớp và đường hô hấp heo (Freeman và cs., Caron, J., Ouardani, M., & Dea, S. (2000). 1984) rất cần thiết trong kỹ thuật xét nghiệm, tuy Diagnosis and differentiation of Mycoplasma nhiên nghiên cứu này không có điều kiện thực hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis hiện. infections in pigs by PCR amplification of the Cả 3 mẫu dịch khớp thu thập từ 3 heo có biểu hiện p36 and p46 genes. J Clin Microbiol, 38, lâm sàng rối loạn hô hấp và viêm khớp dương tính 1390-1396. với Mhp qua d-PCR. Mhp chưa từng được phân Đỗ Tiến Duy & Nguyễn Tất Toàn. (2013). Khảo lập hay xác định bởi kỹ thuật sinh học phân tử từ sát biểu hiện lâm sàng, bệnh lý mô học phổi dịch khớp trên heo (Makhanon và cs., 2012), viêm và căn nguyên gây bệnh trên heo cai sữa trong khi tỷ lệ hiện diện Mhr lại rất cao (Kobish & có triệu chứng hô hấp tại một số trại chăn nuôi Friis, 1996; Makhanon và cs., 2012). 79% khu vực phía Nam. Tạp chí KHKT Thú y, 20, Mycoplasma pneumonia hiện diện trong 24 bệnh 44-52. nhân viêm khớp (Johnson và cs., 2007). Do đó nghiên cứu xác định tỷ lệ đồng nhiễm Mhp và Đỗ Tiến Duy., Lê Thị Hạnh Dung., Lê Thanh Mhr trên heo viêm khớp (áp dụng phương pháp Hiền., & Nguyễn Tất Toàn. (2014). Tối ưu hóa lấy mẫu hạn chế tối đa vấy nhiễm) sẽ giúp hiểu rõ phản ứng PCR phát hiện Haemophilus vai trò gây bệnh và dịch tễ của chúng. parasuis trên heo con có dấu hiệu rối loạn hô hấp từ các trại chăn nuôi ở một số tỉnh phía Quy trình d-PCR được xây dựng, tối ưu thành công Nam. Tạp chí KHKT Thú y, 21, 8-17. và tương đồng hoàn toàn với s-PCR trong việc xác định Mhp và Mhr trên cả mẫu đối chứng và mẫu Freeman, M.J., Armstrong, C.H., & Freeman- bệnh phẩm (phổi, dịch khớp, dịch miệng) thu thập Sands, L.L. (1984). Serological cross- thực địa. Độ nhạy của d-PCR rất cao khi khuyếch reactivity of porcine reference antisera to đại Mhp (20,9 copies/ng) và Mhr (15,0 copies/ng). Mycoplasma hyopneumoniae, M. flocculare, d-PCR tối ưu nhất ở nồng độ mồi Mhp16s-F; M. hyorhinis and M. hyosynoviae indicated by Mhp16s-R; Mhr37p-F; Mhr37p-R lần lượt là 0,5; the enzyme-linked immunosorbent assay, 0,5; 0,5; 0,5 µM; ở thể tích Master mix 12 µL, và complement fixation and indirect nhiệt độ bắt cặp 45 oC. hemagglutination tests. Can J Comp Med, 48, 202-207. TÀI LIỆU THAM KHẢO Henegarui, O., Heerema, N.A., Dlouhy, S.R., Barate, A.K., Lee, H.Y., Jeong, H.W., Lam, Q.T., Vance, G.H. & Vogt, P. (1997). Multiplex Joo, H.G & Hahn, T.W. (2012). An improved PCR: Critical parameters and step –by- step multiplex PCR for diagnosis and protocol. BioTechniques, 23, 504-511. differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae Johnson, S.M., Bruckner, F., & Collins, D. and Mycoplasma hyohinis. Korean Journal of (2007). Distribution of Mycoplasma Veterinary Research, 52, 39-43. 66
AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol. 24 (1), 59 – 67 pneumoniae and Mycoplasma salivarium in Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy. (2013). Xác the synovial fluid of arthritis patient. Journal định một số virus gây rối loạn hô hấp trên heo of Clinical Microbiology, 45, 953–957. qua mẫu dịch xoang miệng và mẫu mô. Tạp Kobayashi, H., Morozumi, T., Miyamoto, C., & chí KHKT Thú y, 20, 41-49. . Shimizu, M. (1995). Mycoplasma hyorhinis Nguyễn Thị Phước Ninh., Đỗ Tiến Duy., Nguyễn infection levels in lung of piglets with Porcine Tất Toàn., Nguyễn Ngọc Tuân., & Trần Thị Dân. Reproductive and Respiratory Syndrome. J Vet (2006). Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae Med Sci, 58, 109-113. và một số vi khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp Kobisch, M., & Friis, N.F. (1996). Swine trên phổi heo. Tạp chí KHKT Thú Y, 13, 12-15. mycoplasmoses. Revue Scientifique et Octavian, H. (1997). Troubleshooting for PCR Technique, 15, 1569–1605. and multiplex PCR. Yale University, US. Lin, J.H., Chen, S.P., Yeh, K.S., & Weng, C.N. Retrieved from (2006). Mycoplasma hyorhinis in Taiwan: medicine.yale.edu/labs/henegariu/tavi/trblesht. Diagnosis and isolation of swine pneumonia html. pathogen. Veterinary Microbiology, 15, 111– Prickett, J.R., Kim, K., Simer, R., Yoon, K.J, & 116. Zimmerman, J. (2008). Oral-fluid samples for Lobo, E., Poveda, C., Gupta, R., Suarez, A., surveillance of commercial growing pigs for Hernández, Y., Ramírez, A., & Poveda, J.B porcine reproductive and respiratory syndrome (2011). Mycoplasmas hyorhinis in different virus and porcine circovirus type 2 infections. regions of Cuba. Diagnosis. Braz J Microbiol, Journal of Swine Health and Production, 16, 42, 721-725. 86-91. Makhanon, M., Tummaruk, P., Thongkamkoon, Prickett, J.R., & Zimmerman, J,J. (2010). The P., Thanawongnuwech, R., & Prapasarakul, N. development of oral fluid-based diagnostics (2012). Comparison of detection procedures of and applications in veterinary medicine. Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma Animal Health Reseach Reviews, 11, 207-216. hyosynoviae, and Mycoplasma hyorhinis in Thacker, E.L., & Thanawongnuwech, R. (2004). lungs, tonsils, and synovial fluid of Porcine respiratory disease complex (PRDC). slaughtered pigs and their distributions in Thai Journal of Veterinary Medicine, 32, 125- Thailand. Trop Ani Health Prod, 44, 313–318. 134. 67