Quy trình phân tích đoạn Cytochrome B trên các mẫu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Với mục đích kiểm định cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus), việc xây dựng quy trình phân tích đoạn Cytochrome b là cần thiết. Cặp mồi universal cho Cytb được sử dụng để nhân gen thuộc vùng gen ty thể thông qua PCR các mẫu cá Tra và một số loài cá da trơn khác với kích thước 430 bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và giải trình tự.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Quy trình phân tích đoạn Cytochrome B trên các mẫu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐOẠN CYTOCHROME B TRÊN CÁC MẪU CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Nguyễn Ái Hằng1*, Trần Thị Thúy Hà2 TÓM TẮT Với mục đích kiểm định cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus), việc xây dựng quy trình phân tích đoạn Cytochrome b là cần thiết. Cặp mồi universal cho Cytb được sử dụng để nhân gen thuộc vùng gen ty thể thông qua PCR các mẫu cá Tra và một số loài cá da trơn khác với kích thước 430 bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và giải trình tự. Các chuỗi trình tự nghiên cứu sau khi giải cần phải được xử lý sơ bộ trước khi được đưa vào chương trình phân tích chính. Đầu tiên, các chuỗi trình tự cần được kiểm tra chất lượng giải trình tự và xử lý bằng kết hợp hai phần mềm FinchTV và Bioedit để đạt được trình tự chuẩn xác nhất cho các bước phân tích tiếp theo. Kế tiếp, dùng phần mềm BLAST của NCBI để so sánh và xác định mức độ tương đồng của mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn đã được công bố trong dữ liệu của NCBI. Cuối cùng, phần mềm Mega 6 sẽ là phần mềm thích hợp cho các phân tích về sự phát sinh loài và khoảng cách di truyền của cá Tra và những loài cá da trơn khác trong họ Pangasiidae muốn quan tâm. Từ khóa: cá Tra, Cytochrome b, FinchTV và Bioedit, Pangasianodon hypophthalmus, quy trình phân tích đoạn I. ĐẶT VẤN ĐỀ đoạn trong vòng đời (trứng và ấu trùng) thậm Theo Ủy hội sông Mekong (MRC: Mekong chí còn phức tạp hơn việc nhận dạng khi trưởng River Commission) thì Việt Nam có tổng số 13- thành. 14 loài trong họ Pangasiidae, bao gồm 1 loài Ngày nay, sự phát triển vượt bậc của ngành thuộc giống Helicophagus, 11 loài thuộc giống gienome học (gienomics) và các thiết bị thế hệ Pangasius và 2 loài thuộc giống Pangasianodon mới đã mở đường cho việc nghiên cứu toàn bộ (MRC, 2008). Tuy nhiên, việc phân loại dựa vào gienome của các sinh vật thủy sản. Đặc biệt với hình thái học biến động lớn và còn nhiều tranh sự xuất hiện của kỹ thuật giải trình tự giene thế cãi. Hiện nay, một số trang web cung cấp thông hệ mới đã giảm chi phí và nhân công một cách tin rộng rãi về hình thái cá (www.fishbase.org); đáng kể trong khi có thể tạo được nguồn dữ liệu tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc tính hình di truyền khổng lồ trong thời gian ngắn. Đồng thái bị giới hạn như đặc điểm khác biệt giữa các thời, với những chương trình phần mềm đa dạng loài là quá nhỏ hoặc khó nhận thấy từ bên ngoài đã giúp ích rất nhiều cho việc phân tích dữ liệu như xương lá mía, bóng hơi... . Thêm vào đó, gien, phát hiện ra những vùng đột biến điểm rất nhiều đặc tính hình thái đã bị loại bỏ trong quá hiệu quả cho việc đánh giá khác biệt di truyền trình tiêu hóa (ví dụ, cá tra bần thì thường thấy cũng như phát sinh loài quần thể của sinh vật. trái bần bên trong dạ dày của nó) hoặc xử lý chế DNA ty thể (mtDNA) được sử dụng rộng biến (ví dụ như đồ hộp, thịt phi lê) thì việc xác rãi trong nghiên cứu phân loại và phả hệ bởi định trở nên khó khăn hoặc thậm chí không thể. tính di truyền theo dòng mẹ, không bị trộn lẫn Hơn nữa, việc xác định hình thái qua các giai qua các thế hệ tiến hóa nhanh (gấp 10 lần so 1 Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I * Email: hangtna.ria2@mard.gov.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 19
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II với DNA ở trong nhân) và phương pháp thuật thủy sản An Giang, Trại cá giống Châu Hưng, phân tích đơn giản (Kuhner và ctv., 2000). Bình Đại Bến Tre,… Trong đó, một số gien nằm trên DNA ty - Mẫu cá sau khi thu được rửa sạch bằng nước thể (mtDNA) được xem như những DNA ngọt và mã hóa. Tiến hành phân loại bằng hình thái mã vạch trong phân loại động vật như khi mẫu còn tươi. Mẫu vây ngực (2 - 4g) được thu gien Cytochrme c oxidase subunit 1 (COI) và cố định riêng rẽ trong các ống eppendorf 2ml, giữ (Hebert và ctv., 2003; Puckridge và ctv., trong cồn 96o. Các mẫu cá sau đó được bảo quản lạnh 2013), Cytochrome b (Sevilla và ctv., ở - 200C cho mục đích phân tích sinh học phân tử sau 2007), 16s rRNA (Vences và ctv., 2005). này. Trong đó, vùng nhỏ của gien cytochrome b cũng được xem là một marker tiềm năng 2.2. Phương pháp xây dựng quy trình cho mục tiêu này. 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vây cá Tra Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào Quy trình tách DNA từ mẫu vậy là quy trình tủa được thực hiện để xây dựng quy trình phân muối được mô tả như trong Hình 1. tích đoạn gien Cytochrome b trên mẫu cá Tra (P. hypophthalmus) phục vụ cho mục Eppendorf chứa mẫu đích nghiên cứu kiểm định. Do đó, nghiên 500µl Solution 1 đã cắt mịn 5x5 mm + 5 µl cứu này nhằm góp phần xây dựng quy ProteinaseK Votex nhanh trình phân tích đoạn gien Cytochrome b trên các mẫu cá Tra (P. hypophthalmus). Ủ ở 550C /3 giờ hoặc qua đêm II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG Bỏ trên đá 10 phút PHÁP XÂY DỰNG QUY TRÌNH 240 µl Solution 2 2.1. Vật liệu nghiên cứu và thời gian Đảo vài lần, bỏ trên đá 5 phút thực hiện 2.1.1 Thời gian thực hiện Ly tâm 8000 rpm /15 phút - Thời gian thu mẫu: 8/2014 – 8/2015 Cẩn thận hút 300 µl dịch trong 500 µl ethanol - Thời gian thực hiện phân tích đoạn 100 % lạnh cytochrome b: 9/2015 – 6/2016 Ủ ở 40C/2 giờ Địa điểm thực hiện: Phòng sinh học Ly tâm 11000 rpm /15 phút phân tử, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Bỏ dịch nổi 500 µl ethanol 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 70 % lạnh - Mẫu được thu thập là cá da trơn Ly tâm 11000 rpm /5 phút thuộc họ Pangasiidae từ các sông lớn tại Bỏ dịch nổi, làm khô ở 370C các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Tiền Giang và Bến 100 µl TE Tre. Thời gian thu và phân tích mẫu được Bảo quản ở -25 0C tiến hành nhiều lần trong năm 2014-2015. - Thu mẫu cá Tra từ các trại giống Hình 1. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu vây cá và trung tâm nuôi thương phẩm: Trung DNA tổng số sau khi tách chiết được bảo quản ở tâm giống thủy sản Caseamex, Trại giống 4 C. Trước khi tiến hành khuếch đại bằng phản ứng 0 Năm Hổ Cai Lậy, Trung Tâm giống và kỹ PCR, kiểm tra định tính và định lượng DNA tổng số 20 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và sử hiện trên máy PCRPeqSTAR 96X Universal dụng máy Nanodrop 1000. Gradient Thermocycler. 2.2.2. Xác định điều kiện khuếch đại trình Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tự Cytochrome b bằng PCR mồi được thiết kế lần lượt bởi Russell và ctv., Để nhân đoạn vùng Cytochrome b của gen (2000) và Wolf và ctv., (2000) có trình tự như ty thể, phản ứng PCR được chuẩn bị và thực sau: Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ gắn mồi L14735 5’AAAAACCACCGTTGTTATTCAACTA3’ H15149ad 5’GCICCTCARAATGAYATTTGTCCT CA3’ 52,6oC  Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR (theo công bố của tác giả Li Lian Wong (2011) Bảng 1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 2 phút 94 30 giây 35 Ta 40 giây 72 1 phút 1 72 10 phút Ta: Nhiệt độ bắt cặp. 2.2.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR lượng cho kết quả giải trình tự trong bước tiếp Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra lần theo. Các bước tiến hành được thực hiện theo lượt trên gel agarose 2%. Trong bước điện di kit như sau: này, chúng tôi sử dụng dung dịch đệm TAE Bước 1: Thêm 5 lần thể tích đệm PB với (Tris-acetate-EDTA) và dung dịch Ethidium 1 thể tích mẫu. Sau đó trộn đều và chuyển vào bromide được bổ sung trực tiếp vào gel agarose cột SV trước khi thực hiện đổ gel vào khuôn điện di. Bước 2: Đặt cột vào máy ly tâm 12000 vòng Sau đó, mẫu được nạp và điện di trong dung trong 30 giây, sau đó đổ bỏ dịch chảy xuống và dịch SB 1X với hiệu điện thế 120V, 60mA. Sản thu lại cột SV phẩm PCR phân tách được soi, kiểm tra và chụp Bước 3: Thêm 700 µl đệm NW, sau đó ly ảnh dưới ánh sáng UV. tâm 12000 vòng trong 30 giây và đổ bỏ dịch 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR chảy xuống rồi thu lại cột SV. Trước khi tiến hành giải trình tự, tất cả Bước 4: Tiến hành ly tâm thêm 1 phút ở sản phẩm PCR được tinh sạch bởi kit ExpinTM 12000 vòng để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa NW. PCR SV của hãng GeneAll để đảm bảo chất Sau đó chuyển cột SV vào ống 1,5 ml mới. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 21
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bước 5: Nhỏ 50 µl dung dịch đệm EB hoặc đuôi của file giải trình tự cho thích hợp với các H2O vào giữa màng của cột SV và ủ trong 1 phút phần mềm xử lý sau này. Kế tiếp, đối với phần rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút. Sau đó, thu mềm Bioedit được sử dụng để chỉnh sửa, thay lại sản phẩm tinh sạch và đo Nanodrop để kiểm đổi, so sánh mồi xuôi, mồi ngược nhằm chỉnh tra độ tinh sạch DNA trước khi tiến hành giải sửa những nucleotide không rõ ràng nhằm tăng trình tự trong bước tiếp theo. độ tin cậy của mẫu. 2.2.5. Giải trình tự vùng Cytochrome b 2.2.7. So sánh trình tự với dữ liệu NCBI của gen ty thể Bước 1: Đăng nhập cơ sở dữ liệu NCBI Sau khi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. NCBI sử và đo nồng độ trên máy Nanodrop 1000, chúng dụng BLAST để so sánh trình tự được đưa vào tôi tiến hành gửi mẫu đi giải trình tại First BASE Laboratories, Malaysia. cơ sở dữ liệu của trình tự đáp ứng công ước quốc tế dựa vào tiêu chuẩn cho mã vạch DNA 2.2.6. Đánh giá chất lượng, phân tích và Cytochrome b sắp xếp trình tự bằng phần mềm FinchTV và Bioedit Bước 2: Chọn “BLAST” từ menu ở phía Các trình tự từ nghiên cứu sau khi nhận về phải của trang chủ để thực hiện bước tìm kiếm từ công ty giải trình tự được xử lý cơ bản để đạt dữ liệu và gióng hàng với trình tự gốc của dữ được một trình tự hoàn chỉnh nhằm chuẩn bị cho liệu NCBI bước xử lý sau này. Phần mềm FinchTV dùng Bước 3: Chọn “Nucleotide Blast” từ màn để kiểm tra chất lượng trình tự và chuyển đổi hình chính của BLAST (Hình 2.) Hình 2: Màn hình chính của phần mềm BLAST, NCBI 22 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bước 4: Dán chuỗi trình tự vào mục “Enter query sequence in fasta format” và kích “BLAST”. Bước 5: Nhìn vào kết quả tìm kiếm NCBI cho biết những loài gì được tìm thấy gần nhất với đoạn trình tự được tra tìm. Kết quả cho biết về Mức độ bao phủ (Query cover), mức tương đồng (Identification) với loài gần nhất Bước 6: Kích vào nút “Taxonomy reports ” và “Distance tree of results”trên trang web để xem báo cáo về phân loại và cây phát sinh Hình 3. Kết quả kiểm tra chất lượng chủng loại mà cơ sở dữ liệu NCBI xây dựng. DNA bằng gel agarose Dựa vào kết quả trên Hình 3, cho thấy DNA 2.2.8. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên tách chiết được với hàm lượng lớn, không bị đứt cứu và xác định giá trị quan hệ loài gãy, sạch và ít bị nhiễm RNA. Ngoài ra, chúng Dữ liệu trình tự Cytochrome b của cả mẫu tôi dùng máy đo Nanodrop để kiểm tra một cách mới giải mã và dữ liệu có sẵn trong ngân hàng chính xác hàm lượng và mức độ tinh sạch cua gen sẽ được chuẩn bị để phân tích khoảng các sản phẩm DNA (Bảng 2). di truyền giữa các mẫu bằng cách sử dụng Bảng 2. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng phần mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura và máy đo nồng độ Nanodrop ctv., 2007). Sử dụng phương pháp Neighbour- joining (NJ) và mô hình khoảng cách Kimura 2-Parameter (K2P) (Kimura, 1980) có trong phần mềm MEGA để xây dựng cây phát sinh chủng loại của Cytochrome b. Với bộ dữ liệu gốc, bootstrap 1000 lần được thực hiện nhằm đánh giá độ tin cậy của sự phân nhánh trên các cây phát sinh chủng loại NJ. Các chỉ số Từ kết quả trên ở Bảng 2 cho thấy hàm về sự khác biệt trong cùng loài và cùng giống lượng DNA thu được tương đối cao và chỉ số (conspecific and congeneric divergences) sẽ OD 260/280 điều nhỏ hơn 1,8. Điều này cho được tính toán. Các dữ liệu được phân nhóm thấy phương pháp tách chiết DNA bằng tủa (putative species clusters) dựạ vào cây phát muối hoàn toàn thích hợp cho nghiên cứu của sinh chủng loại NJ. Các nhóm được cho là đề tài. cùng loài khi có độ chênh lệch hay khác biệt 3.2. Phản ứng PCR dưới 2%. 3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR Từ kết quả điện di trên gel agarose (Hình 4) III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN cho thấy sản phẩm PCR nằm trong khoảng 430 3.1. Kết quả tách chiết DNA bp. Sản phẩm PCR tốt ở tất cả hầu hết nhiệt độ Để thử nghiệm qui trình tách chiết DNA, lai. Do đó, nhiệt độ Ta thích hợp cho phản ứng chúng tôi tiến hành tách trên 7 mẫu vây cá Tra khuếch đại sẽ được lựa chọn theo công bố của thu được ở Long Xuyên, tỉnh An Giang. tác giả 52,6oC. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 23
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4. Kết quả tối ưu mồi cytb 3.2.2. Kết quả phản ứng PCR Hình 5. Kết quả chạy PCR với cặp mồi cytochrome b. Kết quả PCR trên một số mẫu cá Tra ngẫu Trình tự nhận được từ công ty First BASE nhiên (Hình 5) cho thấy quy trình chạy của tác Laboratories, Malaysia có 2 file với hai đuôi giả cũng hoàn toàn thích hợp cho điều kiện AB1 và SEQ, dùng file đuôi AB1 cho phần phòng thí nghiệm của đề tài mặc dù sản phẩm mềm FinchTV. DNA khuyếch đại có hàm lượng hơi thấp. Tuy Từ màn hình chính (Hình 6), nhập “Open” để nhiên, điều này sẽ được điều chỉnh khi tăng hàm nhập đoạn trình tự mong muốn kiểm tra chất lượng DNA đầu vào cho phản ứng PCR. lượng giải trình tự với đuôi file .AB1. 3.3. Phân tích và sắp xếp trình tự bằng phần mềm FinchTV Hình 6. Màn hình chính của phần mềm FinchTV 24 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 7. Kết quả kiểm tra chất lượng giải trình tự của sản phẩm Theo quy ước, mỗi một màu chỉ thị cho một sai khác giữa hai trình tự thì nucleotide sẽ được loại nucleotide, trong đó Adenine (A) = Xanh chọn dựa vào giá trị Q. Dựa vào giá trị Q của lá cây, Thymine (T) = đỏ, Cytosine (C) = Xanh FinchTV, chúng ta sẽ biết được bắt đầu vị trí dương, Guanine (G) = Đen (Hình 7). Từ kết nào sẽ bị cắt bỏ trong đoạn trình tự bằng phần quả cho thấy, tín hiệu đọc của mỗi nucleotide mềm Bioedit nhầm loại bỏ đi đoạn mồi được rõ ràng và tách biệt chứng tỏ kết quả đọc chính gắn vào trong qua trình giải trình tự. Đối với xác, rõ ràng, không bị tạp nhiễm. Ngoài ra, giá dữ liệu nhiều chuỗi trình tự, các trình tự này sẽ trị của chất lượng giải trình tự (Quality values) được gióng hàng, cắt bỏ hai đầu cho bằng nhau còn được thể hiện khi nhấp vào biểu tượng có và save lại ở một file dạng fasta chuẩn bị cho hình “Q” trên menu. Sau đó, khi nhấp chuột vào việc phân tích sau này. một nucleotide nào đó, ở góc dưới cùng bên trái 3.4. Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu sẽ hiện ra giá trị Q và vị trí của nucleotide. Ví trên NCBI dụ, khi nhấp chuột vào nucleotide ở vị trí thứ Những đoạn trình tự sau khi xử lý hoàn 428, giái trị Q được hiển thị là Q(10), điều này chỉnh, được sử dụng để so sánh với trình tự dữ có nghĩa là có nghĩa là nucleotide thứ 428 sẽ liệu trên NCBI. Các thao tác được thực hiện có xác suất đọc sai là 1/10. Khi giá trị Q này như sau: dán chuỗi trình tự muốn so sánh vào nằm ở 30 hoặc cao hơn thì việc đọc nucleotide ô “Enter query sequence”, Chọn “Pangasiidae” ở vị trí đó được xem là chính xác. Ngoài ra, khi trong ô Organism và nhấn nút BLAST (Hình 8). gióng hàng mồi xuôi và mồi ngược, nếu có sự Hình 8. Màn hình chính của phần mềm BLAST TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 25
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Kết quả được thể hiện như Hình 9. Hình 9. Kết quả so sánh trình tự của mẫu với dữ liệu trên NCBI của phần mềm BLAST Thông qua phần mềm BLAST, kết quả dụng việc kiểm định loài trong các thực phẩm (Hình 9) cho thấy sự tương đồng cao (99% -100 chế biến, việc này nhằm xác định sản phẩm %) của các trình tự nucleotide gen Cytochrome này có nguồn gốc từ các Tra hay từ các loài b của mẫu cá Tra trong nghiên cứu với trình tự cá khác. nucleotide của loài đã được công bố trên ngân 3.5. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên hàng gen NCBI. Từ đây, có thể kết luận kết cứu và xác định giá trị quan hệ loài bằng quả định danh bằng chỉ thị sinh học phân tử phần mềm Mega 6 cytochrome b có trùng khớp với kết quả định Các bước để tiến hành phân tích và vẽ cây danh bằng hình thái hay không và từ đó đưa ra phát sinh chủng loại gồm có: mức độ chính xác của phương pháp sinh học 1. Xác định mục tiêu, lấy mẫu sinh vật và phân tử. Bước phân tích này cũng được ứng họ gene; 26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2. Chọn marker phân tử, tức gene hay 9. Chấp nhận kết quả hoặc quay lại bước 2. protein cần đọc trình tự; Từ phầm mềm Bioedit, các bước từ 1 đến 4 3. Đọc trình tự, hiệu chỉnh trình tự; sẽ được thực hiện, trong đó, các trình tự muốn 4. Sắp xếp thẳng hàng các trình tự; nghiên cứu sẽ được gióng hàng và lưu trữ trên 5. Chọn mô hình tiến hóa; một file dữ liệu với đuôi được lưu là .fasta để chuẩn bị cho việc phân tích trong phần mềm 6. Phân tích sự phát sinh chủng loài; Mega 6. Phần mềm Mega 6 là phần mềm phổ 7. Đọc cây tiến hóa; biến được sử dụng rộng rãi trong việc xử lý kết 8. Kiểm tra cây tiến hóa; quả giải trình tự của các mẫu nghiên cứu. Hình 10. Màng hình chính cho Aligment của Mega 6 Sau đó, bước 5 và 6 sẽ được thực hiện với một ma trận khoảng cách giữa tất cả các taxa. phần mềm Mega 6. Trong phần mềm này, cây Do phương pháp neighbor-joining mà một phát sinh loài sẽ được thiết lập bằng chức năng trong những phương pháp nhanh nhất để dò tìm Phylogeny (Hình 11). Trong Phylogeny, chọn cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để phương pháp Test Neighbor-Joining Tree (NJ). phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa. Đồng Phương pháp neighbor-joining (NJ) có mô hình thời, trong phương pháp này sẽ chọn phân tích tiến hóa là một hàm hiện. Trong phương pháp bootstrap 1000 lần lặp lại. Phân tích bootstrap này từng cặp trình tự một sẽ được so sánh thẳng được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và hàng cặp đôi và ứng với từng cặp, khoảng cách độ tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa. di truyền sẽ được tính toán. Do mô hình tiến Đầu tiên, các vị trí từ chuỗi trình tự đã sắp xếp hóa là một hàm hiện nên một trong số mô hình thẳng hàng sẽ được đảo chỗ cho nhau một cách tiến hóa có thể được chọn để tính toán khoảng ngẫu nhiên để tạo ra nhiều mẫu phụ (gọi là sự cách di truyền giữa từng cặp taxa từ đó cho ra lặp lại bootstrap). Như vậy các mẫu phụ có kích TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 27
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II thước giống như mẫu gốc nhưng vị trí thành hộ) cho một nhánh đơn lẻ nào đó. Do giá trị phần không giống nhau. Sau đó các mẫu phụ sẽ support được biểu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất được trải qua quá trình phân tích tương tự như phải có 100 lần lặp lại, tức 100 lần tạo mẫu phụ. mẫu gốc đã trải qua. Kết quả từ những mẫu phụ Thông thường thì người ta làm với 1.000 lần lặp sẽ được dùng để tính toán giá trị support (ủng lại để đạt được mức độ tin cậy cần thiết. Hình 11. Màn hình của phần mềm Phylogeny Dựa vào kết quả từ cây tiến hóa, chúng ta nhưng giữa các mẫu cá dứa và cá xác sọc là sự có thể xác định sự phát sinh chủng loại của các khác biệt này là 6,62 %. Điều này cho thấy hai mẫu cần nghiên cứu dựa vào chỉ số được thể loài này là hai loài khác nhau hoàn toàn do có hiện trên từng nhánh cây. Ví dụ, theo hình 13, độ chênh lệch hay khác biệt trên 2% (Hình 12). những mẫu cá dứa có mức độ khác biệt là 0 %, Hình 12: Cây Neighbor-Joining (NJ) được xây dựng từ trình tự gen Cytochrome b của 9 mẫu cá nghiên cứu và trình tự của 2 loài: Pangasius macronema và Pangasius elongatus 28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Ngay sau khi có kết quả cây tiến hóa, tiến bật nhóm lòai cần chú ý trước khi công bố. hành thực hiện bước 7 đến bước 9, nhà nghiên Ngoài ra, Mega 6 cũng giúp tính toán cứu có thể so sánh kết quả với cây tiến hóa mà khoảng cách di truyền của những loài nghiên nhà nghiên cứu đã định nghĩa sẵn từ trước. Sự cứu bằng chức năng Distance  Compute sai khác giữa hai cây tiến hóa này có thể giúp pairwise distances dựa vào mô hình tính toán nhà nghiên cứu đi đến quyết định chấp nhận Kimura 2-Parameter (K2P). Kết quả nhận được kết quả hay quay lại hiệu chỉnh. Sau khi có cây như bảng 3, khoảng cách di truyền giữa các mẫu tiến hóa, nhà nghiên cứu có thể đưa cây tiến thuộc họ cá dứa và cá xác sọc là 0,137, kết quả hóa vào những chương trình xử lý hình ảnh đồ này đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa hai loài hòa thông thường để hiệu chỉnh hay làm nổi này. Bảng 3: Khoảng cách di truyền của các mẫu thuộc 2 loài trong họ Pangasiidae: Pangasius macronema và Pangasius elongatus IV. KẾT LUẬN mềm BLAST của dữ liệu NCBI đã so sánh và Quy trình phân tích đoạn gien xác định mức độ tương đồng của mẫu nghiên Cytochrome b hoàn toàn phù hợp với mục đích cứu với trình tự mẫu, nếu kết quả thể hiện là nghiên cứu kiểm định cá Tra. Các mẫu DNA sau 99-100%, kết luận mẫu nghiên cứu có mức độ khi được thực hiện phản ứng PCR đã tinh sạch tương đồng cao với mẫu đã được công bố ở dữ và giải trình tự. Các trình tự sau khi nhận từ liệu của NCBI. Cuối cùng, phần mềm Mega 6 công ty giải trình tự đã được kiểm tra chất lượng sẽ là phần mềm thích hợp cho các phân tích về và xử lý bằng kết hợp hai phần mềm FinchTV sự phát sinh loài và khoảng cách di truyền giữa và Bioedit để đạt được trình tự chuẩn xác nhất cá Tra và những loài cá da trơn khác trong họ cho các bước phân tích tiếp theo. Sau đó, phần Pangasiidae. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 29
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO DNA barcoding. Molecular Ecology Resources Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., 13, 32-42. deWaard, J.R., 2003. Biological identifications Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S, through DNA barcodes. Proceedings of the 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Royal Society of London. Series B: Biological Genetics Analysis (MEGA) software version Sciences 270, 313-321. 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596- Kimura, M., 1980. A simple method for 1599. estimating evolutionary rate of base Sevilla R, Diez A, Noren M, 2007. Primers substitutions through comparative studies of and polymerase chain reaction conditions nucleotide sequences. Journal of Molecular for DNA barcoding teleost fish based on the Evolution 16:111-120. mitochondrial cytochrome b and nuclear MRC, 2008. Mekong River Commission, Phnom rhodopsin gienes. Mol Ecol Notes 7:730–734. Penh Vences, M, 2005. Comparative performance of Puckridge, M., Andreakis, N., Appleyard, S.A., the 16S rRNA gene in DNA barcoding of of Ward, R.D., 2013. Cryptic diversity in flathead amphibians. fishes (Scorpaeniformes: Platycephalidae) http://www.fishbase.org (ngày 16/07/2016) across the Indo-West Pacific uncovered by 30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II PROCESS OF ANALYSIS FOR CYTOCHROME B GEN ON TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) SAMPLES Tran Nguyen Ai Hang1*, Tran Thi Thuy Ha1 ABSTRACT For identify Tra catfish (Pangasianodonhypoph-thalmus), process of analysis for cytochrome b gen was built. Using the universal primer for cytochrome b gen to amplify PCR products about 430 bp for length from Tra catfish and other catfish samples belonging to Pangasidae. After cleaning process, products were sent to sequence. Before using for the analyzed steps, these sequences will be pre-treated to get the best sequences by two software such as FinchTV and Bioedit. Next, using BLAST to find a similarity with species was published in the database of NCBI. Finally, Mega 6 software would be use to analyze genetic distance as well as building Neighbor-Joining tree subspe- cies which also confirm close relationships between these species in the same family Pangasiidae. Keywords: Tra Catfish, Cytochrome b, Finch TV and Bioedit, Pangasianodon hypophthal- mus, Mega 6. Người phản biện: ThS. Bùi Thị Liên Hà Ngày nhận bài: 26/7/2016 Ngày thông qua phản biện: 10/8/2016 Ngày duyệt đăng: 05/9/2016 1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No.2 2 Research Institute for Aquaculture No.1 *Email: hangtna.ria2@mard.gov.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 31