Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase của một số loài thuộc họ dâu tằm (moraceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nhằm góp phần tìm kiếm các loại dược liệu cho tác dụng trị đái tháo đường, đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định các loài thuộc họ Moraceae cho các cao phân đoạn có tác dụng ức chế enzym a-glucosidase. Để tài được tiến hành trên 21 mẫu thực vật thuộc 3 chi Artocarpus, Ficus và Moms, được thu hái từ tháng 7- 11 năm 2014.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase của một số loài thuộc họ dâu tằm (moraceae)

KẾT LUẬN 213-225. 1. CTP và CP chiết xuất từ quả dứa dại với iiều 5. Dhawan B.N (1997), Hepatoprotective activity o f íương đương 7,2 g dược liệu/kg và 14,4g dược liệu/kg natural products experimental evaluation. International "có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương workshop on medicinal plants their bioactivity, gan cấp bang PAR tren chuột nhắt trắng. screening and evaluation. Lucknow, L15 2. C T P và C P chiết xuẩt từ quả dứa dại với liều 6. Hewawasam R.P., Jayatilaka K.A., Pathirana c., tương đương 7,2 g dược !iệu/kg có tác dụng làm tăng Mudduwa L.K. (2003), Protective effects of phục hồi tổn thương gan trên mo hình gây ton thương Asteracantha longifolia extract in mouse liver injury gan bằng PAR trên chuột nhắt trắng. induced by cacbon tetrachloride and paracetamol. TÀI LIỆU THAM KHẦO _ Pharm pharmacol 55(10), pp 14 13 -1 4 1 8 . 1. Phạm Hoàng Phiệt (2001), Tồng quan tình hình 7. Lin S. c ., Chung T.C., Un c.c. (2000), viêm gan siêu vi B ờ việt N am ' Hội thảo khoa học về Hepatoprotective effects o f Artium lappa on carbon điều trị viêm gan B ngày nay: Triển vọng mới cho bệnh tetrachlorid and acetaminophen- induced live damage. nhân viêm gan B mạn tính, Hồ Chí Minh tháng Am J Chin Med 28 (2), pp 163-173. 12 / 2001 . 8. Stephan u., Ruepp, Robert p. Tonge and al 2. Ngô Hữu Hà (2004), Nghiên cứu tình hình ngộ (2002), Genomics and proteomics analysis of độc cấp các thuốc thường gặp tại trung tâm chống độc acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicological Bệnh viện Bạch M ai trong 2 năm 2002 -2003, Luận science? vol 65, pp 135-150. văn tốt nghiệp Bác s ĩ chuyên khoa cấp II, Trường đại 9. Đào Văn Phan (2004), Các thuốc giảm đau học Y Hà Nội, tr46 . chống viêm. Nhà xuất bản Y học. tr 61 - 65. 3. Đỗ Tất Lợi (1999) Những cây thuốc và vị thuốc 10. Londonkar R. and Kamble A. (2009), Việt Nam, NXB Khoa học và Ky thuật, Hà Nội, tr 792 - Evaluation of free radical scavenging activity of 794. Pandanus odoratissimus. International journal of 4. Kathleen A.D. (1998), Hepatic principles. pharmacology 5(6), pp 377-380 Tocxicoíogic emergencies, Jeanman M.Roche, pp SÀNG LỌC I N V I T R O TÁC DỤNG ứ c CHÉ a - GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC HỌ DÂU TẰWI (MORACEAE) CN. Trịnh Túy An (Nghiên cứu viên, TT ĐT&NCPT Thuốc Có Nguồn Gốc Tự Nhiên, Đ H Y D ư ợ c TP. HCM) DS. Nguyễn Linh Nhâm (Học viên cao học, ĐạÍHọc Y Dược TP. Hồ Chí Minh) Hướng dẫn: PGS. TS. Huỳnh Ngọc Thụy (Bộ Môn Dược Liệu, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh) TÓM TẮT Nhằm góp phần tỉm kiểm các loại dược liệu cho tác dụng trị đái tháo đường, đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định câc loài thuộc họ Moraceae cho câc cao phân đoạn có tốc dụng ức chế enzym a-glucosidase. Để iài được tiến hành trên 21 mẫu thực vật thuộc 3 chi Artòcarpus, Ficus và Moms, được thu hài từ thàng 7 - 1 1 năm 2014. Khảo sát điều kiện tiến hành thử nghiệm, sàng lọc mẫu cao chiết cho tẩc dụng ức chế mạnh nhẩt, đảnh giá kết quả bằng phần mềm Sigma Plot 10.0, phân lập vẩ tinh chế chất tinh khiết. Từ 60 bộ phận dùng của 21 dược liệu, thu được 180 cao chiết ở dạng cắn khô. Sàng lọc 180 mẫu cao toàn phần, ờ nồng độ 0,01 mg/ml, mẫu cao cồn thân vầ (Ficus aurìculata) thu hâi tại Bình Dương cho tác dụng ức chế mạnh nhẫỉ (91,95% ± 0,012). Phàn tốch và-xốc định ICõo các cao phân đoạn từ mẫu cao toàn phần trên, cao phân đoạn ethyl acetat cho già trị ICso thấp nhất (0,162 pig/mi). Từ phân đoạn ethyl acetat, phân lập được hai chất tinh khiết Fa1 (1,2 mg) và Fa2 (9,8 mg) với độ tinh khiễt lần lượt là 82,06% và 95,70%. Từ khóa: đắi thào đường SUMMARY SC R EEN IN G IN VITRO BIO ACTIVE a-GLU CO SID ASE INHIBITORY IN SOM E S P E C IE S O F MORACEAE FAMILY Trinh Tuy An Bachelor of Science in Biology (Research and Development of Natural based Medicines, University of Medicine and Pharmacy, HCMC.) Nguyen Linh Nham Pharmacist (University of Medicine and Pharmacy, HCMC.) instructor. Huynh Ngoc Thuy Assoc. Prof., Dr. (Department of Pharmacognosy, University of Medicine and Pharmacy, HCMC.) By selecting plants which have great inhibition o f a-glucosidase, this research tend to find out some medical plants from Moraceae family that are the potential sources o f lead compounds to study for new medicaments for the treatment o f diabetes mellitus. The samples o f 21 plants o f three genera Artocarpus, Ficus and Morus were collected in provinces o f southern part o f Vietnam in September, 2014. The inhibitory activity o f extracts against yeast a-glucosidase (Sigma) was determined using modified procedure described by Wang et al. (2013). 60 parts used o f 21 plants were extracted to give 180 extracts. Modifying the procedure gave the results that the solvent -714-
solube was DMSO 100% (Sigma); the concentration o f enzyme and PNPG were 0.1 u/ml and 0.1 mM, respectively; the absorbance was determined after 30 minutes when adding PNPG. Among the 180 extracts tested, ranging to 0.01 mg/ml, the result showed that the most active extract was the extract from sterm o f Ficus auriculata which was collected at Binh Duong (91.95% ± 0.012). Fraction and determining the ICso o f fractions from this extract. The ICso o f ethyl acetat fraction was lowest (0.162 ụg/ml). From the ethyl acetat fraction, isolation two pure compounds that were Fa1 (1.2 mg) and Fa2 (9.8 mg) with the purity tested on HPLC were 95.46% and 95.13%, respectively. Keywords: Ficus auriculata ĐẶT VẤN ĐÈ VÀ MỤC TIỀU NGHIÊN cứu Mẫu được chiết lần lượt với những dung môi có độ Theo số liệu ỉhống kê năm 2011, trên toàn thế gỉớí phân cực tăng dần như cloroform, ethanol 9 6 % vẩ có khoảng 347 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, nước; sau đó loại dung môi thu các cao toàn phần với hơn 3,'4 triệu người chết (2004)(17). Tại Việt Nam, tương ứng để tiến hành thử nghiệm sàng lọc in vitro số người mắc bệnh đái tháo đường là 3,16 triệu người trên mô hình ỉhử íác dụng ức chế a- glucosidase. (2012), tương tương 5 ,2 9 % dân số trưởng thành. 1.2. Dung môi hóa chất Một ỉrong số những phương pháp điều trị đái tháo Dùng cho thử nghiệm hoạỉ tính ức chế a- đường là khống chế lượng đương huyết sau ăn bằng glucosidase: a-glucosidase íừ Sacchammyces cách ngăn cản sự hấp thu carbohydrate qua việc ức cerevisiae, p-nitrophenyl a-D-glucoside (PNPG), chể enzym thủy giải carbohydrat như a-glucosidase. potassium monophosphat, potassium diphosphaí, Hiện nay trên thị trường đã lưu hành nhiều loại thuốc dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma); MeOH (Merck) và điều trị đái tháo đường theo cơ chế nêu trên như nước cất hai lần. acarbose, voglibose và migliỉol nhưng lại gây ra những Dùng cho chiết xuất và phân lập chất tinh khiết định tác dụng phụ trên dạ dày và ruột. Chính mặt hạn che hướng ưc chế a-glucosidase: n-hèxan PA, chloroform này đã ỉhức đẩy việc tìm kiếm những dược liệu có khả PA, ethyl acetat PA, methanol PA và acid formic năng điều hoà đường huyết, hỗ trợ điều trị cho bệnh (Chemsol và Labscan); silica ge! F254 (Merck) dùng nhân đái ỉháo đường để hạn chế các tác dụng phụ từ cho sắc ký lớp mỏng; silica gel (Trung Quốc) cỡ hạt việc sử dụng thuốc tong hợp. mịn ( 1 5 - 4 0 ụm) dùng cho sắc ký cột. Những cây thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) từ lâu đã ì.3.Dụng cụ thiết bị được sử dụng rộng rãi trong dân gian với nhiều công Máy Ẻlisa iMarkTM Microplate Absorbance Reader dụng khác nhau, ỉrong đó một số cây như sake, mít, (BIO-RAD); hệ thống HPLC-PD A 2695 (Waters); máy ngái, dâu tằm... được sử đụng với mục đích trị đái đo pH eco Testr pH2; cân phân tích BP - 221 s tháo đường. Đây cũng là những loài được quan tâm (Satorius); cột sắc ký thủy tinh, dài 60 cm, đường kính nghiên cứu trên thế giới, theo những kết quả được trong 4 cm, có Khóa; đĩa 96 giếng và các dụng cụ công bổ, một số chất phân lập từ những cây thuộc họ íhường quy khác trong phòng thí nghiệm. Dâu íằm đa được chứng minh tác dụng hạ đường 1.4. Nơi thực hiện đề tà ĩ huyết như luteolin, oxyresveratroí, 1-deoxynojirimicin... Khâu chuần bị mẫu và chiết xuất tách phân đoạn Những dược liệu khác thuộc họ Dâu tằm do tương được thực hiện ờ Bộ môn Dược liệu, phần thử nghiệm đồng về íhành phần hóa học nên được kỳ vọng có the in vitro sàng iọc tác dụng ức chế a-glucosidase Ổược cho íác dụng trị đái tháo đường như những cây cùng tiến hành tại Bộ môn Sinh hoá, Khoa Dược, Đại học Y họ đã đưực nghiên cửu. DượcTP.HCM . Nhằm góp phần tìm kiếm các loại dược liệu cho tác Bảng 1. Mẫu dùng cho thử nghiệm sàng lọc in vitro đụng trị đái tháo đường, đề íài "Sàng !ọc in vitro tác tác dụng ức chế a - giucosidase dụng ức chế enzym a-giucosidase cùa một số loài thuộc họ Dâu tằm (Moraceae)” được thực hiện với Tên khoa học Bộ phận Tên Vùng thu dùng Việt hái mục tiêu chính là tim kiếm và xác định các loài thuộc Nam họ Moraceae cho các cao phân đoạn có tác dụng ức Artocarpus altilis (Park.) Lá, thân, rề Sake TP. Hô Chí chế enzym a-giucosidase dựa trên phương pháp Fosb. Minh nghiên cưu thích hợp nhất được chọn lọc từ cac tài Artocarpus Lá, thân, rễ Mít TP. Hồ Chí liẹu tham khảo. heterophyllus Lam. Minh ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Artocarpus integer Lá, thân Mít tổ TP. Hò Chí 1. ĐỐI tượng ng hiên cứu (Thunb.) Merr. nữ Minh 1.1. Nguyên liệu Ficus aurículata Lour. Lá, thân, rễ Vả Tĩnh Binh 21 mau thực vậí !à các loài thuộc 3 chi lớn Phước Artocarpus, Ficus và Morus trong họ Moraceae được Ficus aurìculata Lour. Lá, thân Vả TP. Huế íhu hái ờ nhiều tỉnh thành khác nhau như Kiên Giang, Ficus aurículata Lour. Lá, thân, rẽ Vả • Tĩnh Binh rừng Dương Đồng Tháp, thành phố Hồ Chí Minh, Binh Dương, Ficus benjamina L. Lá, thân, Si TP. Hồ Chí Binh Phươc, Lâm Đồng, Bình Định và Phú Thọ. Thơi rễ, rễ phụ Minh gian thu mẫu kéo dài íừ tháng 7 đến hết tháng 11 năm Ficus elastica Roxb. ex Lá, thân, Đa búp TP. Hồ Chí 2014. Mẫu thu hái được xác định loài, xử íý sơ bộ, mã Horn. rễ, rễ phụ đỏ Minh hóa và lưu mẫu tại Bộ môn Dưực liệu, Đại học Y Dược Ficus heterophyllus L Lá, thân, rề Vú bò Tĩnh Bình TP.HCM. Phước -715-
Ficus hirta Vahl Lá, thân, Vú bò Tỉnh Binh Bảng 2. So sánh thành phần íham gia phản ứng thân rễ Phước giữa cảo loại mẫu ________________ Ficus hispida L.f. Lá, thân, rễ Ngái Tỉnh Bình Mầu thử Enzym PNPG Đêm Phước I/ỉẫu trắng + + Ficus hispida L.f. Lá, thân Ngái TP. Hồ Chí Mấu chuấn + + + Minh Mâu chứng + + + Ficus microcarpa L.f. Lá, rể phụ Gừa Tỉnh Đồng trắng TUA* ỉ 1\aụ Mâu thứ + + + + Ficus pumila L. Lá,thân Sung TP, Hồ Chí thằn lằn Dưới sự xúc tác của enzym a-giucosỉdase, phản Minh Ficus racemosa L. Lá, thân, rê Sung TP. Hô Chí ứng phân giải PNPG cho ra hai sản phầm ià a-D- Minh glucose và p-nitrophenol (P N P ). PNP là một chát màu Ficus regliosa L. Lá, thân, rê BÒ ổề TP. Hô Chí vàng, có cực đại hấp thu ở 415 nm, do vậy PNP sinh Minh ra có thể được định lượng bằng cách đo độ hấp thu Morus alba L. Lá, thân, rế Dâu Tỉnh Bình quang tại bước sóng 4 15 nm. Khi ỉhêm vào hỗn hợp tằm Định phản ứng mẫu cao chiết dược liệu có tác dụng ức che Morus alba L Lá, thân, rễ Dâu TP. HỒ Chí a-glucosidase, dẫn đến giảm hàm lượng PNP sinh ra, tằm Minh màu vàng nhạt hoặc mất hẳn. So sánh hàm lượng Morus alba L. Lá, thân, rễ Dâu Tình Kiên PNP sinh ra giữa mẫu thử (có sự hiện diện của tác tằm Giang nhân gây ức chế Morus alba L. Lá, thân, rễ Dâu Tỉnh Lâm a-glucosidase) và mẫu chuẩn (a-glucosidase hoàn tằm Đồng Morus alba L. Lá, thân, rễ Dâu toàn không bị ức chế) để xác định phần trăm ức chế a- Tình Phú tằm Thọ glucosidase của mẫu cao chiết dược ííệu. 2. Phương pháp nghiên cứu Quá trinh sàng lọc in vitro íác dụng ửc chế a- 2.1. Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế ơ-glucosidase được tiến hành trên đĩa 96 giếng, bao glucosidase gồm năm thiết kế thỉ nghiệm chính: (1 ) khảo sát tỷ lệ Dược liệu được xay nhỏ thành bột, rây qua rây 2 DMSO hòa tan mẫu tốt nhẩt (khảo sát các tỷ lệ 10, 25, mm. 20 g dược liệu được chiết kiệt bằng phương pháp 50, 75 và 100%), (2) khảo sốt ảnh hưởng của dung đun hòi lưu ơ 95 ° c lấn lượt với ba dung môi có độ môi hòa tan mẫu lên các íhành phần tham gia phản phân cực tăng dần: chloroform, ethanoi và nước. Loại ứng (khảo sát trên nhiều đung môi khác nhau như dung môi thu cao toàn phần. Cao toàn phần của mẫu DMSO, methanol và hỗn hợp DMSO - methanol thử được hòa tan trong dung môi DMSO (tỷ iệ DMSO (1:1)), (3) khảo sáí động học phản ứng giữa a- sử dụng sẽ được khảo sát). Nồng độ dung dịch mẹ glucosidase và PN FG (theo dõi sự ổn định độ hấp ỉhu của mau thử iẩ 1 mg/ml. Pha dung dịch đẹm kaii quang sau thời gian phản ứng để lựa chọn thời điểm phosphat 50 mM (pH 6 ,8 ), dung dịch a-glucosidase 0.1 đo), (4) dò liều toi thiếu ức che a-giucosidase írên 8 0% u/mi và PNPG 0.1 mM trong dung dịch đệm phosphat. của các cao chiết (giảm dần từ nồng độ ban đầu của Nồng độ các chất và mẫu thử ià nồng độ cuổi cùng mẫu thử ià 1 mg/ml) và (5) xác định IC 50 các phân trong giếng. đoạn íừ mẫu cao chó tác dụng ức chế a-glucosidase Đề tài đã tham khảo 146 tài liệu báo cáo về thử mạnh nhất. Tùy theo mỗi thiết kế thí nghiệm sẽ có sơ nạhiệm tác dụng ức chế a-glucosidase từ năm 1992 đồ bố ỉrí thí nghiệm tương ứng trên đĩa 96 giếng. Trên đen năm 2014, đáng lưu ý số lượng nghiên cứu về mỗi đĩa 96 giếng bố trí đầy đủ các mẫu trắng, mẫư vấn đề này tăng đột biến từ năm 2005 đến 2014 và chứng, mẫu chưng trắng va mẫu thử với một cơ số trong số đó, 23 tài liệu tham khảo có đối tượng nghiên mẫu thử đảm bảo có tính ỉhống kê. Thử nghiệm được cứu là các dược liệu thuộc họ Moraceae. Sau khi tham lặp lại ít nhất 3 lần láy giá trị trung binh và xác ổịnh độ khảo đối chiểu giữa các quy trình, quy trinh nghiên lệch chuẩn tương đối. Ầp dụng phần mềm Sigrria Plot cứu của Wang Z.W. và cộng sự (2013)(19) đã được 10.0 dựng đường phi tuyến để tư đó xác định IC 50. Kết chọn đề tham khảo xây dựng quy trinh sàng lọc in vitro quả phần trăm tác dụng ức chế a-giucosidase của tác dụng ức chế a-glucosidase do quy trình thử rnẫu thử được tính toán theo công thức: nghiệm này được tiến hành trong thời gian ngắn (90 % ứ c che a-glucosidase = X 100 phút), lượng enzym và PNPG sử dụng vừa đủ cho 2.2. Phân lạp chất tinh khiết theo định hướng phản ứng xảy ra hoàn toàn, quy trinh có tính lập lại và cho tác dụng ức chế a-glucosidase điều kiện tiến hành thử nghiệm phù hợp với khả năng Chọn mẫu có tác dụng ức chế a-giucosỉdase mạnh phòng thí nghiệm tại chô. Quỳ trình bao gồm năm nhất đề tiến hành thu mâu lượng lớn, khảo sát đặc bước chính: (1) thêm vào mỗi giếng 150 \xị đệm điểm hình thái thực vật, cấu tạo vi học của dược liệu tươi cũng như bột dược liệu và định tính sơ bộ thành phosphate (50 mM, pH 6 .8 ), 10 ịil mẫu thử (1 mg/ml) phần hóa íhực vật. Chiết nóng dược liệu ở 95 ° c với và 10 \xì enzym (0.1 u/m!) —> (2) ủ ở 37 ° c trong 60 cồn 9 6 % trong 12 giờ, lọc dịch chiết và loại dung môi phút - * (3) them 30 PNPG (0.1 mM) — (4) ủ tiếp ở thu cao toàn phần. Phân tách các phân đoạn tư cao 37 ° c tròng 30 phút ’->• (5) đo độ hấp thu ờ bứớc song toàn phần bằng kỹ thuật lắc phân bố lỏng - lòng lần 415 nm. Tiến hanh đồng thời mẫu trắng, mẫu chứng, lượt với 3 dung môi có độ phân cực khác nhau: mẫu chứng trắng và mẫu thử trên cùng một đĩa 96 chloroform, ethyl acetat và methanol. Sàng lọc in vitro giếng; mỗi loại mẫu gồm cốc thành phan phản ứng tác dụng ức chế a-glucosicfase trên các phân đoạn khác nhau: -716-
nảy, từ phân đoạn cho tác dụng ức chế a-glucosidase Bảng 5. IC50 các cao phân đoạn từ mẫu cao thân mạnh nhất, phận lập các phân đoạn nho hơn bằng Và (Ficus auriculata) thu hái tại Bình Dương phương pháp sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi khai triển CHCI3 - EtOAc, tăng dần độ phân cực theo tỷ íệ Cao phân đoan ỈC50 từ (100:0) đến (85:5). Kiểm tra các phân đoạn trên sắc CHCb 2.365 ký lớp mỏng với hệ dung môi phân tfch CHCI3 - MeOH EtOAc 0.162 - Acid formic (8,5:1,5:0,5). Tinh chế chất thu được MeOH 4.200 bằng phương pháp kết tinh phân đoan. K E T Q U A NGHIÊN c ứ u Từ 6 mẫu có tác dụng mạnh nhất này, dò liều tối Từ 60 bộ phận dùng của 2 1 dược liệu, thu được thiểu ức chế a-glucosidase trên 8 0 % của các cao 180 mẫu cao chiết ở dạng cắn khô. chiết. Kết quả cho thấy ờ nồng độ 0,01 mg/mi mẫu cao Các mẫu được bảo quản ở 12 - 15 c trong lọ nâu thân Vâ (Ficus aurícúlata) thu hài tại Bỉnh Dương cho tránh ánh sáng. Kết quả khảo sát tỷ lệ DMSO hòa tan íác dụng ức chế a-glucosidase mạnh nhấí (91,95% ± mẫu cho thấy mẫu chỉ ían hoàn toàn trong DMSO 0,012). Sau khi phân ìách các cao phân đoạn 10 0%. Kếỉ quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi hòa chloroform, ethyl aceíat và methanol íừ mẫu cao toàn tan mẫu chứng minh đây là dung môi không ảnh phần ỉrên, xác định ịCso các cao phân đoạn. Cao phân hưởng đáng ke đến các íhành phan tham gia phản đoạn ethyl acetaí cho giá trị IC 50 ìhấp nhất (0,162 ứng (DMSO cho tác dụng ức chế a-glucosidase ỉ-tg/mỉ), thấp hơn nhiều lần so vởi IC50 của chứng 8,23%). Kếỉ quả khảo sát động học phản ứng giữa a- dương genisíein (10,21 |ig/ml) và oxyresveratrol glucosidase và PNPG đi đến kết iuạn chọn thơi điểm (10 ,11 ng/mi), chứng minh cao phân đoạn ethyl acetaí đo độ hấp thu là phút ihứ 30 sau khi thêm PNPG. cho tác dụng ức chế a-glucosidase mạnh nhất. Sàng lọc in vitro tốc dụng ức chế a-c|lucosidase của Tiếp tục tiến hành sàng lọc các phân đoạn nhỏ hơn 180 mâu cao chiết ở các nồng độ mau thử 1; 0,5 và của cao phân đoạn ethyi acetat. Kỹ thuật sắc ký cộí 0,25 mg/mi. ở nồng độ 0,25 mg/ml 75 mẫu cho kết được dùng để íách phân đoạn ethyi acetaí với hệ dung quả phan trăm ức chế a-glucosidase trên 60%, 45 môi khai triển CHCÍ3 - EtOẢc, tăng dần độ phan cực mẫu trên 7 0 % , 24 mẫu trên 8 0 % và 16 mẫu trên 90%. theo tỷ iệ từ (100:0) đến (85:5); kiềm tra các phân đoạn Tiểp tục sàng lọc in vitro tác dụng ức chế a- thu đứợc trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi phẩn glucosidase của 16 mẫu trên, ở nồng đọ 0,125 mg/mi tích CHCI3 - MeOH - Acid formic (8,5:1,5:0,5); gộp các có 6 mẫu cho kết quả phần trăm ức chế trên 80%. phân đoạn tương tự thu được 15 phân đoạn nhỏ. Bảng 3. 16 mâu ức chế a - glucosidase trên 90 % ở Trong đó phân đoạn E 15 tách được chấỉ Kết tủa nồng độ 0,25 mg/ml Fa1 (1,2 mg) và Fa2 (9,8 mg). Tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết cua Fa1 va Fa2 bằng sắc ký lỏng cao áp STT Mâu thử % ứ c chế a-Gỉucosidase (HPLC-PDA). Độ tinh khiết peak của Fa1 đạt 82,06% 1 FaLH2 90.68% ± 0.008 và Fa2 là 95>0% . 2 FaTH3 91.64% ±0.003 BÀN LUẬN 3 FaRB2 96.56% ± 0.020 So với những nghiên cứu trước đó, đề tài đã khảo 4 FaRB3 97.87% ± 0.004 sát sàng lọc, bồ sung dữ liệu về 6 ioài chưa được báo 5 FaTBD1 98.42% ± 0.006 6 FaTBD2 cáo trong các tài liệu tham khảo là Ficus benjamina, 96.32% ± 0.009 7 FheT1 Ficus elasỉica, Ficus hirta, Ficus heterophyllus & 94.19% ±0.049 8 FraL3 94.46% ± 0.001 Artocarpus interger. Đề tài cũng đã bỗ sung kết quả 9 MaRH1 97.00% ± 0.045 sàng lọc trên những bộ phận dùng chưa được nghiên 10 MaTK2 90.20% ±0.017 cứu ở loài Morus alba (rễ), Artocarpus alitis (rễ), Ficus 11 MaLB2 96.50% ± 0.045 racemosa (lá & rễ); đồng thời ỉập lại kết quả nghiên cứu 12 MaLB3 93.20% ±0.010 ờ 7 loài là Morus alba (iá), Artocarpus àlitis (íá), Ficus 13 AaR3 92.20% ± 0.006 pumela, Ficus hispida, Ficus religiosa, Ficus racemosa 14 AhT1 94.00% ± 0.031 (vỏ thân), Artocarpus heterophyllus (lá, vỏ thân) cho 15 AhT2 91.40% ±0.014 thấy các được liệu này đều cho tác dụng ức chế a- 16 AÌL3 97.94% ±0.013 glucosidase mạnh. Đã có nghiên cứu in vivo của Ahiam EI-Fishawy và cộng sự(3) cho thấy dịch chiết lá Ficus Bảng 4. 6 mẫu ức chế a - gỉucosidase trên 90 % ở auriculata (Vả) giúp giảm đường huyết thấp hơn 8,2% nồng đọ 0,25 và 0.125 mg/ml so với nhóm chứng ơ liều 500 mg/kg trùng hợp với kết quả của đề tài, mâu cao thân Và (Ficus auriculata) íhu Mầu thử % ừ c chê a-Glucosidase hái tại Bỉnh Dương cũng là mẫu cho tác dụng ức chế a- 0.25 mg/mi 0.125 mq/ml glucosidase mạnh nhất (91,95% ± 0,012). Đề tài cũng FaLH2 90.68 ±0.008 85.90 ±0.016 đã khảo sát lại điều kiện tiến hành thư nghiệm, xác định FaTBD2 96.32 ± 0.009 91.69 ±0.006 phần trăm ức chế của các mẫu thăm dò trên nhiều nồng MaLB2 96.50± 0.045 86.67 ± 0.008 độ, tim được IC50 các mẫu cao phân, đoạn góp phần MaLB3 93.20 ± 0.010 88.52 ±0.010 hình thành cơ sơ khoa học minh chứng cho cong dụng AhT2 91.40 ± 0 .0 14 91.07 ±0.007 của một số được liệu đang được dùng trong dân gian AÌL3 97.94 ± 0 .0 13 98.72 ± 0.003 với tác dụng ổn định đường huyết.
KẾT LUẬN V À KIẾN NGHỊ glucosidase inhibitors from the leaves of Aquilaria Hiện naỹ tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường íên đến sinensis’1, Phytochemistry, 72, 242-247. mức báo đọng vằ đối tượng bệnh lan rộng khắp mọi 8. Ferreres F., Paula B. Andrade và cs. , (2013), “In vùng miền, iứa tuổi. Việc phất hiện và điếu trị bệnh trề vitro studies of a-gfucosidase inhibitors and antiradical nên gây nhiều biến chứng nghỉêm trọng. Đề tài có tính constituents of Glandora diffusa (Lag.) D.c. Thomas cấp thiết trong việc tim kiêm và nghiên cứu nguồn infusion”, Food Chemistry, 136,1390-1398. dữợc liệu phòng và hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường 9. Jabeen B., Abdul Jabbar và cs., (2013), "Isolation of n o fn r iil O A ÍV IẠ A Ị D l ? / a m i r» O Ỉ O S «“ *_ n c u u ic ti b v ji I i p v u i 11 w i l l I iu V /iiio o tc fW c i/u V OI lU W iiiy U " trong bổi cảnh chưa có nghiên cứu nào thống kê và so glucosidase inhibitory activity”, Phytochemistry, 96, 443- sánh tác dụng trị đái tháo đường giữa các dược liệu 448. trên cùng một mô hình thử nghiệm. Nghiên cứu sử 10. Kim JS, Kwon c s ., Son KH, (2000), “Inhibition of a dụng các phương pháp sàng iọc in vitro trước khỉ thử - glucosidase and amylase by luteolin, a flavonoid.”, in VIVO, cho phép sàng lọc số iượng lớn mẫu thử, có Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2458-2461. khả nang lặp lại, có tinh thống kê với íhời gian thử 11. Kim S.D, (2013), “a-Glucosidase inhibitor from ngắn và chi phí không quá tốn kém. Đề ỉài mang tính Buthus martensi Karsch”, Food Chemistry, 136, 297-300. ứng dụng trong việc phat huy và hiện đại hoá việc sừ 12. Li Y., Wenyi Kang và cs„ (2012), “Antioxidant, a- dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu trong nước glucosidase inhibitory activities in vitro and ailoxan- cũng như phát triển vùng trồng dược liệu. Đề tài mở ra induced diabetic rats protective effect of Indigofera hướng nghiên cứu in vivo trên 6 mẫu cho tác đụng ức stachyodes Lindl. Root”, Journal o f Medicinal Plants chế ò-glucosidase mạnh nhất để tiến hành phân lập Research, 6(9), 1524-1531. chẩị tinh khiết theo định hướng từ kết quả sàng lọc, 13. Lordan s., R. Paul Ross và cs.,(2013), ‘The a- thừ hoạt tính, xác định cấu trúc và định iượng nhắm amylase and a-giucosidase inhibitory effects of Irish xem xét khả năng ứng dụng làm chát đánh dầu dùng seaweed extracts”, Food Chemistry, 141, 2170-2176. cho công tác kiểm nghiệm sau này. 14. Liu G., Zheng-Tao Wang và cs., (2014), TÀI ŨỆU THAM KHẢO “Diterpenoids and phenylethanoid glycosides from the 1. Bộ môn Dược Liệu (2009), Giảo trình phương pháp roots of Clerodendrum bungei and their inhibitory effects nghiên cứu dược liệu, Khoa Dược - Đại học Y Dược TP. against angiotensin converting enzym and a-giucosidase", hỉo Chí Minh. Phytochemistry. 2. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Hà Nội. 15. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB 3. Ahlam El-Fishawy1, Rawia Zayed, Sherif Afifi, Trẻ, 288. (2011), “Phytochemical and pharmacological studies of 16. Ryu H.W., Ki Hun Park và cs„ (2011), “a- Ficus auriculata Lour”, Journal o f Natural Products, 4, Glucosidase inhibition and antihyperglycemic activity of 184-195. _ prenylated xaníhones from Garcinia mangostana", 4. Chan H.-H , Tian-Shung Wua và cs., (2010), Phytochemistry, 72, 2148-2154. "Potent a-glucosidase inhibitors from the roots of Panax 17. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ, (2010), “Global japonicus c. A. Meyer var. major”, Phytochemistry, 71, estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 1360-1364. 2030”, Diabetes Res. Clin. Pract, 87(1), 4-14. 5. Chandrasekar Uma, Duraisamy Gomathi, 18. Tao.Y., Yi Wang và cs., (2012), “Rapid screening Manokaran Kalaiselvi, (2012), "In vitro Ơ- amylase and a - and identification of a-glucosidase inhibitors from mulberry glucosidase inhibitory effects of ethanolic extract of leaves using enzym-immobilized magnetic beads coupled Evoivulus alsinoides(L.y, International research journal of with HPLC/MS and NMR", Biomedical Chromatography. Pharmacy, 3(3), 226-229. 19. Wang z .w , Ling-Yi Kong và cs., (2013), “a- 6. Elya, Eva Kurnia Septiana và CS-, (2012), Glucosidase inhibitory triterpenoids from the stem barks of “Screening of a-Glucosidase Inhibitory Activity from Some Uncaria laevigata", Fitoterapia, 90, 30-37. Plants of Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and 20. Yang z., Yufeng Zhang và cs., (2012), "Bioassay- Rubiaceae”, Journal o f Biomedicine and Biotechnology, guided screening and isolation of a-glucosidase and 2012,1-6. tyrosinase inhibitors from leaves of M. alba”, Food 7. Feng J-, Xiu-Wei Yang, Ru-Feng Wang, (2011), Chemistry, 131, 617-625. “Bio-assay guided isolation and identification of a- Phụ lục 1 ■ Két quá chiẻt xuắt cao thừ nghiệm TEN KHOA HỌC KET QUA CHIÊT XUẢT (q) CHCIs EtOH h 20 Ký hìêu KL cao Ký hiệu KL cao Ký hiêu KL cao Artocarpus alitis A.a.L.1 1,84 A.a.L.2 1,83 A.a.L.3 2,96 A.a.T.1 0,4 A.a.T.2 0,54 A.a.T.3 • 1,32 A.a.R.1 0,97 A.a.R.2 0,75 A.a.R.3 2,48 Artocarpus heterophyìus A.h.L.1 1,03 A.h.L.2 1,42 A.h.L.3 4,69 A.h.T.1 0,32 A.h.T.2 0,31 A.h.T.3 0,7 A.h.R.1 0,4 A.h.R.2 0,39 A.h.R.3 1,19 Artocarpus interger A.i.L.1 1,3 A.i.L.2 2,41 A.i.L.3 5,44 A.i.T.1 0,23 A.i.T.2 0,42 A.i.T.3 1,00 Ficus auriculata F.a.Lh.1 0,61 F.a.Lh.2 0,86 F.a.Lh.3 4,43 Huế F.a.Th.1 1,54 F.a.ĩh.2 0,71 F.a.Th.3 1,56
Ficus auriculata F.a.LB.1 0,47 F.a.LB.2 0,96 F.a.LB.3 3,61 Bình Phước F.a.TB.1 0,29 F.a.TB.2 0,85 F.a.TB.3 1,11 F.a.RB.1 0,31 F.a.RB.2 1,79 F.a.RB.3 1,66 Ficus aurículata F.C.L.1 0,24 F.C.L.2 0,56 F.C.L.3 1,31 Bình Dương F.C.T.1 0,36 F.C.T.2 1,01 F.C.T.3 1,83 F.C.R.1 1,49 F.C.R.2 0,78 F.C.R.3 2,25 Ficus benjamina F.b.L.1 1,54 F.b.L.2 0,57 F.b.L.3 2,39 F.b.T.1 0,24 F.b.T.2 0,31 F.b.T.3 0,79 F.b.Rf.1 0,93 F.b.Rf.2 0,73 F.b.Rf.3 1,72 F.b.R.1 0,36 F.b.R.2 0,29 F.b.R.3 1,18 Ficus elastic F.e.L.1 1,26 F.e.L.2 1,16 F.e.L.3 4,21 F.e.Rf.1 0,78 F.e.Rf.2 0,3 F.e.Rf.3 3,27 F.e.T.1 0,72 F.e.T.2 0,67 F.e.T.3 2,38 F.e.R.1 0,87 F.e.R.2 2,8 F.e.R.3 1,89 Ficus heterophylus F.he.L.1 0,7 F.he.L.2 1,31 F.he.L.3 2,28 F.he.T.1 0,29 F.he.T.2 0,28 F.he.T.3 0,86 F.he.R.1 1,34 F.he.R.2 0,46 F.he.R.3 0,99 Ficus hispida F.hi.L.1 0,67 F.hi.L.2 0,9 F.hi.L.3 4,71 Bình Phước F.hi.T.1 0,26 F.hi.T.2 0,33 F.hi.T.3 0,68 F.hi.R.1 0,37 F.hi.R.2 0,74 F.hi.R.3 1,77 Ficus hispida F.hi.LH.1 0,81 F.hi.LH.2 0,98 F.hi.LH.3 3,78 TP. HCM F.hi.TH.1 0,17 F.hi.TH.2 0,38 F.hi.TH.3 0,62 Ficus hirta F.hir.T.1 0,28 F.hir.T.2 0,43 F.hir.T.3 1,4 F.hir.L1 0,96 F.hir.L.2 0,63 F.hir.L.3 4,23 F.hir.Tr.1 0,52 F.hir.Tr.2 0,61 F.hir.Tr.3 5,20 Ficus racemosa F.ra.L.1 1,41 F.ra.L.2 1,48 F.ra.L.3 3,63 F.ra.T.1 0,15 F.ra.T.1 0,61 F.ra.T.1 1,29 F.ra.T.1 0,23 F.ra.T.1 0,54 F.ra.T.1 1,75 Ficus regiiosa F.re.L.1 0,92 F.re.L.2 0,88 F.re.L.3 3,03 F.re.T.1 0,19 F.re.T.2 0,32 F.re.T.3 0,51 F.re.R.1 0,34 F.re.R.2 0,61 F.re.R.3 0,85 Ficus microcapa F.m.L.1 1,34 F.m.L.2 2,98 F.m.L.3 4,66 F.m.Rf.1 0,80 F.m.Rf.2 0,45 F.m.Rf.3 1,9 Ficus pumiia F.p.L.1 0,92 F.p.L.2 2,12 F.p.L.3 3,66 F.p.T.1 0,32 F.p.T.2 0,28 F.p.T.3 1,2 Morus alba M.a.LH.1 1,71 M.a.LH.2 1,45 M.a.LH.3 5,79 TP. HCM M.a.TH.1 0,35 M.a.TH.2 0,57 M.a.TH.3 1,59 M.a.RH.1 0,74 M.a.RH-2 1,74 M.a.RH.3 3,79 Morus alba M.a.LP.1 2,99 M.a.LP.2 2,81 M.a.LP.3 6,56 Phú Thọ M.a.TP.1 0,38 M.a.TP.2 0,95 M.a.TP.3 1,28 M.a.RP.1 1,04 M.a.RP.2 1,73 M.a.RP.3 4,48 Morus aịba M.a.LK.1 1,98 M.a.LK.2 1,72 M.a.LK.3 3,34 Kiên Giang M.a.TK.1 0,62 M.a.TK.2 1,04 M.a.TK.3 1,12 M.a.RK.1 1,24 M.a.RK.2 1,74 M.a.RK.3 1,8 Morus alba M.a.LL.1 1,37 M.a.LL.2 2,49 M.a.LL.3 6,87 Lâm Đồng M.a.TL.1 0,40 M.a.TL.2 1,10 M.a.TL.3 1,84 M.a.RL.1 0,77 M.a.RL.2 1,59 M.a.RL.3 2,63 Morus alba M.a.LB.1 5,03 M.a.LB.2 6,01 M.a.LB.3 6,4 Bình Định M.a.TB.1 0,28 M.a.TB.2 0,85 M.a.TB.3 1,07 M.a.RB.1 1,35 M.a.RB.2 3,24 M.a.RB.3 3,95 Phụ lục 2. Kết quả sàng lọc ỉá c dụng ức chế a-giucosidase của 180 mẫu cao chiết Mẫu % ức chế a ' Glucosidase 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,25 mq/ml 0,125 mq/ml 0,05 mq/m! 0,025 mq/ml 0,01 mq/mi AaL1 - 42,02 ± 0,007 77,33 ± 0,036 - _ - _ AaL2 70,45±0,012 88,52 ± 0,004 68,49 ±0.015 - _ . _ AaL3 - 2,38 ± 0,026 - - _ - AaT1 56,23 ±0,070 88,53 ±0,104 66,31 ± 0,062 - _ . - AaT2 98,03 ±0,101 67,83 ±0,018 81,81 ±0,012 - - - - AaT3 - - - - . - AaR1 94,18 ± 0,141 33,42 ± 0,062 46,30 ± 0,045 - - - _ AaR2 72,13 ±0,031 68,82 ± 0,023 86,65 ± 0,058 - - - -
AaR3 86,74 ± 0,030 79,12 ±0,015 92,20 ± 0,006 61,03 ±0,019 - - - ** AhL1 - 7,53 ± 0,057 58,34 ± 0,043 - - - - AhL2 78,94 ± 0,031 79,12 ±0,018 84,68 ± 0,011 - - - - AhL3 74,10 ±0,013 78,85 ±0,019 82,17 ±0,011 - - - - AhT1 17,65 ±0,133 50,36 ±0,109 94,00 ± 0,031 72,65 ± 0,009 - - - AhT2 82,17 ±0,035 72,85 ± 0,030 91,40 ±0,014 91,07 ±0,007 88,57 ±0,014 87,62 ± 0,021 85,71 ±0,019 AhT3 50^36 ± 0,036 75,00 ±0.016 84.23 ± 0.004 - - - - AhR1 - 35,30 ± 0,048 85,93 ± 0,039 - - - - AhR2 89,96 ± 0,059 64,87 ± 0,050 77,60 ±0,015 - - - - AhR3 8,60 ± 0,026 15,86 ±0,024 - - - - - AÍL1 25,27 ± 0,095 57,26 ± 0,054 59,32 ± 0,036 - - - - AÍL2 75,09 ±0,018 69,18 ±0,016 85,75 ± 0,005 - - - - AÍL3 65,23 ± 0,029 73,03 ± 0,023 97,94 ±0,013 98,72 ± 0,003 88,74 ± 0,044 89,87 ± 0,007 87,66 ± 0,009 AĨT1 24,28 ±0,071 56,45 ± 0,042 76,43 ± 0,043 - - - - AÍT2 76,43 ± 0,022 77,33 + 0,015 87,90 ± 0,009 - - - ~ AÍT3 - - - - - - - FaLH1 29,30 ±0,139 49,01 ± 0,057 63,35 ±0,019 - - - - FaLH2 94,80 ± 0,007 99,28 ± 0,004 90,68 ± 0,008 85,90 ±0,016 87,03 ± 0,004 90,39 ± 0,009 92,29 ± 0,008 FaLH3 77,69 ±0.,30 85,84 ± 0,006 82,53 ±0,026 - - - - FaTH1 - 59,53 ±0,032 25,46 ± 0,032 - - - - FaTH2 47,85 ±0,019 85,61 ± 0,006 65,68 ±0,016 - - - - FaTH3 32,35 ± 0,023 85,98 ±0,002 91,64 ±0,003 60,61 ±0,021 - - - FaLB1 - 93,36 ± 0,046 78,72± 0,048 - - - - FaLB2. 62,49 ± 0,049 87,95 ± 0,024 54,24 ±0,032 - - - - FaLB3 93,36 ± 0,011 86,35 ± 0,009 61,38 ±0,024 - - - - FaTB1 - 81,92 ±0,060 65,31 ± 0,027 - - - FaTB2 78,84 ±0,012 85,61 ±0,016 55,84 ± 0,042 - - - - FaTB3 86,10 ±0,020 73,19 ±0,017 56,70 ± 0,025 - - - ~ FaRB1 62,98 ±0,019 62,98 ± 0,020 68,02 ±0,015 - - - - FaRB2 85,73 ±0,007 79,21 ± 0,043 96,56 ± 0,020 52,11 ±0,030 - - - FaRB3 92,25 ±0,004 84,01± 0,009 97,87 ± 0,004 45,59 ± 0.06D - - - FaLBDI 59,78 ± 0,059 - - - - FaLBD2 49,08 ± 0,047 37,52 ± 0,059 60,52 ± 0,024 - - - FaLBD3 57,64 ±0,016 19,07 ±0,033 66,52 ±0,010 - FaTBDI 37,12 ±0,050 14,56 ±0,040 98,42 ± 0,006 77,90 ± 0,008 - - FaTBD2 31,88 ±0,021 10,34 ±0,034 96,32 ±0,009 91,69 ±0,006 83,12 ±0,019 86,15 ±0,015 91,95 ±0,012 FaTBD3 44,83 ± 0,029 35,23 ± 0,027 70,16 ±0,011 - - - FaRBDI 12,08 ±0,042 75,55 ± 0,075 23,87 ± 0,031 - - - FaRBD2 6,99 ± 0,024 - 5,2 ±0,031 - - FaRBD3 56,77 ± 0,011 46,87± 0,020 28,97 ±0,027 - - FbL1 _ - 72,08 ± 0,056 - - - FbL2 58,06 ±0,031 70,23 ± 0,020 50,92 ±0,019 - - - FbL3 93,24 ± 0,004 80,69 ±0,017 32,59 ± 0,055 - - - FbTl 88,68 ± 0,047 63,35 ± 0,050 43,17 ±0,026 - - - - FbT2 13,53 ±0,066 63,35 ± 0,022 55,54 ±0,019 - - - - FbT3 50,80 ± 0,025 74,42 ±0,015 75,06 ±0,014 - - - - FbR1 49,94 ± 0,069 10,82 ±0,091 77,37 ± 0,009 - - - - FbR2 14,88 ±0,068 71,22 ±0,020 73,31 ±0,019 - - - - FbR3 47,11 ±0,024 - 88,81± 0,011 - - - - FbRfl 59,04 ± 0,070 48,09 ± 0,080 89,29 ± 0,032 - - - - FbRf2 77,74 ±0,031 57,57 ± 0,020 59,90 ±0,026 - - - - FbRf3 99,75 ± 0,004 48,59 ± 0,027 53,38 ±0,019 - - - - FeL1 - - - - - - - FeL2 24,02 ± 0,022 25,62 ± 0,029 35,08 ± 0,028 - - - - FeL3 44,11 ±0,022 30,28 ± 0,026 61,28 ±0,014 - - - - FeT1 54,51 ±0,114 - 67,54 ± 0,035 - - - - FeT2 54,00 ± 0,049 3,64 ± 0,033 53,64 ±0,038 - - - - FeT3 46,58 ± 0,024 83,12 ±0,010 65,21 ±0,013 - - - - FeR1 _ 54,29 ± 0,046 70,92 ±0,012 - - - - FeR2 98,40 ± 0,005 59,10 ±0,017 36,10 ±0,022 - - - - FeR3 49,35 ± 0,029 45,56 ± 0,022 55,31 ± 0,024 - - - - FeRfl - 4,95 ± 0,060 41,34 ±0,096 - - - - FeRf2 42,50 ±0,028 44,11 ±0,024 78,46 ±0,014 - - - - -720-
FeRf3 19,94 ±0,037 43,96 ±0,020 88,65 ±0,006 ~ - ~ - FheL1 - 76,42 ± 0,072 66,38 ± 0,044 - - - - FheL2 - 77,584 ±0,013 44,250 ± 0,021 - - - - FheL3 - 75,55 ±0,018 62,27 ±0,052 - - - - FheT1 - - 94,19± 0,049 76,20 ±0,018 - - - FheT2 - 49,64 ±0,019 8,73 ± 0,022 - - - - FheT3 - 46,29 ±0,011 26,70 ±0,015 - - . - Fhe R1 16,89 + 0,052 24,75 ± 0,029 45,50 ±0,031 - - - - FheR2 89,49 ±0,033 63,31 ±0,012 41,95 ±0,023 - - - - FheR3 24,72 ± 0,039 71,92 ±0,007 74,68 ±0,010 - - - - FhiL1 89,66 ±0,091 77,43 ± 0,084 5,25 ± 0,048 - - - - FhiL2 3,70 ±0,072 41,60 + 0,026 - - - - - FhiL3 - 65,20 ± 0,005 - ~ - - - FhiT1 - 42,46 ± 0,029 - - - ~ - FhiT2 71,92 + 0,041 55,38 ±0,023 3,36± 0,040 - - - - FhiT3 85,87 ± 0,006 70,37 ±0,016 44,36 ±0,019 - - - - FhiR1 0,95 ±0,066 - 58,06 ±0,017 - - ~ ~ FhiR2 44,88 ± 0,039 70,20 ±0,029 60,89 ±0,010 - - - - FhiR3 6,460 ±0,017 78,12 ± 0,010 75,02 ±0,015 - - - - FhiLHI - 16,97 ±0,071 - - - - - FhtLH2 6,12 ±0,041 06,63 ± 0,005 - - - - - FhiLH3 89,84 ±0,010 44,36 ± 0,027 - - - - - FhiTHI 44,36 ±0,039 56,59 ± 0,024 - - - ~ - FhiTH2 82,08 ±0,013 58,66 ± 0,039 - - - - - FhiTH3 79,16 ±0,015 77,26 ±0,014 34,02 ± 0,026 - - - - FhirLI - 17,48 ±0,083 40,91 ±0,090 - - - - FhirL2 - 58,66 ±0,019 - - - - - FhirL3 66,06 ±0,018 74,68 ± 0,007 53,32 ±0,015 - - - - FhirH - 82,95 ±0,017 - - - - - FhirT2 34,20 ±0,029 64,69 ±0,010 47,63 ±0,021 ~ - - ~ FhirT3 94,66 ± 0,005 67,27 ±0,012 22,83 ±0,021 - - - FhirTrl 55,38 ±0,040 7,67 ± 0,038 38,67 ±0,012 - - - FhirTr2 60,72 ± 0,010 25,58 ±0,024 35,57 ±0,025 - - FhirTr3 46,94 ±0,018 36,95 ± 0,024 82,77 ± 0,006 - - ~ - FraH - 70,95± 0,027 - - - FraL2 54,00 ± 0,027 88,00 ± 0,005 75,54 ± 0,007 - - FraL3 54,62 ± 0,023 88,15 ±0,004 94,46 ±0,001 46,58 + 0,023 - FraT1 44,00 ± 0,065 74,92 ± 0,020 69,54 ± 0,02 - FraT2 66,46 ±0,014 98,92 ±0,009 76,92 ±0,009 - - FraT3 81,38 ±0,007 84,62 ± 0,003 63,54 ±0,011 - - FraR1 46,00 ± 0,042 22,00 ± 0,024 - - - - FraR2 75,69 ±0,011 86,15 ±0,005 58,62 ±0,018 - - - . - FraR3 74,92 ±0,010 84,62 ± 0,004 67,23 ±0,011 - - - - FreL1 - 36,31 ±0,095 64,00 ± 0,060 - - - - FreL2 25,69 ±0,031 58,77 ±0,010 78,46 ±0,011 - - - - FreL3 66,77 ±0,011 92,31± 0,001 63,23 ± 0,026 - - - - FreT1 77,23 ±0,083 74,15 ±0,036 22,46 ± 0,038 - - - - FreT2 75,08 ±0,016 80,62 ±0,016 57,38 ±0,019 - - - - FreTS 90,46 ±0,014 84,92 ±0,003 19,85 ±0,044 - - - - FreR1 80,77 + 0,075 - 54,77 ±0,035 - - - - FreR2 23,85 ±0,050 77,23 ± 0,059 54,92 ±0,036 - - - - FreR3 46,00 ± 0,020 91,23 ±0,002 73,23 ±0,010 - - - - FmL1 - - 73,54 ± 0,057 - - - - FmL2 37,54 ±0,018 93,54 ± 0,004 85,85 ±0,010 - - - - FmL3 62,46 ± 0,030 86,77 ±0,011 78,31 ±0,030 - - - - FmRfl - 58,31+0,056 54,62 ± 0,045 - - - - FmRf2 81,69 ±0,036 64,31± 0,019 57,69 ±0,016 - - - - FmRf3 98,92 ± 0,008 61,54± 0,011 48,46 ± 0,020 - - - - FpL1 - - 23,85 ± 0,023 - - - - FpL2 75,38 ±0,046 58,15 ±0,018 55,69 ±0,011 - - - - FpL3 68,15 ± 0,017 67,19 ±0,021 46,75 ± 0,030 - - - - FpT1 - 5,65 ± 0,044 38,46 ± 0,068 - - - ~ FpT2 6,25 ±0,057 67,55 ±0,016 - - - - - -721 -
FpT3 77,16 ±0,027 88,70 ± 0,005 72,84 ± 0,009 ~ - _ _ MaLH1 - 94,35 ±0,019 83,28 ±0,011 - - - - MaLH2 74,28 ±0,018 83,53 ± 0,007 49,52 ± 0,031 - - - _ MaLH3 83,17 ±0.008 69,23 ±0,012 48,68 ± 0,024 - - - - MaTH1 - - ~ - - - - MaTH2 70,79 ± 0,025 95,19 ±0,020 46,75 ± 0,025 - - - - MaTH3 21,27 ±0,026 63,94 ±0,011 53,13 ±0,018 - - - - MaRH1 - 97,36 ± 0,041 97,00 ±0,045 64,35 ±0,019 - - - MaRH2 8,05 ± 0,061 95,91 ±0,011 69,35 ± 0,009 - - - - MaRH3 29,33 ± 0,026 83,29 ± 0,003 50,12 ±0,030 - - - - MaLP1 - - 15,75 ±0,038 - - - - MaLP2 68,15 ±0,031 73,32 ± 0,028 48,80 ± 0,022 - - - - MaLP3 96,63 ± 0,022 63,82 ±0,019 57,33 ± 0,036 - - ~ MaTP1 - 2,88 ± 0,056 84,01 ± 0,031 - - - MaTP2 46,39 ± 0,040 62,74 ±0,020 75,12 ± 0,011 - - - MaTP3 46,51 ±0,015 34,38 ±0,019 55,29 ± 0,007 - - - - MaRP1 50,84 ± 0,058 56,61 ±0,028 41,35 ±0,040 - - - _ MaRP2 93,75 ± 0,022 96,51 ±0,005 60,82 + 0,018 - - - - MaRP3 86,78 ± 0,007 59,74 ±0,023 42,55 ± 0,022 - - - - MaLK1 - - 61,46 ±0,022 - - - MaLK2 - 36,42 ± 0,046 39,06 ± 0,025 - - - - MaLK3 56,13 ±0,010 55,17 ±0,029 25,00 ± 0,032 - - - MaTK1 - 60,58 ± 0,068 48,80 ± 0,026 - - - - MaTK2 - 47,62 ±0,031 90,20 ±0,017 69,68 ± 0,022 ~ - - MaTK3 32,77 ±0,032 53,22 ± 0,020 75,49 ± 0,002 - - - - MaRK1 - 32,49 ± 0,072 74,79 ±0,017 - - - - MaRK2 59,10 ±0,015 68,35 ±0,012 80,81 ± 0,021 - - - MaRK3 73,81 ±0,026 91,88 ±0,007 66,53 ±0,011 - - - - MaLL1 - - 33,55 ±0,064 - - - MaLL2 43,84 ± 0,025 69,89 ±0,011 55,32 ±0,013 - - MaLL3 75,35 ±0,018 65,83 ±0,014 61,9010,010 - - - - M a in - 63,45 ± 0,047 - - - MaTL2 25,07 ±0,018 77,59 ± 0,024 88,24 ± 0,020 - - MaTL3 21,85 ±0,027 50,70 ± 0,026 71,85 ±0,003 - - MaRH 78,43 ± 0,041 44,40± 0,050 - MaRL2 39,50 ± 0,038 92,86 ±0,007 64,43 ±0,016 - - MaRL3 43,28 ±0,018 9,38 ±0,027 32,35 ±0,019 - MaLB1 73,95 ±0,073 59,90 ±0,017 - - MaLB2 82,91 ±0,021 23,11 ±0,039 96,50 ± 0,045 86,67 ± 0,008 71,52 ±0,028 82,25 ±0,019 82,86 ±0,019 MaLB3 52,66 ±0,016 31,65 ±0,028 93,20 ±0,010 88,52 ±0,010 64,94 ± 0,027 73,77 ±0,019 62,16±0,018 MaTB1 1,40 ±0,050 59,52 ±0,100 81,09 ±0,015 - - MaTB2 16,67 ±0,035 41,74 ±0,025 75,77 ±0,026 - - . MaTB3 28,29 ± 0,024 40,06 + 0,015 46,64 ±0,010 - - MaRB1 - 87,39 ± 0,097 11,48 ±0,077 - - - MaRB2 65,55 ± 0,026 90,76 ± 0,005 69,05 ±0,019 - . MaRB3 82,49 ± 0,008 72,27 ± 0,005 34,31 ±0,018 - - -722-